无宿主背景干扰的植物内生真菌全长ITS基因扩增方法与流程

无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法
技术领域
1.本发明涉及基因扩增技术领域，尤其涉及一种无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法。


背景技术：

2.植物真菌性病害约占到病害种类的80％以上，植物被真菌侵染所造成的病害相当严重。真菌可通过根际土壤或风雨条件下的孢子由表皮侵入寄主，也会通过伤口等侵入，致病真菌残留于病残体、种子、土壤等越冬，遇适宜条件便可危害寄主。
3.传统的真菌性病害的检测方法主要包括洗涤镜检、保湿培养、致病性测定和pcr检测等方法。这些方法虽然可对病原微生物进行定性检测，但受到技术自身的限制，传统方法并不能一次性检测出复杂样本中所有病原微生物。因此，为了进行病原微生物的早期预防和全面筛查，植物内生微生物高通量测序技术近几年被广泛应用在植物病害检测等领域，其具有快速、可靠、分辨率高、重复性好等优点，这对于植物病害的研究提供了可重复的定量研究方法。通过高通量测序的方法，我们可对植物内生真菌(含致病真菌)的相互作用进行全面的研究。植物内生真菌是植物微生态系统中的重要组成部分，在长期协同进化过程中其与植物形成了相互依存等的关系，其产生的活性物质在植物抗病等产领域有着巨大的应用前景。
4.但是由于真核生物its基因的高度同源性，即使采用高通量测序进行相关研究也会因为植物宿主本身基因组的干扰，造成植物内生真菌的研究处在基础研究水平。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法，旨在解决采用高通量测序进行相关研究时会被植物宿主本身基因组干扰的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法，包括以下步骤：
7.对植物根样本进行预处理，得到预处理样本；
8.提取所述预处理样本的总dna，得到样本总dna；
9.对所述样本总dna进行its基因的全长乳液pcr扩增，得到水相反应产物；
10.以所述水相反应产物为模板进行its基因高变区/保守区扩增子扩增，得到扩增子；
11.对所述扩增子进行高通量测序及生物信息分析。
12.其中，所述对植物根样本进行预处理，得到预处理样本，包括：
13.对植物根样本0.5-1g经超声清洗后在超净台中使用有效氯浓度5％的次氯酸钠溶液浸泡消毒1分钟，使用无菌水冲洗一遍后使用体积百分比为70％-75％的乙醇溶液浸泡30秒，随后使用无菌水冲洗3-5遍，得到预处理样本。
14.其中，所述提取所述预处理样本的总dna，得到样本总dna，包括：
15.将所述预处理样本经液氮研磨均匀后转至1.5ml离心管，通过ctab法纯化样本总dna，得到样本总dna。
16.其中，所述对所述样本总dna进行its基因的全长乳液pcr扩增，得到水相反应产物，包括：
17.以真菌和所述样本总dna的its基因为模板设计两对引物，得到nsnl引物和its3/its4引物；
18.使用所述nsnl引物、乳液发生剂和pcr扩增缓冲液一配置乳液pcr混合液；
19.将所述乳液pcr混合液移入0.2ml pcr管中并置于带有热盖功能的pcr仪中，在所述pcr仪上运行以下反应循环：95℃1min，1个循环；98℃5s，68-70℃1min，52℃30s，68℃1min，25个循环；68℃5min，1个循环；25℃恒温，得到第一反应产物；
20.向所述第一反应产物中添加10％体积的2-丁醇，震荡混匀后以13200
×
g离心5分钟，得到水相反应产物。
21.其中，所述以所述水相反应产物为模板进行its基因高变区/保守区扩增子扩增，得到扩增子，包括：
22.以所述水相反应产物为模板，使用所述its1/its4引物在pcr扩增缓冲液二中，在95℃1min，1个循环；98℃5s，55℃30s，68-72℃30s，20个循环；68-72℃5min，1个循环；25℃恒温的pcr循环条件下完成，得到扩增子。
23.其中，所述对所述扩增子进行高通量测序及生物信息分析，包括：
24.对所述扩增子进行纯化回收，得到回收检测数据；
25.基于所述回收检测数据集构建扩增子测序文库；
26.基于所述扩增子测序文库进行nanopore gridion测序，得到测序数据；
27.对所述测序数据进行生物信息分析，得到分析结果。
28.其中，所述对所述扩增子进行纯化回收，得到回收检测数据，包括：
29.将所述扩增子用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，使用qiaquick凝胶回收试剂盒切胶回收片段大小在800-1000bp左右的目标条带，te缓冲液洗脱回收目标dna片段；使用2％琼脂糖电泳检测，检测条件5v/cm，20min，得到回收检测数据。
30.其中，所述乳液发生剂由含有4.5％span 80、0.4％吐温80和0.05％triton x-100的矿物油构成。
