包含不影响中枢神经系统的疾病的特异性抗原和纳米颗粒的治疗性疫苗及其用途的制作方法

包含不影响中枢神经系统的疾病的特异性抗原和纳米颗粒的治疗性疫苗及其用途
1.本发明涉及用作治疗性疫苗的免疫治疗组合物领域。特别涉及一种治疗性疫苗，其用于治疗不影响脑的疾病，例如利什曼病。
发明领域
2.治疗性疫苗接种在于，当免疫响应不足以允许自发痊愈时诱导免疫响应。免疫系统的激活一方面要求它识别入侵者，另一方面它认为入侵者是危险的，然后在特异性和强度方面诱导适当的响应。
3.治疗策略与预防性疫苗接种差异极大。预防性疫苗接种在于，向免疫系统呈递抗原，从而在生物体再次接触相同抗原时诱导快速而强烈的响应(记忆响应)。而治疗性疫苗接种则基于病原体已经存在于生物体内这一事实。这是因为，在感染期间，免疫防御经常被感染性增殖所击溃或受内部控制机制妨碍，这会阻碍对病原体的有效免疫响应。治疗性疫苗将允许放大特异性免疫响应。
4.迄今为止开发的主要治疗性疫苗的目的是治疗癌症。它们通常包括注射肿瘤抗原和/或注射分化树突状细胞和/或t淋巴细胞。
5.治疗性疫苗是有意义的，因为对于已经携带疾病的个体来说，它们成为有效治疗解决方案。在某些病理的情况下，它们还允许产生常规预防性疫苗无法诱导的免疫响应。
6.利什曼病是一种寄生虫病，影响许多哺乳动物物种，特别是人类和狗。据估计，有250万只家犬患上犬利什曼病，而更普遍地在全世界位于所有大洲的70个国家均有分布。这种疾病的发病率在人类中也很高，每年全球超过80个国家约200万新发病例。这种疾病是利什曼原虫属(leishmania)细胞内寄生虫感染引起的。这种寄生虫是通过媒介双翅目昆虫白蛉(phlebotomines)传播的。因此，该疾病的地理分布取决于白蛉及其储存宿主：哺乳动物的分布。婴儿利什曼原虫(leishmania infantum)是一种巨噬细胞内寄生虫，在欧洲、地中海盆地和南美洲引起该疾病。传染是由昆虫叮咬个体引起的。这种疾病也可能从母亲传播给孩子。
7.利什曼原虫属寄生虫感染宿主细胞并改变细胞内输送机制，以维持其增殖的寄生液泡。
8.现有技术报告了用于治疗和/或诊断利什曼病的治疗性疫苗配方的开发。例如，es2205059公开了一种包含利什曼原虫抗原的免疫原部分的药物组合物。然而，迄今为止，任何针对利什曼病的治疗性疫苗实验均未证明有效。
9.此外，现有技术中提出的组合物都包含疫苗佐剂，这是其有效性所必需的，但其副作用已被广泛记录。
10.最后，目前最普遍的利什曼病治疗方法是通过化学疗法进行的。这种治疗方法昂贵、不具有特异性、具有毒性，并且可能诱导化学耐药性的出现。已知用于治疗狗利什曼病的分子是锑酸葡甲胺和别嘌呤醇，通常联合使用。
11.在这种背景下，需要对不感染中枢神经系统的病原体引起的感染性疾病，例如利
什曼病，进行有效且不会诱导耐药性的治疗，并且还需要改善治疗性疫苗的总体有效性，特别是在癌症治疗中。


技术实现要素：

12.发明人开发了一种不含佐剂的治疗性疫苗，旨在施用于携带不影响中枢神经系统的疾病或病原体的个体。特别是，该治疗性疫苗可用作利什曼病或癌症的治疗方法。
13.因此，本发明涉及一种治疗性疫苗，用于治疗携带不影响中枢神经系统的疾病或病原体的生物，所述疫苗包含至少一种含有阳离子多糖核的阳离子纳米颗粒和至少一种对不影响中枢神经系统的所述疾病或病原体具有特异性的抗原。
14.在一种具体实施方式中，本发明涉及一种旨在治疗利什曼病的治疗性疫苗，其中抗原对利什曼原虫具有特异性。
15.发明的优点
16.相当令人惊讶的是，发明人已证明，对已经携带例如利什曼病等诱导对代谢系统的损伤的疾病或病原体的生物体，施用包含纳米颗粒和对所述病原体或所述疾病具有特异性的抗原的免疫治疗组合物，可以对个体进行治疗。感染病原体时，此类治疗也可能诱导长期特异性免疫力，以避免之后再次感染相同的病原体。在个体已经携带疾病时施用疫苗的事实，可以有效地刺激个体的免疫防御，并通过消除病原体来确保治愈，以及通过建立记忆t细胞来确保长期免疫。
