无效应子功能Fc分子的制作方法

无效应子功能fc分子


背景技术：

1.单克隆抗体以及fc融合蛋白是非常有前途的生物药剂，并且这些化合物的市场近年来已经显著增加。这些分子成功的原因是与小型化合物相比，它们在循环中的高特异性、安全性和长半衰期。直到2017年，已经批准了多于10种fc融合蛋白，并且正在审查更多的fc融合蛋白。抗体由两种不同的蛋白质链(轻链(lc)和重链(hc))构成。一条lc与一条hc共价连接，而hc在其各部分上通过二硫键共价连接。lc由可变结构域(vl)和恒定结构域(cl)构成，而hc由可变结构域(vh)和几个恒定结构域(例如，igg的ch1、ch2和ch3结构域)组成。从功能上来说，抗体可以分为两个fab(抗原结合片段)区和一个fc(可结晶片段)区。每个fab区由四个结构域组成：vl、cl、vh和ch1。fc区包含剩余的恒定结构域(igg的ch2和ch3结构域)。fab区经由称为铰链区的柔性序列连接到fc区。此铰链区包含连接hc的二硫键。
2.抗体是多功能蛋白。虽然抗原通过fab区结合，但是抗体的效应子功能是由fc区介导的。抗体的效应子功能包括抗体依赖性细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬(adcp)和抗体依赖性补体沉积(adcd)。这些作用分别是经由抗体fc区与fcγ受体(fcγr)和补体蛋白c1q的结合介导的。这些抗体效应子功能对于天然抗体以及一些工程化治疗性抗体例如在肿瘤学中的功效很重要。在另一方面，对于许多其他工程化治疗性抗体，例如针对可溶性靶标(如促炎性细胞因子)的抗体，效应子功能是不期望的。此类抗体通常被设计为主要或仅通过经由fab片段的结合来阻断其特定靶标而起作用，而fc区的任何效应子功能引起干扰和潜在有害的免疫反应，在极端情况下引起如对于抗cd28抗体tgn1412所观察到的“细胞因子风暴”。
3.在另一方面，fc区经由通过新生儿fc受体(fcrn)介导的“再循环”机制显著延长循环中的抗体和fc融合蛋白的半衰期。此外，fc区有助于分子的整体稳定性，并且fc结构域的另一个重要且期望的功能是其与蛋白a的强且特异性结合。抗体和fc融合蛋白与固定化蛋白a的结合通常是抗体和fc融合蛋白纯化期间的第一个纯化步骤。因此，从抗体分子中简单去除fc区将具有严重的缺点。
4.因此，已经开发了几种变体fc区以降低抗体效应子功能，同时维持fc区的积极作用(半衰期延长、蛋白a结合、稳定)。这些方法包括去糖基化变体和具有点突变的变体(wang等人,protein cell.2018；9(1):63-73)。然而，许多点突变变体至少保留了一些抗体效应子功能，而去糖基化变体则展现出降低的溶解度或稳定性(dumet等人,mabs.2019；11(8):1341-1350)。消除抗体效应子功能的另一种尝试是修饰或缺失铰链区，所述铰链区促成fcγr和c1q与fc的结合(vidarsson等人,front immunol.2014；5:520)。研究表明，这种“无铰链”抗体几乎不显示fcγr介导的效应子功能(valeich等人,antibodies(basel).2020dec；9(4):50)。然而，这些构建体具有降低的稳定性并且与fcrn的受损的结合，这将导致更短的体内半衰期。
5.因此，仍然需要这样的抗体或fc融合蛋白，其不具有抗体效应子功能，但是维持高稳定性、未受损的fcrn结合和蛋白a结合。本发明通过提供这样一种fc区来解决这一需求，所述fc区缺乏功能性铰链区，但是包含位于fc部分c末端的至少两个共价键，以及在ch2结
构域中的另外的内部二硫键。


技术实现要素：

6.在第一方面，本发明提供了一种分子，所述分子包含两个多肽，其中所述多肽形成抗体fc区，
7.其中所述两个多肽通过至少两个共价键连接，所述至少两个共价键位于每个多肽的形成所述fc区的部分的c末端，
8.其中所述两个多肽不通过位于每个多肽的形成所述fc区的部分的n末端的二硫键连接，其中每个多肽包含作为所述fc区的一部分的ch2结构域，其中这些ch2结构域中的每一个均包含不存在于相应野生型ch2结构域中的另外的内部二硫键，
9.其中所述另外的内部二硫键选自在根据eu编号的以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与d265c；p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。
10.在一些实施方案中，所述另外的内部二硫键选自在根据eu编号的以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。
11.在一些实施方案中，所述另外的内部二硫键选自在根据eu编号的以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与l328c；以及s267c与a327c。
12.在一些实施方案中，所述两个共价键是两个二硫键。
13.在一些实施方案中，位于每个多肽的形成所述fc区的部分的c末端的所述至少两个共价键包含在对应于抗体铰链区的氨基酸序列的序列中。
14.在一些实施方案中，与包含位于每个多肽的形成所述fc区的部分的n末端的抗体铰链区的相同分子相比，对c1q和/或fcγr1、fcγr2和/或fcγr3的亲和力降低至少10倍。
15.在一些实施方案中，与包含位于每个多肽的形成所述fc区的部分的n末端的抗体铰链区的相同分子相比，对蛋白a和/或fcgrn的亲和力没有降低。
16.在一些实施方案中，所述fc区是igg、igm、iga、igd或ige的fc区。
17.在一些实施方案中，所述至少两个共价键位于每个多肽上的ch3或ch4结构域的c末端。
18.在一些实施方案中，所述fc区是igg抗体的fc区。
19.在一些实施方案中，所述至少两个共价键位于每个多肽上的ch3结构域的c末端。
20.在一些实施方案中，所述分子进一步包含至少一个活性部分。
21.在一些实施方案中，所述活性部分位于至少一个多肽的ch2结构域的n末端，并且所述分子不包含位于所述至少两个共价键的c末端的活性部分，所述至少两个共价键位于每个多肽的形成所述fc区的部分的c末端。
22.在一些实施方案中，所述活性部分是抗原结合部分。
23.在第二方面，本发明提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据第一方面的任一实施方案的分子。
24.本发明提供了这样的分子，其不显示fc的潜在有害的抗体效应子功能(adcc、adcp、adcd)，但是维持所有所需的fc功能：经由fcrn结合实现的高血清半衰期、经由蛋白a结合实现的易于纯化和高分子稳定性。
25.本发明分子的这些有利特性是由于以下特征的组合：缺乏功能性抗体铰链区，这
73)。mab03具有igg2 fc骨架，其与igg1相比具有降低的效应子功能。mab04具有igg1 fc骨架，其具有已知e269r和k322a突变。mab05具有igg1 fc骨架，其具有lala(l234a/l235a)突变和另外的已知p329a突变。mab06是根据本发明的fc igg1(标记为“颠倒的”)，其铰链区序列转移到c末端并且在ch1结构域与ch2结构域之间没有接头序列。mab07是根据本发明的fc igg1(标记为“颠倒的”)，其进一步包含在ch1结构域与ch2结构域之间的19gs接头。
36.图3.根据图2的纯化的抗体变体在非还原和还原条件下的sds-page。m：蛋白标记物。
37.图4.不同抗体的分析型尺寸排阻色谱和计算分子量。(a)相对于经过的时间对瑞利比(作为散射光强度的量度)的相对信号强度绘图。(b)峰的近视图。指示了在主峰级分内的蛋白质的计算分子量。mab06是标记的“ud-igg1”；mab07是标记的“ud-igg1(19gs)”。
38.图5.如通过spr测定的tnfα与不同抗体的结合。将抗体固定在芯片上，并且将人tnfα用作分析物。指示了相应的抗体变体。mab06是标记的“ud-igg1”；mab07是标记的“ud-igg1(19gs)”。
39.图6.不同抗体对不同fcr的spr亲和力测量结果。对于相互作用分析，将fcr固定在传感器芯片上。传感图示出了不同浓度下不同抗体的结合谱。mab06是标记的“ud-igg1”；mab07是标记的“ud-igg1(19gs)”。
40.图7.效应子功能：adcc。(a)测定的测定原理示意图。在结合膜驻留(membrane-standing)抗原后，效应细胞在fcγriii激活后被激活。效应细胞的激活导致靶细胞的细胞裂解。用以下获得的adcc测定结果：(b)igg1 wt、igg1 lala n297a(去糖基化)和igg1 lala p329a变体。(c)igg1 wt、igg1 e269r,k322a和igg2。(d)igg1 wt、根据本发明的fc igg1(“ud-igg1”)、根据本发明的包含19gs接头的fc igg1(“ud-igg1(19gs)”)。以特异性裂解％给出活性(参见实施例部分中的“方法”)。