31.其中，所述pcr扩增缓冲液一由40mm tris-hcl ph8.0、40mm kcl、3mm mgcl2、5％甘油、1％吐温20、1mm dntps、1个单位的kod dna聚合酶、10μm nsnl-f、10μm nsnl-r和50ng的样本总dna构成。
32.其中，所述pcr扩增缓冲液二由40mm tris-hcl ph8.0、40mm kcl、3mm mgcl 2.5％甘油、1％吐温20、1mm dntps、1个单位的kod dna聚合酶、10μm its3l-f、10μm its4l-r和1μl的所述扩增子。
33.本发明的一种无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法，通过对植物根样本进行预处理，得到预处理样本；提取所述预处理样本的总dna，得到样本总dna；对所述样本总dna进行its基因的全长乳液pcr扩增，得到水相反应产物；以所述水相反应产物为模板进行its基因高变区/保守区扩增子扩增，得到扩增子；采用植物内生真菌测序技术对所述扩增子进行高通量测序及生物信息分析，本发明采用的植物内生真菌测序技术最大
程度降低了植物基因组的污染，对于植物内生真菌的研究带来了其他常规方法不能达到的精度和准确度，解决了采用高通量测序进行相关研究时会被植物宿主本身基因组干扰的问题。
附图说明
34.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
35.图1是本发明提供的一种无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法的流程图。
36.图2是对所述样本总dna进行its基因的全长乳液pcr扩增，得到水相反应产物的流程图。
37.图3是对所述扩增子进行高通量测序及生物信息分析的流程图。
具体实施方式
38.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
39.请参阅图1至图3，本发明提供一种无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法，包括以下步骤：
40.s1对植物根样本进行预处理，得到预处理样本；
41.具体的，对植物根样本0.5-1g经超声清洗后在超净台中使用有效氯浓度5％的次氯酸钠溶液浸泡消毒1分钟，使用无菌水冲洗一遍后使用体积百分比为70％-75％的乙醇溶液浸泡30秒，随后使用无菌水冲洗3-5遍，得到预处理样本。
42.s2提取所述预处理样本的总dna，得到样本总dna；
43.具体的，将所述预处理样本经液氮研磨均匀后转至1.5ml离心管，通过ctab法纯化样本总dna，得到样本总dna。
44.s3对所述样本总dna进行its基因的全长乳液pcr扩增，得到水相反应产物；
45.具体方式为：
46.s31以真菌和所述样本总dna的its基因为模板设计两对引物，得到nsnl引物和its3/its4引物；
47.具体的，其中nsnl引物红色标记碱基为锁核酸修饰基团，用于抑制植物基因组来源的污染，its3/its4引物用于植物its基因的扩增。
48.s32使用所述nsnl引物、乳液发生剂和pcr扩增缓冲液一配置乳液pcr混合液；
49.具体的，所述乳液发生剂由含有4.5％span 80、0.4％吐温80和0.05％triton x-100的矿物油构成。所述pcr扩增缓冲液一由40mm tris-hcl ph8.0、40mm kcl、3mm mgcl2、5％甘油、1％吐温20、1mm dntps、1个单位的kod dna聚合酶、10μm nsnl-f、10μm nsnl-r和50ng的样本总dna构成。所述tritonx-100纯度为色谱纯。
50.s33将所述乳液pcr混合液移入0.2ml pcr管中并置于带有热盖功能的pcr仪中，在所述pcr仪上运行以下反应循环：95℃1min，1个循环；98℃5s，68-70℃1min，52℃30s，68℃1min，25个循环；68℃5min，1个循环；25℃恒温，得到第一反应产物；
51.s34向所述第一反应产物中添加10％体积的2-丁醇，震荡混匀后以13200
×
g离心5分钟，得到水相反应产物。
52.s4以所述水相反应产物为模板进行its基因高变区/保守区扩增子扩增，得到扩增子；
53.具体的，以所述水相反应产物为模板，使用所述its1/its4引物在pcr扩增缓冲液二中，在95℃1min，1个循环；98℃5s，55℃30s，68-72℃30s，20个循环；68-72℃5min，1个循环；25℃恒温的pcr循环条件下完成，得到扩增子。
54.所述pcr扩增缓冲液二由40mm tris-hcl ph8.0、40mm kcl、3mm mgcl2.5％甘油、1％吐温20、1mm dntps、1个单位的kod dna聚合酶、10μm its3l-f、10μm its4l-r和1μl的所述扩增子。
55.s5对所述扩增子进行高通量测序及生物信息分析。
56.具体方式为：
57.s51对所述扩增子进行纯化回收，得到回收检测数据；