17.有意义的是，这种治疗性疫苗方法构成新型治疗方案，以治疗化学耐药性病原体引起的感染。
18.在利什曼病的情况下，发明人已经指出，这种治疗策略与现有治疗方法，即施用抗寄生虫药一样有效。这些结果在小鼠模型中得到了验证，还通过对自然感染的狗实施的临床研究得到了验证。非常有利的是，与抗生素不同，疫苗方法不会诱导任何耐药机制。因此，要么长期保持免疫力并防止再感染，要么可以在再次感染的情况下为个体重新接种疫苗。
19.该治疗性疫苗组合物不含任何佐剂(纳米颗粒本身除外)，这避免了与此类分子相关的不良反应。这是有利的，因为矿物佐剂(即铝盐等矿物盐)会在体内保留很长时间(几十年)。
20.抗原在溶液中与纳米颗粒结合，并在施用后递送至免疫细胞，而纳米颗粒则被迅速除去(经鼻施用后72小时内)。因此，纳米颗粒起到双重作用：稳定剂和抗原递送载体。
21.该疫苗可通过口服、经鼻、皮内、皮下或静脉内途径施用，并且可以通过单一制剂治疗利什曼病，而无论个体被感染的利什曼原虫种类如何。此外，相同的疫苗制剂可以施用于人类和动物，尤其是狗。
具体实施方式
22.本发明的第一目的涉及一种治疗性疫苗，旨在治疗携带无法通过血脑屏障的外周疾病或细胞内病原体的个体，所述治疗性疫苗包含至少一种含有阳离子多糖核的阳离子纳米颗粒和至少一种特异性抗原，其特征在于所述抗原对不影响中枢神经系统的病原体或疾病具有特异性。
[0023]“治疗性疫苗”，是指一种免疫刺激组合物，旨在刺激免疫系统产生能够对已患病
个体进行治疗的特异性免疫应答。该实施方式与用于尚未感染疾病的人的预防性疫苗相反。免疫刺激组合物也可以称为“免疫治疗组合物”。
[0024]“被感染个体”，是指携带不到达中枢神经系统的、导致感染的病原体的人或动物。
[0025]“外周疾病”，是指不影响(不危害)被感染个体的脑的疾病。该疾病仅影响代谢器官，即除脑(中枢神经系统)以外的所有器官。在本发明的含义中，这些疾病可以是不影响脑的癌症或任何其他外周疾病，例如自身免疫疾病。
[0026]“无法通过血脑屏障的病原体”，是指不感染中枢神经系统的病原体，因此该感染不会影响被感染个体的脑。
[0027]
在本发明的含义中，病原体可以是：
[0028]-没有中枢趋性的病毒，例如：单纯疱疹病毒(hsv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)、巨细胞病毒(mcv)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)。
[0029]-细胞内细菌，例如：伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)、淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)、军团菌属(legionella)、立克次体(rickettsia)、衣原体属(chlamydia)、嗜衣原体属(chlamydophila spp)、汉赛巴尔通体(bartonella henselae)、土拉弗朗西斯菌(francisella tularensis)、单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes)、布鲁氏菌属(brucella)、分枝杆菌(mycobact
é
rie)、诺卡菌属(nocardia)、马红球菌(rhodococcus equi)、耶尔森菌(yersinia)
[0030]-细胞内寄生虫，例如：顶复虫(apicomplexans)(疟原虫属(plasmodium spp.)、小隐孢子虫(cryptosporidium parvum))、锥虫科(trypanosomatidae)(克氏锥虫(trypanosoma cruzi)、利什曼原虫属(leishmania sp.))