41.图8.效应子功能：adcd。(a)测定的测定原理示意图。抗原-抗体复合物(免疫复合物)的形成导致补体系统的募集。结果是杀伤靶细胞的膜攻击复合物的组装。(b)igg1 wt、igg1 lala n297a(去糖基化)和igg1 lala p329a变体。(c)igg1 wt、igg1e269r,k322a和igg2。(d)igg1 wt、根据本发明的fc igg1(“ud-igg1”)、根据本发明的包含19gs接头的fc igg1(“ud-igg1(19gs)”)。以特异性裂解％给出活性(参见材料和方法)。
42.图9.不同glp1-ra-fc融合蛋白的概述。所有融合蛋白均含有与fc结构域相同的glp1序列和接头序列。注意，glp1-fc01和glp1-fc04含有igg4衍生的fc结构域。此fc变体含有用于降低效应子功能的已知f234a和l235a突变，以及用于避免半抗体形成的已知s228p突变。所有igg1-fc变体均含有用于降低效应子功能的lala(l234a/l235a)突变。为了清楚起见，图中没有描绘这些突变。根据本发明的fc变体(glp-fc04-glp-fc014)被标记为“颠倒的”。
43.图10.根据图9的纯化的glp1-ra-fc融合蛋白变体在非还原条件(a)和还原条件(b)下的sds-page。m：蛋白标记物。
44.图11.不同glp1-ra fc融合蛋白的分析型尺寸排阻色谱和计算分子量。为了清楚起见，在一个图中仅示出了七个数据集。(a、b)相对于经过的时间对瑞利比的相对信号强度绘图。(c、d)峰的近视图。指示了在主峰级分内的蛋白质的计算分子量。
45.图12.如用nanodsf测定的glp1-ra fc融合蛋白的稳定性。为了清楚起见，在一个
图中示出了最多四个变体。(a)变体glp1-fc01-glp1-fc04、(b)glp1-fc05-glp1-fc08、(c)glp1-fc09-glp1-fc12、以及(d)glp1-fc13和glp1-14。所有测量一式两份地进行。曲线表示平均值数据，并且标准差指示为阴影。在330nm和350nm处测量每个样品中的荧光强度。在每个上部小图中，相对于温度对在350nm/330nm处的荧光强度比率绘图。350nm/330nm比率是在蛋白质解折叠时诱导的色氨酸残基的光谱移位的量度。在下部小图中，示出了熔解曲线的一阶导数。使用一阶导数的最大值来计算作为蛋白质稳定性量度的拐点(ip)。
46.图13.glp1-fc01和glp1-fc04的药效学特征。每四天将雌性db/db小鼠或瘦型对照用10nmol/kg glp1-fc01或glp1-fc03相比于媒介物(pbs)或对照皮下处理14天。在整个研究过程中分析了体重发展(a)和餐后血糖水平(b)，显示为相对于基线(第1天)的葡萄糖变化。通过箭头指示皮下化合物施用的时间点。数据为平均值
±
sem，n＝8只/组。
具体实施方式
47.本发明提供了包含两个多肽的分子，其中所述多肽形成抗体fc区，其中所述两个多肽通过至少两个共价键连接，所述至少两个共价键位于每个多肽的形成所述fc区的部分的c末端，其中所述两个多肽不通过位于每个多肽的形成所述fc区的部分的n末端的二硫键连接，其中每个多肽包含作为所述fc区的一部分的ch2结构域，其中这些ch2结构域中的每一个包含不存在于相应野生型ch2结构域中的另外的内部二硫键，其中所述另外的内部二硫键选自在根据eu编号的以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与d265c；p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。
48.本发明的分子设计允许这样的分子，其能够不引发fc介导的抗体效应子功能(adcc、adcp、adcd)，但是维持所述fc区的所需功能：fcrn结合、蛋白a结合和稳定。本发明基于以下发现：负责抗体效应子功能的fcγr和c1q的结合位点部分位于抗体铰链区，而fcrn和蛋白a的结合位点位于fc区的更c末端部分(图1)。因此，铰链区的去除消除了抗体效应子功能，而不损害所需的fc功能。此外，在本发明的分子的ch2结构域中的两个c末端共价键和另外的内部二硫键克服了对于普通无铰链抗体变体所观察到的限制(受损的fcrn结合、降低的稳定性)(valeich等人,antibodies(basel).2020年12月；9(4):50)。
49.定义
50.在下文详细描述本发明之前，应理解，本发明并不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以改变。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由随附权利要求限定。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
51.贯穿本说明书的正文引用了若干文献。将本文无论在上文还是在下文引用的每个文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指导等)都通过引用以其整体特此并入。
52.除非上下文另有明确规定，否则如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。
53.抗体位置：除非另外指示，否则根据eu编号指定抗体分子或抗体分子片段中氨基酸的位置。
54.如本文所用，“分子”是通过共价相互作用和/或通过非共价相互作用(例如疏水或
静电相互作用)而保持在一起的一组原子。在一个实施方案中，分子的所有原子通过共价相互作用连接。
55.在一些实施方案中，所述分子是抗体。在一些实施方案中，所述分子是多特异性抗体。在一些实施方案中，所述分子是fc融合蛋白。在一些实施方案中，本发明的分子是包含fc区和活性部分的fc融合蛋白。
56.如本文所用，“多肽”是通过肽键共价连接的10个或更多个氨基酸的链。因此，术语“多肽”可以代表多链蛋白的链，与此链的长度无关。在一些实施方案中，多肽是多链蛋白的链。
57.如本文所用，“fc区”是由两个多肽的几个恒定重链(ch)免疫球蛋白结构域形成的免疫球蛋白分子的片段。在天然抗体中，fc区介导与fc受体和补体系统组分的结合。对于天然igg、iga和igd，fc区由两条重链的ch2和ch3结构域形成。对于天然igm和ige，fc区由两条重链的ch2、ch3和ch4结构域形成。本发明的fc区可以由与天然抗体的fc区相同的ch结构域(即ch2和ch3结构域或ch2、ch3和ch4结构域)形成。本发明的fc区包含ch结构域，所述ch结构域与天然免疫球蛋白的ch结构域相同，或者例如通过插入一个或几个点突变而衍生自天然免疫球蛋白的ch结构域。
58.如本文所用，“铰链区”是位于fc区与fab区之间的抗体序列的一部分。它提供区段柔性，并且可以稳定抗体分子。铰链区可以基于结构数据被清楚地定义，例如igg1铰链区包含残基221-237(r.nezlin,“the immunoglobulins”,academic press,1998,第23-26页)。在igg抗体中，铰链区包含连接抗体的两条重链的二硫键。igg1和igg4包含2个此类二硫键，而igg2包含4个此类二硫键，并且igg3包含11个此类二硫键(liu和may,2012mabs.2012年1月-2月；4(1):17-23)。
59.在本发明的分子中，如果一个区域位于fc区域的n末端，则将所述区域仅指定为“铰链区”，就像所有天然抗体的情况一样。如果将与铰链区相同或高度相似的氨基酸序列置于fc区的c末端(如在本发明的分子的一些实施方案中)，则将其指定为“对应于(抗体)铰链区的氨基酸序列的序列”。高度相似意指与抗体铰链区序列至少70％同一性和/或包含抗体铰链区序列的至少7个连续氨基酸。
60.如本文所用，“共价键”是涉及在原子之间共享电子对的化学键。共价键不同于非共价相互作用，如静电相互作用或疏水作用。
61.共价键(例如二硫键)“位于fc区的c末端”的指示意指，在形成所述fc区的两个多肽上，参与形成所述共价键的氨基酸残基(例如半胱氨酸残基)位于所述多肽的形成所述fc区的部分的c末端。
62.没有共价键(例如二硫键)“位于fc区的n末端”的指示意指，在形成所述fc区的两个多肽上，参与形成这种共价键的氨基酸残基(例如半胱氨酸残基)不位于所述多肽的形成所述fc区的部分的n末端。
63.如本文所用，“内部二硫键”是由一个免疫球蛋白结构域(例如ch结构域)内的两个半胱氨酸残基形成的二硫键。这意味着内部二硫键始终是链内二硫键，而不是连接不同多肽链的链间二硫键。“不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键”也称为“另外的内部二硫键”是不存在于天然ch2结构域(即天然igg、igm、iga、igd或ige ch2结构域，由此衍生出本发明的经修饰的ch2)中的内部二硫键。
64.在一些实施方案中，所述内部二硫键选自在以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与d265c；p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。