58.具体的，将所述扩增子用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，使用qiaquick凝胶回收试剂盒切胶回收片段大小在800-1000bp左右的目标条带，te缓冲液洗脱回收目标dna片段；使用2％琼脂糖电泳检测，检测条件5v/cm，20min，得到回收检测数据。
59.s52基于所述回收检测数据集构建扩增子测序文库；
60.具体的，文库构建使用genomic-dna-by-ligation kit(lsk110)。
61.s53基于所述扩增子测序文库进行nanopore gridion测序，得到测序数据；
62.具体的，测序平台为nanopore gridion，测序模式为r9.4.1模式。
63.s54对所述测序数据进行生物信息分析，得到分析结果。
64.具体的，测序下机数据为fast5格式，使用guppy软件将fast5文件中记录的电信号数据转为fastq格式记录的序列和质量信息。
65.具体方式为：
66.s541根据barcode区分样品；
67.s542使用uchime去除嵌合体；
68.s543对每一条序列进行物种注释，并统计物种数目构建otu表；
69.s544挑选出otu的代表性序列；
70.s545使用unite数据库进行物种分类信息的划分。
71.本发明提供的一种无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法，采用ctab法纯化植物下胚轴总dna，按照前述方法进行材料预处理，随后按照本发明的方法进行植物内生真菌its基因片段的扩增(gsp)。同时以加入nsp-f(5'-gattgaatgatccggtgaag-3')和nlp-r(5'-gctgtcaccctctcaggc-3')引物的样本(pc)做阳性对照(该对照扩增结果为植物its基因)，以只使用its1-f/its4-r(未对its1l-f/its4l-r引物进行锁核酸修饰)引物对进行its片段扩增结果为阴性对照(pr)。扩增完毕后采用1％琼脂糖凝胶电泳对结果进行分离，随后将靶标pcr产物纯化回收后采用前述方法进行its高变区二次扩增后建库测序。
测序结果如图1所示，阳性对照因为受到植物同源基因的污染，测序结果95％以上均为非目的片段，而本发明排除了植物基因组带来的污染，还原植物内生真菌的真实群落结构。
72.有益效果是：
73.1、本发明采用高通量测序技术进行植物内生真菌的测序分析，相较于传统的dgge等方法数据量更大，检测结果更完整；
74.2、本发明采用的植物内生真菌测序技术最大程度降低了植物基因组的污染，对于植物内生真菌的研究带来了其他常规方法不能达到的精度和准确度；
75.3、本发明采用的植物内生真菌测序技术相较于目前采用its3-f/its4-r扩增子测序方法进行的测序，结果显示本发明的结果多样性更高，没有植物基因污染。
76.序列表如下：
77.sequence listing
78.《110》申请人
79.《120》一种用于高通量测序的无宿主背景干扰的植物内生真菌its基因扩增方法
80.《130》2017
81.《160》4
82.《170》patentin version 3.3
83.《210》1
84.《211》20
85.《212》dna
86.《213》人工序列
87.《400》1
88.gattgaatgg cttagtgagg 20
89.《210》2
90.《211》20
91.《212》dna
92.《213》人工序列
93.《400》2
94.ggattctcac cctctatgac 20
95.《210》3
96.《211》18
97.《212》dna
98.《213》人工序列
99.《400》3
100.tccgtaggtg aacctgcgg 18
101.《210》4
102.《211》20
103.《212》dna
104.《213》人工序列
105.《400》4
106.tcctccgctt attgatatgc 20
107.以上所揭露的仅为本发明一种无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。

技术特征：
1.一种无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：对植物根样本进行预处理，得到预处理样本；提取所述预处理样本的总dna，得到样本总dna；对所述样本总dna进行its基因的全长乳液pcr扩增，得到水相反应产物；以所述水相反应产物为模板进行its基因高变区/保守区扩增子扩增，得到扩增子；对所述扩增子进行高通量测序及生物信息分析。2.如权利要求1所述的无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法，其特征在于，所述对植物根样本进行预处理，得到预处理样本，包括：对植物根样本0.5-1g经超声清洗后在超净台中使用有效氯浓度5％的次氯酸钠溶液浸泡消毒1分钟，使用无菌水冲洗一遍后使用体积百分比为70％-75％的乙醇溶液浸泡30秒，随后使用无菌水冲洗3-5遍，得到预处理样本。