[0031]-真菌，例如：荚膜组织胞浆菌(histoplasma capsulatum)、新型隐球菌(cryptococcus neoformans)、孢子丝菌属(sporotrix spp)等“含有阳离子多糖核的阳离子纳米颗粒”，是指包含阳离子多糖核的固体纳米颗粒(np)。np可以是交联或不交联的。其核可以含载有或不载有阴离子磷脂。这种np没有被任何磷脂层包围。
[0032]“抗原”，是指抗原性蛋白、抗原性蛋白的混合物或病原体的部分提取物或总提取物。病原体提取物可能含有蛋白质、多糖、脂类和核酸。蛋白质可以是亲水性的或亲脂性的。抗原可以是单独或组合形式的纯化物。
[0033]
在一种优选实施方式中，抗原性蛋白的混合物由一种或几种纯化的抗原或病原体提取物组成。病原体提取物可以是总提取物或部分提取物。在一种完全优选的实施方式中，抗原是从完整病原体获得的蛋白质的复合提取物。
[0034]
在一种具体实施方式中，抗原对利什曼病具有特异性。
[0035]
在一种具体实施方式中，抗原对利什曼原虫属(leishmania)具有特异性，例如婴儿利什曼原虫(leishmania infantum)、多诺瓦尼利什曼原虫(leishmania donovani)或大利什曼原虫(leishmania major)。在一种优选实施方式中，抗原对婴儿利什曼原虫(leishmania infantum)株具有特异性。
[0036]
在利什曼病的情况下，发明人认为由治疗性疫苗触发的免疫力可能是通过诱导能够识别不同种利什曼原虫的记忆性t响应而引起的交叉免疫力。
[0037]
在这种背景下，用以婴儿利什曼原虫(leishmania infantum)株制成的治疗性疫苗治疗的个体对所有其他利什曼原虫(leishmania)株免疫。此外，还存在跨物种交叉免疫，
即感染一个物种的病原体制备的疫苗可用于保护例如其他哺乳动物物种。因此，这种方法允许交叉疫苗接种，即广谱疫苗接种，因为该疫苗对所有利什曼病株有效，无论它们是皮肤、内脏还是皮肤株。
[0038]
根据本发明的疫苗的一个特征基于抗原与阳离子np相结合。
[0039]
在第一具体实施方式中，形成np核的阳离子多糖是通过多糖和至少一种阳离子配体之间反应然后添加交联剂而得到的交联聚合物，所述多糖选自淀粉、右旋糖酐、糊精和麦芽糊精、聚果糖(菊粉)、聚甘露糖、聚半乳糖、聚半乳甘露聚糖(瓜尔胶)，所述阳离子配体选自伯胺、仲胺、叔胺或季铵。所述交联剂选自环氧氯丙烷、二羧酸或酰氯，如癸二酸。所述核不载有脂类。
[0040]
在一种优选实施方式中，阳离子多糖是通过麦芽糊精和缩水甘油基三甲基铵反应获得的。
[0041]
在第三具体实施方式中，形成np核的阳离子多糖载有阴离子磷脂。这种阴离子磷脂可以选自二酰磷脂酰甘油、二酰磷脂酰丝氨酸或二酰磷脂酰肌醇。在另一优选实施方式中，阴离子磷脂是二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)。
[0042]
在一种完全优选的实施方式中，np是载有dppg的麦芽糊精纳米颗粒。
[0043]
在一种优选实施方式中，抗原是从导致寄生虫(其感染不到达snc)有关的疾病的寄生虫的部分提取物或总提取物获得的复合提取物。在一种具体实施方式中，这是一种化学耐药性寄生虫。
[0044]
在一种具体实施方式中，治疗性疫苗诱导人与动物之间的跨物种交叉免疫。在一种更具体的实施方式中，它在人类或非人类哺乳动物体内诱导交叉免疫，所述非人类哺乳动物例如是：犬科动物；猫科动物；兔科动物；牛科动物；啮齿动物、非人灵长类动物；马科动物。
[0045]
本发明的第二个目的涉及一种疫苗组合物，其包含至少一种含有阳离子多糖核的阳离子纳米颗粒和至少一种对无法通过血脑屏障的病原体或外周疾病具有特异性的抗原，所述组合物用于治疗无法通过血脑屏障的病原体引起的疾病或外周疾病。
[0046]
感染利什曼病的动物是哺乳动物，例如犬科动物、啮齿动物、兔科动物、马科动物、牛科动物、灵长类动物。
[0047]