65.如本文所用，“接头”是连接分子的两个区域的短且柔性的氨基酸序列。例如，接头可以连接fab区和fc区；或活性部分和fc区；或fc区和包含至少两个链间共价键的分子c末端区。典型的接头由1-20个氨基酸组成。
66.在一些实施方案中，所述接头包含几个甘氨酸和/或丝氨酸残基。在一些实施方案中，所述接头由甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。在一些实施方案中，所述接头包含对应于天然抗体分子的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述接头包含对应于天然抗体分子的氨基酸序列的氨基酸序列，所述fc区的ch2和ch3结构域是从所述天然抗体分子衍生的。
67.在一个实施方案中，fc区和包含至少两个链间共价键的c末端区通过由6个氨基酸组成的接头连接。在一个实施方案中，fc区和包含至少两个链间共价键的c末端区通过由1个氨基酸组成的接头连接。
68.如本文所用，“活性部分”是分子或分子的一部分，其通过与生物结构(例如，所述分子的受体)相互作用来发挥生物学功能。
69.在一些实施方案中，所述活性部分是肽。在一些实施方案中，所述活性部分是受体激动剂或受体拮抗剂。在一些实施方案中，所述活性部分是酶。在一些实施方案中，所述活性部分是细胞因子。在一些实施方案中，所述活性部分是抗原结合部分。
70.如本文所用，“抗原结合部分”是能够与这种抗体的靶标结合的抗体或抗体片段。抗原结合部分的例子是fab片段、f(ab)2片段、scfv(单链可变片段)、sdab(单结构域抗体)、vhh、isvd(免疫球蛋白单可变结构域)(例如，纳米抗体分子)和vnar(可变新抗原受体)。
71.fc区
72.在本发明的一些实施方案中，所述两个多肽形成igg、igm、iga、igd或ige抗体的fc区。在本发明的一些实施方案中，所述两个多肽形成igg抗体的fc区。在本发明的一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区。在本发明的一些实施方案中，所述两个多肽形成igg2抗体的fc区。在本发明的一些实施方案中，所述两个多肽形成igg3抗体的fc区。在本发明的一些实施方案中，所述两个多肽形成igg4抗体的fc区。在本发明的一些实施方案中，所述两个多肽形成混合fc区，其包含不同抗体类别或子类别的ch结构域，例如igg1 ch3结构域和igg4 ch2结构域。
73.c末端共价键
74.在一些实施方案中，所述至少两个共价键是至少两个二硫键。在一些实施方案中，所述至少两个共价键是两个二硫键。
75.在一些实施方案中，所述至少两个共价键包含在对应于抗体铰链区的氨基酸序列的序列中。在一些实施方案中，对应于抗体铰链区的氨基酸序列的序列与抗体铰链区的序列相同。在一些实施方案中，对应于抗体铰链区的氨基酸序列的序列与抗体铰链区的序列高度相似。在一些实施方案中，所述序列与抗体铰链区的序列具有至少70％同一性。在一些实施方案中，所述序列与抗体铰链区的序列具有至少75％同一性。在一些实施方案中，所述序列与抗体铰链区的序列具有至少80％同一性。在一些实施方案中，所述序列与抗体铰链区的序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，所述序列包含抗体铰链区序列的至少7
个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述序列包含抗体铰链区序列的至少10个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述序列包含抗体铰链区序列的至少15个连续氨基酸。
76.在一些实施方案中，对应于抗体铰链区的氨基酸序列的序列与igg4铰链区的序列相同或高度相似。在一些实施方案中，对应于抗体铰链区的氨基酸序列的序列选自eskygppcppcp(seq id no:1)、eskygppcppcpa(seq id no:2)、eskygppcppcpapeaa(seq id no:3)、ggggsaeskygppcppcp(seq id no:4)、ggggsaeskygppcppcpa(seq id no:5)、ggggsaeskygppcppcpapeaa(seq id no:6)。在一些实施方案中，所述至少两个共价键包含在富含脯氨酸-半胱氨酸的序列中。在一些实施方案中，所述富含脯氨酸-半胱氨酸的序列选自gppcppcp(seq id no:7)、gppcppcpa(seq id no:8)、gppcppcpapeaa(seq id no:9)。
77.在一些实施方案中，所述至少两个共价键是通过非天然氨基酸之间的点击化学产生的共价键。
78.在一些实施方案中，至少两个共价键位于每个多肽上的ch2、ch3和/或ch4结构域的c末端。
79.在一些实施方案中，至少两个共价键位于每个多肽上的ch2和/或ch3结构域的c末端。
80.在一些实施方案中，至少两个共价键位于每个多肽上的ch2和ch3结构域的c末端。
81.ch2结构域中的内部二硫键
82.每个多肽包含作为所述fc区的一部分的ch2结构域，其中这些ch2结构域中的每一个均包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键。所述内部二硫键选自在以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与d265c；p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。在一些实施方案中，所述内部二硫键选自在以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。在一些实施方案中，所述内部二硫键选自在以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与l328c；以及s267c与a327c。在一些实施方案中，所述内部二硫键是在半胱氨酸残基p238c与d265c之间形成的二硫键。在一些实施方案中，所述内部二硫键是在半胱氨酸残基p238c与l328c之间形成的二硫键。在一些实施方案中，所述内部二硫键是在半胱氨酸残基s267c与a327c之间形成的二硫键。在一些实施方案中，所述内部二硫键是在半胱氨酸残基v240c与i332c之间形成的二硫键。还公开了一种内部二硫键，其是在半胱氨酸残基p238c与a327c之间形成的二硫键。
83.在一些实施方案中，所述多肽中的每一个包含接头，其中所述接头将形成所述fc区的免疫球蛋白结构域的c末端与位于所述免疫球蛋白结构域c末端的二硫键之一连接。在一些实施方案中，所述接头包含6个氨基酸。
84.示例性实施方案
85.在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg抗体的fc区，并且所述至少两个共价键是至少两个二硫键。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg抗体的fc区，并且所述至少两个共价键是两个二硫键。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg抗体的fc区，并且所述至少两个共价键包含在对应于抗体铰链区的氨基酸序列的序列中。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg抗体的fc区，并且所述至少两个共价键包含在富含脯氨酸-半胱氨酸的序列中。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg抗体的fc区，并且所述至少两个共价
键是通过非天然氨基酸之间的点击化学产生的共价键。
86.在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，并且所述至少两个共价键是至少两个二硫键。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，并且所述至少两个共价键是两个二硫键。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，并且所述至少两个共价键包含在对应于抗体铰链区的氨基酸序列的序列中。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，并且所述至少两个共价键包含在富含脯氨酸-半胱氨酸的序列中。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，并且所述至少两个共价键是通过非天然氨基酸之间的点击化学产生的共价键。