3.如权利要求2所述的无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法，其特征在于，所述提取所述预处理样本的总dna，得到样本总dna，包括：将所述预处理样本经液氮研磨均匀后转至1.5ml离心管，通过ctab法纯化样本总dna，得到样本总dna。4.如权利要求3所述的无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法，其特征在于，所述对所述样本总dna进行its基因的全长乳液pcr扩增，得到水相反应产物，包括：以真菌和所述样本总dna的its基因为模板设计两对引物，得到nsnl引物和its3/its4引物；使用所述nsnl引物、乳液发生剂和pcr扩增缓冲液一配置乳液pcr混合液；将所述乳液pcr混合液移入0.2mlpcr管中并置于带有热盖功能的pcr仪中，在所述pcr仪上运行以下反应循环：95℃1min，1个循环；98℃5s，68-70℃1min，52℃30s，68℃1min，25个循环；68℃5min，1个循环；25℃恒温，得到第一反应产物；向所述第一反应产物中添加10％体积的2-丁醇，震荡混匀后以13200
×
g离心5分钟，得到水相反应产物。5.如权利要求4所述的无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法，其特征在于，所述以所述水相反应产物为模板进行its基因高变区/保守区扩增子扩增，得到扩增子，包括：以所述水相反应产物为模板，使用所述its1/its4引物在pcr扩增缓冲液二中，在95℃1min，1个循环；98℃5s，55℃30s，68-72℃30s，20个循环；68-72℃5min，1个循环；25℃恒温的pcr循环条件下完成，得到扩增子。6.如权利要求5所述的无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法，其特征在于，所述对所述扩增子进行高通量测序及生物信息分析，包括：
对所述扩增子进行纯化回收，得到回收检测数据；基于所述回收检测数据集构建扩增子测序文库；基于所述扩增子测序文库进行nanoporegridion测序，得到测序数据；对所述测序数据进行生物信息分析，得到分析结果。7.如权利要求6所述的无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法，其特征在于，所述对所述扩增子进行纯化回收，得到回收检测数据，包括：将所述扩增子用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，使用qiaquick凝胶回收试剂盒切胶回收片段大小在800-1000bp左右的目标条带，te缓冲液洗脱回收目标dna片段；使用2％琼脂糖电泳检测，检测条件5v/cm，20min，得到回收检测数据。8.如权利要求7所述的无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法，其特征在于，所述乳液发生剂由含有4.5％span80、0.4％吐温80和0.05％tritonx-100的矿物油构成。9.如权利要求8所述的无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法，其特征在于，所述pcr扩增缓冲液一由40mmtris-hclph8.0、40mmkcl、3mmmgcl2、5％甘油、1％吐温20、1mmdntps、1个单位的koddna聚合酶、10μmnsnl-f、10μmnsnl-r和50ng的样本总dna构成。10.如权利要求9所述的无宿主背景干扰的植物内生真菌全长its基因扩增方法，其特征在于，所述pcr扩增缓冲液二由40mmtris-hclph8.0、40mmkcl、3mmmgcl2.5％甘油、1％吐温20、1mmdntps、1个单位的koddna聚合酶、10μmits3l-f、10μmits4l-r和1μl的所述扩增子。

技术总结
本发明涉及基因扩增技术领域，具体涉及一种无宿主背景干扰的植物内生真菌全长ITS基因扩增方法，包括对植物根样本进行预处理，得到预处理样本；提取预处理样本的总DNA，得到样本总DNA；对样本总DNA进行ITS基因的全长乳液PCR扩增，得到水相反应产物；以水相反应产物为模板进行ITS基因高变区/保守区扩增子扩增，得到扩增子；采用植物内生真菌测序技术对扩增子进行高通量测序及生物信息分析，本发明采用的植物内生真菌测序技术最大程度降低了植物基因组的污染，对于植物内生真菌的研究带来了其他常规方法不能达到的精度和准确度，解决了采用高通量测序进行相关研究时会被植物宿主本身基因组干扰的问题。基因组干扰的问题。基因组干扰的问题。


技术研发人员：丁泽琴 侯寓森 涂波 舒潘寅 孙梓健
受保护的技术使用者：成都罗宁生物科技有限公司
技术研发日：2022.12.01
技术公布日：2023/8/24