本发明的第三个目的涉及一种组合物，其包含含有阳离子多糖核的阳离子纳米颗粒和对婴儿利什曼原虫(leishmania infantum)具有特异性的抗原，用作治疗皮肤、内脏或皮肤粘膜利什曼病的治疗性疫苗。
[0048]
在一种优选实施方式中，用作治疗性疫苗的组合物是经鼻施用的。
[0049]
在不脱离本发明范围的情况下，施用方式也可以是粘膜(口服)或皮内、皮下、静脉内途径。
附图说明
[0050]
图1示出了实施例1的研究方案。
[0051]
图2示出了配制后120小时进行的tel/npl制剂的sds-page(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)(左)和天然条件下的page(聚丙烯酰胺凝胶电泳)(右)。
[0052]
图3示出了感染60天后小鼠的肝脏、脾脏和骨髓中的寄生虫载量的测量。
[0053]
图4示出了实施例2的研究方案
[0054]
图5示出了配制后96小时进行的tel/npl制剂的sds-page(左)和天然条件下的page(右)。
[0055]
图6示出了感染90天后小鼠的肝脏、脾脏和骨髓中的寄生虫载量。
[0056]
图7示出了未经过治疗和经过化学疗法治疗或皮下和鼻内途径施用疫苗制剂治疗的小鼠的总igg(左)以及igg 1和igg 2a(右)的测定。
[0057]
图8示出了未经过治疗和经过化学疗法治疗或皮下和鼻内途径施用疫苗制剂治疗的小鼠的脾细胞的再刺激，以及上清液中分泌的细胞因子的测定。
[0058]
图9示出了实施例3的研究方案
[0059]
图10示出了tel/npl制剂在天然条件下的page。
[0060]
图11示出了未接种疫苗或经鼻(a)或皮下(b)途径接种了tel或tel/npl制剂疫苗的小鼠血清中的寄生虫载量的测量。未接种疫苗或接种了tel或tel/npl制剂疫苗的小鼠肝脏(c)和脾脏(d)中的寄生虫载量的测量。
[0061]
图12示出了实施例4的研究方案
[0062]
图13示出了感染后在不同条件下经过治疗的小鼠(n＝5)的器官中通过qpcr(定量多聚酶链反应)对婴儿利什曼原虫的寄生虫载量的分析。单向anova#p《0.05，**p《0.01，****p《0.0001
[0063]
图14示出了在不同条件下经过治疗后在30天内再感染的感染小鼠(n＝5)骨髓中通过qpcr对婴儿利什曼原虫的寄生虫载量的分析。单向anova*p《0.05。
[0064]
图15示出了实施例5的研究方案。
[0065]
图16示出了经化学疗法治疗的感染小鼠(n＝10)脾脏内通过qpcr对多诺瓦尼利什曼原虫的寄生虫载量的分析。单向anova，**p《0.01，***p《0.001
[0066]
图17示出了实施例6的研究方案。
[0067]
图18示出了用米替福辛治疗和/或接种疫苗的狗在一个月后的皮肤感染的进展。
[0068]
图19示出了用米替福辛治疗和/或接种疫苗的狗在一个月后骨髓中寄生虫载量的进展。
[0069]
图20示出了用米替福辛治疗和/或接种疫苗的狗的临床评分的进展。
[0070]
实施例
[0071]
缩略词：
[0072]-npl：脂质麦芽糊精纳米颗粒；
[0073]-tel：利什曼原虫的总提取物；
[0074]-glu+allo：锑酸葡胺+别嘌呤醇；
[0075]-i.d：皮内；
[0076]-i.n：鼻内；
[0077]-i.p：腹膜内；
[0078]-i.v：静脉内
[0079]-pro：前鞭毛体
[0080]-ama：无鞭毛体
[0081]-w：周
[0082]
实施例1：与参考抗寄生虫治疗(锑酸葡胺+别嘌呤醇)相比，使用利什曼原虫总提取物和麦芽糊精纳米颗粒制成的经鼻途径的治疗性疫苗的可行性研究。
[0083]
1-a材料和方法
[0084]
a)实验模型：
[0085]
8周龄雌性balb/c小鼠，经静脉内注射感染1.2
×
107的婴儿利什曼原虫(l.infantum)无鞭毛体(图1)。10天后(第11天)进行了首次疫苗和抗寄生虫治疗。药物治疗持续10天(直到第21天)。疫苗加强是在初免后15天(第26天)进行的。最后，小鼠在35天后(第61天)被处死。
[0086]