87.在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg4抗体的fc区，并且所述至少两个共价键是至少两个二硫键。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg4抗体的fc区，并且所述至少两个共价键是两个二硫键。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg4抗体的fc区，并且所述至少两个共价键包含在对应于抗体铰链区的氨基酸序列的序列中。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg4抗体的fc区，并且所述至少两个共价键包含在富含脯氨酸-半胱氨酸的序列中。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg4抗体的fc区，并且所述至少两个共价键是通过非天然氨基酸之间的点击化学产生的共价键。
88.在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，并且所述fc区的ch2结构域中的每一个包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，并且所述fc区的ch2结构域中的每一个包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键，其中所述内部二硫键选自在以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与d265c；p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，并且所述fc区的ch2结构域中的每一个包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键，其中所述内部二硫键选自在以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。
89.在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，所述至少两个共价键是至少两个二硫键，并且所述fc区的ch2结构域中的每一个包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，所述至少两个共价键是两个二硫键，并且所述fc区的ch2结构域中的每一个包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，所述至少两个共价键包含在对应于抗体铰链区的氨基酸序列的序列中，并且所述fc区的ch2结构域中的每一个包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，所述至少两个共价键包含在富含脯氨酸-半胱氨酸的序列中，并且所述fc区的ch2结构域中的每一个包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，所述至少两个共价键是通过非天然氨基酸之间的点击化学产生的共价键，并且所述fc区的ch2结构域中的每一个包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键。
90.在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，所述至少两个共价键是至少两个二硫键，并且所述fc区的ch2结构域中的每一个包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键，其中所述内部二硫键选自在以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二
硫键：p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，所述至少两个共价键是两个二硫键，并且所述fc区的ch2结构域中的每一个包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键，其中所述内部二硫键选自在以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，所述至少两个共价键包含在对应于抗体铰链区的氨基酸序列的序列中，并且所述fc区的ch2结构域中的每一个包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键，其中所述内部二硫键选自在以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，所述至少两个共价键包含在富含脯氨酸-半胱氨酸的序列中，并且所述fc区的ch2结构域中的每一个包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键，其中所述内部二硫键选自在以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。在一些实施方案中，所述两个多肽形成igg1抗体的fc区，所述至少两个共价键是通过非天然氨基酸之间的点击化学产生的共价键，并且所述fc区的ch2结构域中的每一个包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键，其中所述内部二硫键选自在以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。
91.在一些实施方案中，所述分子是抗体并且仅包含内源序列。在一些实施方案中，所述分子是多特异性抗体并且仅包含内源序列。在一些实施方案中，所述分子是单特异性抗体并且仅包含内源序列。
92.在一些实施方案中，所述分子包含活性部分。在一些实施方案中，所述活性部分是抗原结合部分。在一些实施方案中，所述活性部分是肽。在一些实施方案中，所述活性部分是受体激动剂或受体拮抗剂。在一些实施方案中，所述活性部分是酶。在一些实施方案中，所述活性部分是细胞因子。在一些实施方案中，所述活性部分是趋化因子。在一些实施方案中，所述活性部分是毒素。在一些实施方案中，所述活性部分是放射性造影剂。在一些实施方案中，所述活性部分是营养素。
93.在一些实施方案中，所述分子包含位于所述fc部分的n末端的活性部分。在一些实施方案中，所述分子不包含位于所述至少两个共价键c末端的活性部分，所述至少两个共价键位于所述fc区的c末端。这具有以下优点：所述fc的c末端部分不干扰所述活性部分，例如不阻碍其与靶标的结合。在一些实施方案中，所述活性部分是抗原结合部分。
94.在一些实施方案中，每个多肽包含位于fc部分n末端的抗原结合部分。在一些实施方案中，每个多肽包含位于fc部分n末端的fab片段的重链。在一些实施方案中，每个多肽包含位于fc部分n末端的isvd。
95.多核苷酸、载体、细胞
96.在第二方面，本发明涉及编码本发明分子的一种或多种多核苷酸。这指的是上述所有实施方案。根据第二方面的一种或多种多核苷酸还可以编码包含在具有本发明分子的复合物中的一种或多种另外的多肽。在一个实施方案中，所述一种或多种多核苷酸编码抗体或抗体样结构。在一个实施方案中，分离所述一种或多种多核苷酸。
97.在第三方面，本发明涉及包含根据本发明第二方面的一种或多种多核苷酸的一种或多种表达载体。如本文所用的术语“载体”是指用于将编码信息转移至宿主细胞的任何分
子(例如，核酸、质粒或病毒)。术语“载体”包括能够转运已经与其融合的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它是指可以将另外的dna区段插入其中的环状双链dna分子。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将另外的dna区段插入病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞中之后整合至宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导它们包含的基因的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。
98.在第四方面，本发明涉及包含根据本发明第二方面的一种或多种多核苷酸或根据本发明第三方面的一种或多种表达载体的细胞。多种细胞表达系统可以用于表达所述多核苷酸，包括使用原核和真核细胞，诸如细菌细胞(例如，大肠杆菌(e.coli))、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞(例如，小鼠细胞、大鼠细胞、人细胞等)。为此目的，用所述一种或多种多核苷酸或表达载体转化或转染细胞，使得本发明的一种或多种多核苷酸在细胞中表达，并且在一个实施方案中，分泌到培养细胞的培养基中，可以从所述培养基中回收表达产物。
99.具有内部二硫键的ch2结构域
100.在另一方面，本发明提供了ch2结构域，其中所述ch2结构域包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键。在一些实施方案中，本发明提供了igg1 ch2结构域，其中所述ch2结构域包含不存在于野生型igg1 ch2结构域中的内部二硫键。在一些实施方案中，igg1 ch2结构域中的所述内部二硫键选自在根据eu编号的以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与d265c；p238c与a327c；p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。在一些实施方案中，igg1 ch2结构域中的所述内部二硫键在选自以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。在一些实施方案中，igg1 ch2结构域中的所述内部二硫键是在半胱氨酸残基p238c与d265c之间形成的二硫键。在一些实施方案中，所述内部二硫键是在半胱氨酸残基p238c与a327c之间形成的二硫键。在一些实施方案中，igg1 ch2结构域中的所述内部二硫键是在半胱氨酸残基p238c与l328c之间形成的二硫键。在一些实施方案中，igg1 ch2结构域中的所述内部二硫键是在半胱氨酸残基s267c与a327c之间形成的二硫键。在一些实施方案中，所述内部二硫键是在半胱氨酸残基v240c与i332c之间形成的二硫键。
101.在一些实施方案中，本发明提供了ch2结构域，其中所述ch2结构域包含不存在于相应野生型ch2结构域中的至少两个内部二硫键。在一些实施方案中，本发明提供了igg1ch2结构域，其中所述ch2结构域包含不存在于野生型igg1 ch2结构域中的至少两个内部二硫键。在一些实施方案中，所述igg1 ch2结构域中的所述内部二硫键选自根据eu编号的以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与d265c；p238c与a327c；p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。在一些实施方案中，igg1 ch2结构域中的所述内部二硫键是在以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的：p238c与d265c以及s267c与a327c；p238c与d265c以及v240c与i332c；p238c与a327c以及v240c与i332c；p238c与l328c以及s267c与a327c；p238c与l328c以及v240c与i332c；s267c与a327c以及v240c与i332c。
102.还可以引入另外的二硫键以稳定分子，例如如本领域所述的ch3结构域中的域内二硫键(wozniak-knopp plos one.2012；7(1):e30083)。
103.在一些实施方案中，包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键的ch2结
构域是较大分子的一部分。在一些实施方案中，所述分子是抗体。在一些实施方案中，所述分子是多特异性抗体。在一些实施方案中，所述分子是单特异性抗体。
104.实施例
105.实施例1示出了用抗tnf抗体阿达木单抗处理，而实施例2采用glp1受体激动剂(ra)fc融合蛋白。
106.方法
107.以下部分总结了以下实施例中使用的方法。
108.蛋白质构建体和蛋白质表达
109.所有蛋白质均在cho或hek293细胞中瞬时表达。不同抗体变体的序列示于序列表中。合成了对于不同蛋白质链的dna(thermo fisher scientific)，并将其克隆到在cmv启动子序列和将蛋白质正确分泌到培养上清液中所需的前导序列下的表达载体中。基本上如becker等人(2019)protein expr purif.2019年1月；153:1-6所述进行表达和纯化。简言之，将细胞使用pei以1:3的dna:pei的比率转染。表达进行6天，并且通过离心(20min，3000g，4℃)将细胞从培养上清液中分离。将培养上清液进行0.22μm过滤并且加载到在磷酸盐缓冲盐水(pbs，gibco/thermo fisher scientific)中平衡的mabselect sure柱(ge healthcare)上。洗脱后，将蛋白质脱盐并且使用用pbs(gibco)平衡的superdex 200(ge healthcare)尺寸排阻色谱柱进一步纯化。
110.glp1-ra fc融合蛋白的序列直接侧接前导序列或含有his标签的前导序列，然后是tev切割位点。为了经由his标签纯化，将蛋白质在于300mm nacl、50mm tris(ph 8.0)中平衡的his标签纯化树脂(complete，roche)柱上捕获。将柱用300mm nacl、50mm tris(ph 8.0)、5mm咪唑洗涤，并且将蛋白质用300mm nacl、50mm tris(ph 8.0)、500mm咪唑洗脱。在室温下在100mm nacl、50mm、50mm tris(ph 8.0)中过夜进行tev切割，并且将切割混合物直接加载到蛋白a柱上并且进一步纯化。当不存在his标签时，如上所述使用蛋白a纯化蛋白质。
111.sds-page分析
112.将蛋白质样品(5μg蛋白质)与4
×
lds样品缓冲液(life technologies/thermo fisher scientific)或4
×
lds样品缓冲液(含50mm二硫苏糖醇)混合，以用于分别在非还原或还原条件下进行sds-page分析。将样品在99℃下孵育5min，然后加载到用mes作为运行缓冲液的4％-12％ sds-page(life technologies/thermo fisher scientific)上。使用benchmark蛋白梯作为标记物(invitrogen/thermo fisher scientific)。
113.分析型尺寸排阻色谱法和多角度静态光散射测量联用(sec-mals)
114.使用在新鲜脱气和0.2μm过滤的pbs(gibco)中平衡的superdex 200 10/hr柱(ge healthcare)进行分析型尺寸排阻色谱法(sec)运行。所有样品的样品体积为50μl，并且将所有样品的蛋白质浓度调整为3mg/ml。使用纯化仪(ge healthcare)作为色谱系统。将系统连接到作为浓度检测器的多角度静态光散射(mals)检测器(minidawn，wyatt)和折射率(ri)检测器(shodex ri-101，showa-denko)。使用asta 5.3.4.20(wyatt)软件进行数据分析。对所有样品使用0.185的折射率增量(dn/dc)值。
115.ms分析
116.通过lc-ms检查蛋白质完整性。将蛋白质样品用在含有png酶f的ddh2o(无甘油，
new england biolabs)中稀释至0.5mg/ml的12.5μg蛋白质(1:50v/v)在37℃下去糖基化15h。如果将样品在还原条件下分析，则添加0.1m二硫苏糖醇。在配备有双esi接口和agilent1290/1260infinity lc系统的agilent 6540超高清(uhd)q-tof上进行lc-ms分析。使用plrp-s 1000a 5μm，50
×
2.1mm(agilent)以及保护柱plrp-s 300a 5μm，3
×
5mm(agilent)在200μl/min和80℃柱温下进行反相(rp)色谱法。
117.将1μg蛋白质注射到柱上，并且使用乙腈浓度在0至17min内不断增加的线性梯度洗脱。所用的洗脱液是含有lc水和0.1甲酸的缓冲液a以及含有90％乙腈、10％ lc水和0.1甲酸的缓冲液b。使用软件masshunter bioconfirm b.06(agilent)分析获得的大量数据。使用gpmaw软件10.32版(lighthouse data，丹麦)基于蛋白质的氨基酸序列计算分子量。
118.表面等离子体共振分析
119.与fcr结合的抗体的所有分析均在biacore t200仪器(ge healthcare)上进行。使用抗his捕获进行fcγr结合测定。将抗四his(qiagen)缓冲液交换到pbs ph 7.2(gibco)中，在10mm乙酸钠ph 4.0中稀释至25μg/ml，并且使用ge healthcare提供的胺偶联试剂盒将其直接固定到系列s cm5芯片上，表面密度达到约10,000ru。将his标记的重组人和小鼠fcγr(fcyri/cd64#1257-fc；fcγriia/cd32a(r167)#1330-cd；fcγriib/c/cd32b/c#1875-cd；fcγriiia/cd16a#4325-fc；fcγr4/cd16-2#4325-fc；r&d systems)在hbs-ep+(10mm hepes(ph 7.4)、150mm nacl、3mm edta、0.05％表面活性剂p20)中稀释至2μg/ml并且以10μl/min的流速注射30s。将抗体从3000连续稀释3倍至37nm，并在捕获的受体上一式两份注射2min。对于与hfcγri的结合，进行从300nm至3.7nm的连续稀释。用10mm甘氨酸ph 1.5使表面再生30sec。使用biaevaluation软件(ge healthcare)处理传感图，并且拟合到1:1结合模型以获得动力学常数。使用生物素化的fcrn进行fcrn结合测量。生物素化的人fcrn蛋白是从immunitrack(#itf01)购买的。使用捕获测定，其使用生物素捕获试剂盒(ge healthcare)可逆捕获生物素化的fcrn。通过以2μl/min的流速注射生物素捕获试剂溶液300s来制备cap芯片表面。以0.5μg/ml的浓度和10μl/min的流速捕获fcrn蛋白90s以达到典型的100ru的捕获水平。将分析的蛋白质以在hbs-ep+缓冲液中从1600nm至12.5nm的1:1稀释系列使用。将蛋白质注射60s，并且测量通过缓冲液注射的解离，持续120s。将hbs-ep+缓冲液在30μl/min的流速下用作测定缓冲液。如制造商所述，用生物素捕获试剂盒的再生溶液使芯片表面再生。使用不含捕获的fcrn的流通池作为参考并减去缓冲液注射(双重参考)在biacore t200评价软件v2.0中分析结合曲线。通过每种蛋白质浓度的平衡结合反应(req)的全局稳态数据拟合测定平衡解离常数(kd)。