将肝脏细胞、脾脏和骨髓裂解以提取dna。利用寄生虫的细胞色素b基因，通过qpcr方法估计寄生虫载量。每皮克寄生虫dna对应10个寄生虫。估计50ng总dna中的寄生虫数量。此方案如图1所示。
[0087]
b)分组和使用的剂量：
[0088]
每组由8只小鼠组成，分布如下：
[0089]-第1组：未经治疗的感染对照组
[0090]-第2组：化学疗法组(锑酸葡胺+别嘌呤醇)
[0091]-第3组：皮下npl/tel疫苗组
[0092]-第4组：鼻内npl/tel疫苗组
[0093]
施用剂量为：
[0094]-皮下npl/tel：20μg tel+60μg npl，在100μl中
[0095]-鼻内npl/tel：20μg tel+60μg npl，在20μl中
[0096]-化学疗法：腹膜内注射100mgsb/kg/d+口服别嘌呤醇10mg/kg/d，连续10天，在100μl中。
[0097]
c)疫苗制剂
[0098]
这些制剂是由无鞭毛体和前鞭毛体形式的婴儿利什曼原虫(l.infantum)的狗和人株混合物的总提取物和npl制成的。
[0099]
1-b结果
[0100]
a)抗原与npl结合的表征
[0101]
通过sds-page和天然page分析对npl进行了表征。观察到，重量比为1/3时，93％的蛋白抗原与纳米颗粒结合(图2)。结果如图3所示。
[0102]
b)第61天的寄生虫载量
[0103]
第61天观察到，静脉内npl tel免疫组和化学疗法组的寄生虫载量降低是相同的(图3)。肝脏内，所有寄生虫都被消除(观察到该值低于检出阈值)。相比之下，皮下npl tel组未观察到改善。
[0104]
结论：
[0105]
这些结果表明，经鼻途径的治疗性疫苗在降低寄生虫载量方面与本研究中的参照治疗方法一样有效。
[0106]
实施例2：由利什曼原虫总提取物和麦芽糊精纳米颗粒组成的治疗性鼻腔疫苗对小鼠中的内脏性利什曼体病的有效性研究，以及相关免疫响应。
[0107]
2-a材料和方法
[0108]
a)实验模型：
[0109]
8周龄balb/c小鼠，经皮内注射感染1
×
108剂量的婴儿利什曼原虫(l.infantum)无鞭毛体(图4)。10天后(第11天)进行了首次疫苗和抗寄生虫治疗。药物治疗持续10天(直到第21天)。疫苗加强是在初免后15天(第26天)进行的。最后，小鼠在64天后(第90天)被处死。
[0110]
肝细胞、脾脏和骨髓经过裂解以提取dna。利用寄生虫的细胞色素b基因，通过qpcr方法估计寄生虫载量。每皮克寄生虫dna对应10个寄生虫。估计50ng总dna中的寄生虫数量。
[0111]
b)分组和使用的剂量：
[0112]
每组由8只小鼠组成，分布如下：
[0113]-第1组：未经治疗的感染对照组
[0114]-第2组：化学疗法组(+别嘌呤醇)
[0115]-第3组：皮下npl/tel疫苗组
[0116]-第4组：鼻内npl/tel疫苗组
[0117]
施用剂量为：
[0118]-皮下npl/tel：20μg tel+60μg npl，在100μl中
[0119]-鼻内npl/tel：20μg tel+60μg npl，在20μl中
[0120]-化学疗法：腹膜内注射100mgsb/kg/d+口服别嘌呤醇10mg/kg/d，连续10天，100μl。
[0121]
c)疫苗制剂
[0122]
所述制剂是由婴儿利什曼原虫(l.infantum)株的无鞭毛体总提取物和npl制成的。
[0123]
在这项研究中，实验是通过皮内(i.d.)途径实施的，以模拟天然感染媒介白蛉的叮咬。
[0124]
2-b结果
[0125]
a)抗原与npl结合的表征
[0126]
通过sds-page和天然page分析对npl进行了表征。观察到，重量比为1/3时，100％的蛋白抗原与纳米颗粒结合(图5)。结果如图6、7、8所示。
[0127]
b)第90天的寄生虫载量
[0128]
我们观察到，90天后(图6)，经皮下途径用疫苗治疗的小鼠的肝脏、脾脏和mo中以及经鼻疫苗治疗的小鼠的肝脏和mo中，寄生虫载量降低。
[0129]
c)体液和细胞响应：
[0130]