120.使用biacore 3000仪器(ge healthcare)上的表面等离子体共振进行人tnfα与抗体的结合。将抗体固定在芯片上，并且将tnfα用作分析物。对于抗体的捕获，使用人抗体捕获试剂盒(ge healthcare)。使用如对于人抗体捕获试剂盒所述的标准程序，通过研究级cm5芯片(ge life sciences)上的伯胺基团(典型地10.000ru)固定捕获抗体。以调节的ru值以10μl/min的流速捕获所分析的抗体，所述调节的ru值将导致通常30ru的最大分析物结合信号。针对重组人tnfα(sigma-aldrich，#h8916)在100nm的浓度下测量结合迹线，其中缔合时间和解离时间分别为240s和300s。使用hbs-ep在30μl/min的流速下作为测定缓冲液。用人抗体捕获试剂盒的再生溶液使芯片表面再生。使用不含捕获抗体的流通池作为参考并减去缓冲液注射(双重参考)在biaevaluation程序包v4.1中分析结合迹线。
121.adcc和adcd体外测定
122.通过将cho-k1细胞系用突变形式的人tnfα转染来产生靶细胞。已知这种突变形式只能被膜蛋白酶很差地切割，并保留在细胞表面。将这种tnfα形式克隆到在cmv启动子下且进一步含有用于选择的新霉素抗性基因的哺乳动物表达载体中。使细胞在含有10％热灭活胎牛血清(fbs，gibco)和1mg/ml g418抗生素(invivogen，图卢兹，法国)的ham'sf12培养基(biowest，尼阿耶，法国)中生长以供选择。两种测定都使用相同的靶细胞并且是基于铬(
51
cr)释放测定的。对于adcd测定，将靶细胞用pbs洗涤并且与胰蛋白酶一起孵育4分钟。将细胞用
51
cr标记，洗涤并且以约3000个细胞/孔在96孔板中铺板，并且与含有5％ fbs的rpm1-1640(biowest)培养基一起孵育。以固定浓度添加豚鼠补体(标准补体，tebubio)，并且以不同浓度添加抗体，并且在37℃下进一步孵育4小时。对于放射性测量，取出等分试样，将其转移到lumaplate(perkinelmer)中，并且使用microbeta jet装置(perkinelmer)进行γ计数。以与对于adcd测定所述的类似方式进行adcc测定，但不是添加补体，而是以10:1的比率(效应细胞:靶细胞)添加效应细胞。所使用的效应细胞是表达人fcγriiia(v158)受体的单克隆人细胞毒性t淋巴细胞，如文献中所述(cl
é
menceau等人,blood.2006；107(12):4669-4677)。在所有测定中，所包括的阴性对照分别是不添加补体或不添加效应细胞(自发释放)。通过向细胞培养基中添加0.75％ triton x-100实现最大
51
cr释放。结果表示为特定释放％，并按照以下公式计算：特定释放％＝(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)。所有测量均一式三份地进行。
123.小鼠中的药效学
124.在covance(covance laboratories inc，格林菲尔德，印第安纳州)进行小鼠研究。所有程序均符合美国农业部(u.s.department of agriculture，usda)的动物福利法(animal welfare act)(9cfr第1、2和3部分)和实验动物护理和使用指南(guide for the care and use of laboratory animals)(实验室动物研究所(institute for laboratory animal research))。
125.雌性db/db(bks.cgo-+leprdb/+leprdb/olahsd)或瘦型小鼠(bks.cg-[瘦型]/olahsd)来自envigo。动物在研究开始时为12周龄，并且以n＝8只动物分组。小鼠用purina 5008随意饲喂，自由获取水，并且保持12h亮/暗循环。作为分层标准，在给药前阶段的第7天测定hba1c值(溶血方法)。hba1c是先前约4周期间平均血糖水平的生物标记物。将低、中和高hba1c值尽可能均地分布在各组中，导致hb1ac组平均值相似。将所有动物用具有10nmol/kg媒介物(pbs，gibco参考14190)或化合物的5ml/kg施加体积每4天皮下处理一次。在未麻醉的情况下从尾尖抽取血液样品，并且在给药前阶段的第9天和给药阶段第1、5、9和13天(给药后0h和4h)以及第2、3、4、6、7、8、10、11、12和14天用血糖仪测量血糖。每天测量体重。
[0126]
glp1受体活性测定
[0127]
通过测量稳定表达人glp1受体的重组psc-hek-293细胞系中的camp应答的功能测定来测定化合物对人胰高血糖素样肽-1(glp1)受体的激动作用。使细胞在置于37℃的t175培养瓶中的培养基(dmem/10％ fbs)中生长至接近汇合，并以1-5
×
107个细胞/ml的浓度收集在2ml小瓶中的含有10％ dmso的细胞培养基中。每个小瓶含有1.8ml细胞。将小瓶在异丙醇中缓慢冷冻至-80℃，然后转移至液氮中进行储存。使用前，将冷冻细胞在37℃下快速解冻并且用20ml细胞缓冲液(1x hbss；20mm hepes，加0.1％ hsa(如果在示例条件中指示))
洗涤(在900rpm下5min)。将细胞重悬于测定缓冲液(细胞缓冲液加2mm ibmx)中，并且调节至1
×
106个细胞/ml的细胞密度。为了测量，将5μl细胞(最终为5000个细胞/孔)和5μl测试化合物添加到384孔板中，随后在室温下孵育30分钟。使用均相时间分辨荧光技术(htfr，cisbio)测定细胞的camp含量。在添加稀释于溶解缓冲液中的htrf试剂(试剂盒组分)后，将板孵育1h，随后测量在665/620nm下的荧光比。通过测定引起最大反应的50％激活的浓度(ec50)来定量激动剂的体外效力。
[0128]
热稳定性测量
[0129]
使用基于nanodsf技术的prometheus nt flex装置(nanotemper technologies)进行热稳定性分析。所述装置配备有聚合光学器件，其允许在荧光测量的同时收集散射信息。按照制造商的说明书，在20℃至95℃的范围内以1℃/min的升温速率进行测量。将所有蛋白质样品溶解在pbs中，并且将蛋白质浓度调节至0.5mg/ml。测量一式两份地进行。使用软件pr thermcontrol v.2.1(nanotemper technologies)进行数据分析。
[0130]
实施例1：根据本发明的阿达木单抗的fc变体的产生
[0131]
针对抗tnf抗体阿达木单抗，测试了根据本发明的fc分子的概念。我们创建了两种不同形式的根据本发明的fc阿达木单抗(图2，mab06(重链seq id no:10)和mab07(重链seq id no:11))。这两种构建体仅在替换铰链区的接头的长度上有所不同。为了比较的目的，还制备了已知具有沉默效应子功能的fc骨架变体(图2，mab02、mab04、mab05)。fab在所有构建体中都是相同的。所有抗体在cho或hek293细胞中瞬时表达，并且使用两步式纯化程序纯化。有趣的是，用根据本发明的fc变体获得了最高产率(表1)。
[0132]
表1.所获得的不同抗体变体的产率(两步式纯化后)。
[0133]
fc骨架产率[mg/l]igg1 igg2100.4udigg1200.7udigg1(19gs接头)150.6igg1 lala n297a120.7igg1 lala p239a90.4igg1 e269r,k322a140.7
[0134]
通过sds-page(图3)和与mals偶联的分析型尺寸排阻色谱法来分析所有抗体的同质性。光散射测量是检测大颗粒(例如聚集体)的非常灵敏的方法。此外，它允许在不需要参考分子的情况下计算分子量。在所有抗体样品中，聚集体的存在低于检测限(图4)。所获得的所有抗体的计算分子量与计算值非常一致。此外，通过ms验证了所有抗体变体的身份(表2)。
[0135]
表2.每个抗体的计算的质量和通过sec-mals和ms获得的质量。用gpmaw计算分子量(平均质量值)。假定所有半胱氨酸均形成二硫桥。
[0136]
[0137][0138]