血清总igg测定后，我们观察到，与皮下途径和参照药物治疗相比，经鼻途径施用疫苗制剂改善了体液响应(图7)。此外，只有经鼻途径可以达到igg1/igg2a《1，显示抗击利什曼原虫感染所需的th1型反应。
[0131]
在脾细胞再刺激后，从经鼻途径接种疫苗的小鼠观察到细胞因子th1(inf-y)和th17(il-17a和il-17f)的显著分泌(图8)。
[0132]
结论：
[0133]
治疗性疫苗治疗可以降低被感染动物的寄生虫载量，并且其方式类似于抗寄生虫治疗。
[0134]
通过疫苗治疗观察到的这种降低与体液和细胞型th1免疫响应的诱导直接相关。
[0135]
这种记忆响应还会进一步保护动物免受将来的寄生虫再感染，这使得这种治疗对治疗被感染动物非常有吸引力。
[0136]
实施例3：使用利什曼原虫总提取物和麦芽糊精纳米颗粒的预防性疫苗的可行性研究。
[0137]
3-a设备和方法
[0138]
a)实验模型：
[0139]
8周龄雌性balb/c小鼠，经鼻或皮下接种3次疫苗，每次间隔20天(第1天、第22天、第41天)。然后，它们在末次施用(第50天)后9天经静脉注射感染106的多诺瓦尼利什曼原虫(l.donovani)，)株的前鞭毛体，然后在135天后被执行安乐死(第185天，图9)。
[0140]
b)分组和使用的剂量：
[0141]
每组由8-10只小鼠组成，分布如下：
[0142]-第1组：鼻内盐水组(20μl)
[0143]-第2组：皮下盐水组(50μl)
[0144]-第3组：鼻内tel组(10μg tel，20μl)
[0145]-第4组：皮下tel组(10μg tel，50μl)
[0146]-第5组：鼻内npl/tel组(10μg tel+30μg npl，20μl)
[0147]-第6组：皮下npl/tel组(10μg tel+30μg npl，50μl)
[0148]
在第64天、第110天、第149天和第184天采血以分析血液中的寄生虫载量。这是通过qpcr对寄生虫动质体的dna进行测量的。
[0149]
184天后通过颈椎脱位处死小鼠。在小鼠安乐死后，取出肝脏和脾脏以测定每个这些器官中的寄生虫载量。
[0150]
c)疫苗制剂
[0151]
这些制剂是由多诺瓦尼利什曼原虫(l.donovani lv9)总提取物和npl制成的。
[0152]
3-b结果
[0153]
a)抗原与npl结合的表征：
[0154]
通过天然条件下的page分析对npl进行了表征。观察到，重量比为1/3时，100％的蛋白抗原与纳米颗粒结合(图10)。
[0155]
b)第185天的寄生虫载量
[0156]
疫苗制剂的施用显著地降低了小鼠血液、肝脏和脾脏中的寄生虫载量(图11)。然而，尽管是与npl结合或未结合的总提取物的3次预防性施用，载量仍然较高(器官中寄生虫》108)，这表明这种策略不能防止感染。
[0157]
结论：
[0158]
目前上市的预防性疫苗仍然更具竞争力，单次施用即可获得显著效果。
[0159]
实施例4：使用源自前鞭毛体或无鞭毛体形式的婴儿利什曼原虫的抗原评价治疗性疫苗对小鼠模型中婴儿利什曼原虫(l.infantum)感染的有效性。
[0160]
4-a实验方案：
[0161]
60只balb/c小鼠，经皮下(s.c)注射感染2
×
107的前鞭毛体或无鞭毛体形式的婴
儿利什曼原虫(l.infantum)。10天后，小鼠被分成10组并以下治疗：
[0162]
·
第1组：未治疗
[0163]
·
第2组：参照化学疗法(锑酸葡胺+别嘌呤醇)-第11天-第21天
[0164]
·
第3组：皮下npl/tel pro疫苗
–
第11天初免和第26天加强
–
每剂20μg
[0165]
·
第4组：鼻内npl/tel pro疫苗
–
第11天初免和第26天加强
–
每剂20μg
[0166]
·
第5组：皮下npl/tel ama疫苗
–
第11天初免和第26天加强
–
每剂20μg
[0167]
·
第6组：鼻内npl/tel ama疫苗
–
第11天初免和第26天加强
–
每剂20μg
[0168]
60天后，将5只小鼠安乐死，并测量肝脏、脾脏和骨髓中的寄生虫载量(图1)。其余5只小鼠用2
×
107剂量的寄生虫再感染，并在30天后测量它们的寄生虫载量。
[0169]
此方案总结于图12。
[0170]
4-b结果
[0171]
结果如图13和15所示。
[0172]
第60天的寄生虫载量分析显示，无论抗原来源如何(前鞭毛体或无鞭毛体，图13)，以化学疗法治疗以及经鼻内和皮下施用疫苗治疗的小鼠肝脏内的寄生虫载量显著降低。由前鞭毛体制成并经鼻内施用的npl/tel制剂明显比参照化学疗法更有效。
[0173]
此外，仅在用由经前鞭毛体制成并经鼻内施用的npl/tel制剂治疗的小鼠组中观察到骨髓中寄生虫显著显着降低。
[0174]
动物脾脏中未见显著变化。
[0175]
90天后，在用由前鞭毛体制成并经鼻内施用的npl/tel制剂治疗的小鼠骨髓中观察到了寄生虫载量显著降低(图14)。动物肝脏和脾脏中未观察到显著变化。
[0176]
本研究可以得出np/tel制剂在开发针对利什曼病的治疗性疫苗中具有有效性的结论。此外，使用前鞭毛体作为抗原来源似乎是有效治疗动物的令人感兴趣的策略。
[0177]
实施例5：使用源自无鞭毛体形式的婴儿利什曼原虫(l.infantum)(交叉疫苗接种)的抗原评价治疗性疫苗对小鼠模型中诺瓦尼利什曼原虫(l.donovani)感染的有效性
[0178]
5-a实验方案：
[0179]
40只balb/c小鼠，经皮下(s.c)注射感染2
×
107的多诺瓦尼利什曼原虫(l.donovani)。10天后，小鼠被分成10组并如下治疗：
[0180]
·
第1组：未治疗
[0181]
·
第2组：参照化学疗法(锑酸葡胺+别嘌呤醇)-第11天-第21天
[0182]
·
第3组：皮下npl/tel疫苗
–
第11天初免和第26天加强
–
每剂20μg
[0183]
·
第4组：鼻内npl/tel疫苗
–
第11天初免和第26天加强
–
每剂20μg
[0184]
90天后，将小鼠安乐死，并测量肝脏、脾脏和骨髓中的寄生虫载量。
[0185]
5-b结果
[0186]
结果如图16所示。
[0187]
90天后，在由婴儿利什曼原虫(l.infantum))无鞭毛体制成并经鼻内和皮下施用的npl/tel制剂治疗的小鼠脾脏中观察到了多诺瓦尼利什曼原虫(l.donovani)寄生虫载量显著降低(图5)。
[0188]
本研究可以得出np/tel制剂在开发针对不同寄生虫株的经鼻和/或皮下途径的治疗性疫苗中具有有效性的结论。这些结果从开发针对这种寄生虫的广谱治疗性疫苗的观点
出发是有前景的。
[0189]
实施例6：在被寄生虫自然感染的狗中以及将其与用参照化学疗法治疗的狗比较，使用源自被杀死的目标寄生虫的抗原评价治疗性疫苗对婴儿利什曼原虫(l.infantum))感染的有效性。
[0190]
6-a实验方案
[0191]
选择了30只自然感染(至少)婴儿利什曼原虫(l.infantum))并处于感染ii期(leishvet.org)的饲养狗。这些狗根据其治疗被随机分成3组，每组10只狗：
[0192]
·
第1组：米替福辛组(2mg/kg/d，持续28天)
[0193]
·
第2组：鼻内npl/tel疫苗
–
第0周初免和第4周加强
–
每剂100μg
[0194]
·
第3组：米替福辛+鼻内npl/tel疫苗结合组
[0195]
在第0周和第4周，通过皮肤活检的显微镜分析评价了皮肤感染。寄生虫的存在证实了皮肤感染。
[0196]
在第0周、第2周、第4周、第6周，通过采用全身体征(淋巴结病、冷漠、腹泻)、皮肤粘膜体征(脱发、角化过度、脓皮病、溃疡、血管炎、甲弯曲(onychogryphosis)、结节)和眼部体征(结膜炎、角膜炎)，评价了动物的临床评分。对于每个参数，根据观察到的病症严重性给出评分(从0到4)。临床评分是这些不同评分的总和。
[0197]
在第0周和第4周，通过对胸骨的骨髓样本的qpcr分析，评价了寄生虫载量。
[0198]
6-b结果
[0199]
结果如图18、19和20所示。
[0200]