根据本发明的具有19gs接头的fc igg1变体(mab07)从sec柱稍早洗脱。在此分子中，fab结构域经由长接头(gggggggsggggsggggsa，seq id no:12)与fc区连接。这种排列显然允许更开放的分子构型，从而导致流体动力学半径略有增加。通过表面等离子体共振测量来检查与抗原人tnfα的结合(图5)。
[0139]
与fcr的结合测定
[0140]
根据本发明的阿达木单抗的fc变体缺乏位于igg铰链区的fcγr结合位点(图1)。因此，它们应该不与fcγr结合。为了检查根据本发明的fc变体与fcγr的结合是否确实被消除，我们使用表面等离子体共振来测量与固定化fcγr的结合，以与携带沉默突变的其他抗体变体进行比较。我们分析了与人fcγri，fcγriia、b和c以及fcγriiia的结合。此外，我们包括了鼠激活fcγriv，因为在小鼠模型中分析了许多抗体和fc融合蛋白。最后，对于抗体和fc融合蛋白的回收很重要的人fcrn受体也包括在测试组中。结果总结于表3中，并且相应的传感器图示于图6中。
[0141]
表3.不同抗tnfα抗体对不同人fcγr的亲和力测量结果。在可能的情况下，使用1:1动力学模型测定kd(n/d：未检测到结合；*太低：信号太低而无法获得结合常数)。
[0142][0143]
未经修饰的igg1骨架(mab01)与所有fcγr结合。在fcγri(它被称为高亲和力结合受体)的情况下获得了最高的结合亲和力。出于比较目的测试的未经修饰的igg2(mab03)显示出与fcrγiia、fcγriib/c的一些结合，以及与fcrγiiia的较低程度的结合。具有根据本发明的fc igg1的抗体(mab06、mab07)未显示出与所有测试的fcγr的可检测的结合。对于igg1 lala n297a(mab02)和igg1 lala p329a(mab05)骨架变体也是如此。对于igg1 e269r,k322a变体(mab04)，仍然可以测量到与fcγri的高亲和力结合。此变体与fcγriiia和鼠fcγriv的结合显著降低，但是仍可检测到。所有分析的fc变体均显示出对hfcrn的相似的结合亲和力。
[0144]
功能细胞测定(adcc和adcd)
[0145]
adcc和adcd是抗体效应子功能的最重要机制。因此，我们希望确保根据本发明的阿达木单抗的fc变体不会引发adcc或adcd。在adcc测定中，将表达膜驻留抗原的靶细胞与
目的抗体和效应细胞一起孵育。如果将效应细胞栓系在靶细胞上，它就会被激活并且杀伤靶细胞(图7a)。所有分析的抗体变体显示出没有可检测的特异性靶细胞裂解，而igg1 wt变体引发显著的特异性细胞裂解(图7b-图7d)。
[0146]
adcd机制通过激活补体系统导致细胞死亡。通过c1q蛋白与靶细胞的细胞表面的抗原-抗体复合物的结合触发补体级联。补体级联激活的最后一步是形成导致细胞裂解的所谓的膜攻击复合物(图8a)。igg1 lala n297a(mab02)和igg2骨架(mab03)仍然能够诱导显著的特异性细胞裂解(图8b、图8c)。igg1 e269r,k322a变体(mab04)触发较低但仍可检测的特异性细胞裂解。对于根据本发明的fc igg1变体(mab06、mab07)和igg1 lala p329a变体(mab05)，未观察到特异性细胞裂解或未观察到显著的特异性细胞裂解(图8b、图8d)。
[0147]
实施例2：glp1受体激动剂fc结构域融合蛋白
[0148]
为了评价根据本发明的fc形式的肽fc融合蛋白和测试体内功能性，我们使用glp1受体激动剂(ra)fc融合蛋白。因此，我们经由肽接头将人glp1-ra与igg4 fc区(图9，glp1-fc01和04)或igg1 fc区(图9，glp1-fc02、05-014)融合。图9示出了不同glp1-ra-fc融合蛋白变体的概述。
[0149]
除了根据本发明的igg4(glp1-fc04)和igg1(glp1-fc05)的简单fc变体之外，我们创建了9个根据本发明的igg1的fc变体(glp1-fc06-14)，其在ch2结构域中包含另外的内部二硫键。这旨在另外稳定ch2结构域，因为已知igg ch2结构域比igg ch3结构域更早地解折叠。虽然其中6个具有另外的内部二硫键的变体在c末端具有衍生自野生型铰链区序列的序列(glp-fc06-11)，但是其他3个变体在c末端具有缩短的富含脯氨酸-半胱氨酸的序列(glp-fc12-14)。通过sds-page(图10)和与mals偶联的分析型尺寸排阻色谱法(图11)来分析所有glp1-fc-ra融合蛋白的同质性。在所有分析的样品中，聚集体的存在均低于检测限，并且所获得的分子量与计算的均二聚体分子的摩尔质量非常一致(表4)。
[0150]
表4.glp1-fc融合蛋白的计算质量和通过sec-mals和ms获得的质量。用gpmaw计算分子量(平均质量值)。假定所有半胱氨酸均形成二硫桥。n.d.：未测定
[0151][0152]
为了比较的目的，我们还包括了在重链之间没有任何共价键的变体(glp1-fc03)。与其他测试的变体相比，此glp1-fc03变体在非还原条件下的sds-page中显示出明显的解离。
[0153]
在glp1-r激活测定中检查所有变体的活性。为了确保引入的二硫键不干扰与fcrn的结合，在ph 6.0下使用表面等离子体共振技术检查与fcrn的结合。glp1活性数据和与fcrn的结合数据示于表5中。
[0154]
表5.活性数据和与fcrn的结合数据。用表达glp1r的报告细胞系测定ec50值。使用表面等离子体共振技术测量与人fcrn的结合，并且用nanodsf进行热稳定性测量。n.d.：未测定。
[0155][0156][0157]
用dsf方法分析glp1-ra-fc融合蛋白的热稳定性(图12、表6)。
[0158]
表6.如用nanodsf测定的glp1-ra-fc变体的稳定性。使用标准程序和软件pr stability analysis v.1.0.3进行数据分析。t
on
是蛋白质开始解折叠时的起始温度。拐点(ip)是熔解曲线的一阶导数的最大值。所有数据均一式两份地测量，显示为平均值数据。
[0159]
变体t
on
[℃]ip#1[℃]ip#2[℃]ip#3[℃]glp1-fc0157.3965.9088.92
‑‑
glp1-fc0261.9069.6280.72
‑‑
glp1-fc0347.2060.2678.95
‑‑
glp1-fc0448.4161.3970.8487.87glp1-fc0555.8665.3684.74
‑‑
glp1-fc0657.0567.1274.7985.53glp1-fc0753.4764.8685.40
‑‑
glp1-fc0859.6569.3584.76
‑‑
glp1-fc0961.0270.6384.88
‑‑
glp1-fc1058.8869.4384.60
‑‑
glp1-fc1154.4264.9485.04
‑‑
glp1-fc1254.8164.9986.66
‑‑
glp1-fc1359.3469.0087.01
‑‑
glp1-fc1460.7570.2886.97
‑‑
[0160]
glp1-fc01(未经修饰的igg4骨架)显示出一个主要的解折叠事件。glp1-fc02(未经修饰的igg1骨架)导致更稳定的蛋白质，并且第二个解折叠事件是清楚地可检测的。与glp1-fc01和glp1-fc02相比，glp1-fc03(重链之间没有任何共价键的变体)更热不稳定。与glp1-fc03相比，glp1-fc04(根据本发明的fc igg4变体)稍微更稳定。在glp1-fc02和glp1-fc03中，ch3结构域衍生自igg1，而在glp-fc01和glp1-fc04中，ch3结构域衍生自igg4。很明显，仅在具有igg1衍生的ch3结构域的变体中测量到清楚的第二个解折叠事件(图12a)。根据这些数据，选择igg1 fc骨架进行进一步的工程化。将内部二硫键引入ch2结构域以进一步改善根据本发明的fc变体glp1-fc06-glp1-fc10的稳定性。尽管glp1-fc06显示出稍高的热稳定性并且glp-fc07显示出完全没有稳定性，但是在glp1-fc08、glp1-fc09和glp1-fc10中引入的二硫键产生了具有与igg1 lala fc骨架可比较的稳定性的蛋白质(glp1-fc-02；图12、表6)。
[0161]
为了进一步稳定根据本发明的fc变体，省略了fc区与对应于铰链区的c末端序列之间的接头序列(glp1-fc11)。在另一种方法中，将对应于铰链区的c末端序列缩短为富含脯氨酸-半胱氨酸的序列(glp1-fc12)。对于这些蛋白质，实现了第二个解折叠事件(ch3结构域)的热稳定性增加(图12c、表6)。在glp1-fc13和glp1-fc14中合并了ch2结构域内的内部二硫键和缩短的富含脯氨酸-半胱氨酸的序列的稳定作用(图12d、表6)。
[0162]
体内功能性
[0163]