在第1组(米替福辛)中-10/10只狗患有内脏利什曼病(vl)，6/10只狗患有皮肤损伤(cl)。
[0201]
在第2组(鼻腔疫苗)中-10/10只狗患有内脏利什曼病(vl)，9/10只狗患有皮肤损伤(cl)。
[0202]
在第3组(米替福辛+鼻疫苗)中-10/10只狗患有内脏利什曼病(vl)，6/10只狗患有皮肤损伤(cl)。
[0203]
a)皮肤感染
[0204]
在第1组中，6只感染并接受米替福辛治疗的狗中，有5只皮肤中未再检测到寄生虫；在第2组中，9只感染并接种疫苗的狗中，有7只皮肤中未再检测到寄生虫；在第3组中，6只感染并接受治疗且接种疫苗的狗中，有4只皮肤中未再检测到寄生虫。在该阶段，鼻腔疫苗在治疗皮肤利什曼病方面似乎与化学疗法一样有效(图18)
[0205]
b)寄生虫载量
[0206]
在米替福辛治疗组中，3只狗的寄生虫载量降低，而5只狗增加，1只狗死于治疗毒性(肾衰竭)。在疫苗接种组中，8只狗的寄生虫载量降低(其中4只似乎清除了寄生虫)，而2只狗的寄生虫载量略有升高。最后，在接受治疗且接种疫苗组中，6只狗的寄生虫载量降低(其中一只似乎清除了寄生虫)，而一只狗感染加重，2只没有显示任何敏感变化(图19)。
[0207]
在该阶段，鼻腔疫苗似乎比化学疗法更有效地降低骨髓中的寄生虫载量。
[0208]
c)临床评分
[0209]
在所研究的3个组中，可以观察到总体临床评分明显下降。该疫苗在改善动物的总体健康状况方面与化学疗法一样有效(图20)。
[0210]
这项研究表明，在皮肤和内脏利什曼病方面，对于治疗感染婴儿利什曼原虫的狗，疫苗接种至少与米替福辛一样有效。此外，两次鼻腔施用均未引起副作用，并且耐受性良好。相之，28例口服施用米替福辛引起明显的副作用(腹泻、呕吐、肾衰竭)。

技术特征：
1.一种治疗性疫苗，其用于治疗携带不影响中枢神经系统的疾病或细胞内病原体的个体，所述疫苗包含至少一种含有阳离子多糖核的阳离子纳米颗粒和特异性抗原，其特征在于，所述抗原对所述病原体或所述疾病具有特异性。2.根据权利要求1所述的治疗性疫苗，其中所述特异性抗原来自引起利什曼病的病原体。3.根据权利要求2所述的治疗性疫苗，其中所述抗原对婴儿利什曼原虫(leishmania infantum)株具有特异性。4.根据权利要求1所述的治疗性疫苗，其中所述特异性抗原是肿瘤抗原。5.根据前述权利要求中任一项所述的治疗性疫苗，其中所述多孔阳离子多糖核是交联的。6.根据前述权利要求中任一项所述的治疗性疫苗，其中所述多孔阳离子多糖核载有阴离子磷脂。7.根据权利要求6所述的治疗性疫苗，其中所述阴离子磷脂选自二酰磷脂酰甘油、二酰磷脂酰丝氨酸或二酰磷脂酰肌醇。8.根据权利要求7所述的治疗性疫苗，其中所述阴离子磷脂是二棕榈酰磷脂酰甘油。9.一种疫苗组合物，其包含含有阳离子多糖核的阳离子纳米颗粒和对无法通过血脑屏障的病原体或外周疾病具有特异性的抗原，应用于治疗所述疾病或所述病原体引起的疾病。10.根据权利要求9所述的疫苗组合物，用于根据权利要求9所述的应用，其中所述抗原来自利什曼原虫(leishmania)物种。11.根据权利要求10所述的疫苗组合物，用于根据权利要求10所述的应用，其中所述抗原来自婴儿利什曼原虫(leishmania infantum)。12.根据权利要求9所述的疫苗组合物，用于根据权利要求9所述的应用，其中所述抗原来自寄生虫。13.根据权利要求9所述的疫苗组合物，用于根据权利要求8所述的应用，其中所述抗原来自病毒。14.根据权利要求9所述的疫苗组合物，用于根据权利要求9所述的应用，其中所述抗原来自细菌。15.根据权利要求9所述的疫苗组合物，用于根据权利要求9所述的应用，其中所述抗原来自真菌。16.根据权利要求9至15中任一项所述的疫苗组合物，其以适于粘膜或注射施用的形式使用。

技术总结
本发明涉及治疗性疫苗领域。特别涉及一种治疗性疫苗，其用于治疗携带不影响脑的疾病或病原体的个体，例如用于治疗利什曼病、癌症或任何病原体感染。任何病原体感染。任何病原体感染。


技术研发人员：O
受保护的技术使用者：瓦希纳诺公司
技术研发日：2021.09.24
技术公布日：2023/8/24