在glp1-fc04中，未缺失原始铰链，但是半胱氨酸突变为丝氨酸。这样做是为了得到尽可能类似于母体分子的根据本发明的glp1-ra fc融合蛋白的fc变体，并且选择此变体用于头对头药效学分析。将这两种蛋白质均每四天皮下施用于db/db-小鼠中持续14天，并且监测血糖以及体重(图13)。第-1天的平均体重(每组n＝8)为24.9g(瘦型媒介物对照)、54.2g(db/db媒介物对照)、55.4g(glp1-fc01组)和54.8g(glp1-fc04组)。治疗时间段后，平均体重为25.2g(瘦型媒介物对照，+1.2％)、57.7g(db/db媒介物对照，+6.5％)、53.8g(glp1-fc01组，-2.9％)和50.4g(glp1-fc04组，-2.6％)。对于瘦型媒介物对照，在治疗时间段内体重几乎保持恒定，而db/db媒介物对照体重增加。两个处理组的体重减轻幅度相当。两种化合物glp1-fc01和glp1-fc04均显示出对血糖水平变化的无法区分的影响。这些发现表明，当与根据本发明的fc变体融合时，glp1-ra维持其完全活性。血糖随时间的一致变化曲线表明，根据本发明的fc变体的再循环功能在体内没有受损。
[0164]
所公开的项目
[0165]
还公开了以下内容：
[0166]
1.一种分子，所述分子包含两个多肽，
[0167]
其中所述多肽形成抗体fc区，
[0168]
其中所述两个多肽通过至少两个共价键连接，所述至少两个共价键位于每个多肽的形成所述fc区的部分的c末端，
[0169]
其中所述两个多肽不通过位于每个多肽的形成所述fc区的部分的n末端的二硫键连接。
[0170]
2.根据权利要求1所述的分子，其中所述两个共价键是两个二硫键。
[0171]
3.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中位于每个多肽的形成所述fc区的部分的c末端的所述至少两个共价键包含在对应于抗体铰链区的氨基酸序列的序列中。
[0172]
4.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中与包含位于每个多肽的形成所述fc区的部分的n末端的抗体铰链区的相同分子相比，对c1q和/或fcγr1、fcγr2和/或fcγr3的亲和力降低至少10倍。
[0173]
5.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中与包含位于每个多肽的形成所述fc区的部分的n末端的抗体铰链区的相同分子相比，对蛋白a和/或fcgrn的亲和力没有降低。
[0174]
6.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中所述fc区是igg、igm、iga、igd或ige的fc区。
[0175]
7.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中所述至少两个共价键位于每个多肽上的ch2、ch3和/或ch4结构域的c末端。
[0176]
8.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中所述fc区是igg抗体的fc区。
[0177]
9.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中所述至少两个共价键位于每个多肽上的ch2和/或ch3结构域的c末端。
[0178]
10.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中所述至少两个共价键位于每个多肽上的ch2和ch3结构域的c末端。
[0179]
11.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中每个多肽包含作为所述fc区的一部分的ch2结构域，其中这些ch2结构域中的每一个均包含不存在于相应野生型ch2结构域中的内部二硫键。
[0180]
12.根据权利要求11所述的分子，其中所述另外的内部二硫键选自在根据eu编号的以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与d265c；p238c与a327c；p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。
[0181]
13.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中所述多肽中的每一个包含接头，其中所述接头将所述多肽的形成所述fc区的部分的c末端与所述至少两个共价键连接，所述至少两个共价键位于多肽的形成所述fc区的所述部分的c末端。
[0182]
14.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中所述分子进一步包含至少一个活性部分。
[0183]
15.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据前述权利要求中任一项所述的分子。

技术特征：
1.一种分子，所述分子包含两个多肽，其中所述多肽形成抗体fc区，其中所述两个多肽通过至少两个共价键连接，所述至少两个共价键位于每个多肽的形成所述fc区的部分的c末端，其中所述两个多肽不通过位于每个多肽的形成所述fc区的部分的n末端的二硫键连接，其中每个多肽包含作为所述fc区的一部分的ch2结构域，其中这些ch2结构域中的每一个均包含不存在于相应野生型ch2结构域中的另外的内部二硫键，其中所述另外的内部二硫键选自在根据eu编号的以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与d265c；p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。2.根据权利要求1所述的分子，其中所述另外的内部二硫键选自在根据eu编号的以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与l328c；s267c与a327c；以及v240c与i332c。3.根据权利要求1或2所述的分子，其中所述另外的内部二硫键选自在根据eu编号的以下位置处的半胱氨酸残基之间形成的二硫键：p238c与l328c；以及s267c与a327c。4.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中所述两个共价键是两个二硫键。5.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中位于每个多肽的形成所述fc区的部分的c末端的所述至少两个共价键包含在对应于抗体铰链区的氨基酸序列的序列中。6.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中与包含位于每个多肽的形成所述fc区的部分的n末端的抗体铰链区的相同分子相比，对c1q和/或fcγr1、fcγr2和/或fcγr3的亲和力降低至少10倍。7.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中与包含位于每个多肽的形成所述fc区的部分的n末端的抗体铰链区的相同分子相比，对蛋白a和/或fcgrn的亲和力没有降低。8.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中所述fc区是igg、igm、iga、igd或ige的fc区。9.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中所述至少两个共价键位于每个多肽上的ch3或ch4结构域的c末端。10.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中所述fc区是igg抗体的fc区。11.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中所述至少两个共价键位于每个多肽上的ch3结构域的c末端。12.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中所述分子进一步包含至少一个活性部分。13.根据权利要求12所述的分子，其中所述活性部分位于至少一个多肽的ch2结构域的n末端，并且所述分子不包含位于所述至少两个共价键的c末端的活性部分，所述至少两个共价键位于每个多肽的形成所述fc区的部分的c末端。14.根据权利要求12或13所述的分子，其中所述活性部分是抗原结合部分。15.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据前述权利要求中任一项所述的分子。

技术总结
本发明提供了包含经修饰的Fc区的分子，所述分子不介导抗体效应子功能如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，但由于与新生儿Fc受体(FcRn)结合而维持长的血清半衰期。为此，本发明的分子不包含抗体铰链区的二硫桥，而是通过至少两个共价键在C末端连接。此外，本发明的分子包含具有另外的二硫键的CH2结构域。有另外的二硫键的CH2结构域。有另外的二硫键的CH2结构域。


技术研发人员：W
受保护的技术使用者：赛诺菲
技术研发日：2021.12.20
技术公布日：2023/8/24