针对流感和SARS冠状病毒2具有免疫原性的组合物、其制备和使用方法与流程

针对流感和sars冠状病毒2具有免疫原性的组合物、其制备和使用方法
1.本国际专利申请要求于2020年12月17日提交的美国临时专利申请号63/127,062和于2020年12月28日提交的美国临时专利申请号63/131,121的权益，这些临时专利申请的全部内容通过引用并入以用于所有目的。
技术领域
2.本发明总体上涉及用于引发针对sars-cov-2感染或sars-cov-2和流感感染的免疫应答的免疫原性组合物的领域。


背景技术：

3.2019年出现的新型冠状病毒(严重急性呼吸综合征冠状病毒2，或sars-cov-2)仍然是一场紧迫的公共卫生危机。随后的流行有两种可能性：(1)sars-cov-2将在目前许多国家实施的大规模干预措施之后从人类中消失；(2)sars-cov-2可能成为一种普通感冒病毒，并且像其他人类冠状病毒一样继续在人类中传播。自从2002/2003年的sars冠状病毒以来，有三种冠状病毒跨越了物种屏障并且感染了人类。有理由相信，在将来，可能会出现来自动物来源的其他冠状病毒，并且这些冠状病毒也可能会感染人类。需要快速响应和有效的疫苗以用于目前正在发生的sars-cov-2大流行病和未来新出现的冠状病毒。进一步地，人类对导致大流行病的sars-cov-2没有预先存在的免疫力，这导致全球范围内的流动性和死亡率显著上升。急需用于预防由sars-cov-2引起的感染的疫苗。还需要用于预防sars-cov-2和流感病毒的组合疫苗。
4.开发针对sars-cov-2的有效疫苗的新策略是必要的，所述疫苗具有提供广泛交叉保护活性的属性，并且可以与流感病毒免疫原性组合物共同施用。
5.对包括在本说明书中的文件、法案、材料、装置、条款等的任何讨论都不应被视为承认：任何或所有这些事项因为其在本技术的每项权利要求的优先权日之前已存在而形成现有技术基础的一部分，或是与本公开有关的领域中的公知常识。
6.在整个本说明书中，词语“包含”或者如“包括”或“含有”等变体将被理解为是意味着包括所陈述的元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他的元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组。
7.发明概述
8.本发明的目的在于提供一种安全且有效的活减毒冠状病毒。
9.本发明的目的还在于提供生成活减毒冠状病毒疫苗的方法。
10.本发明的目的还在于提供针对sars-2-cov-2和流感病毒具有免疫原性的组合物。
11.本发明的进一步目的在于提供在哺乳动物中引发针对冠状病毒的免疫应答的方法。
12.本发明的进一步目的在于提供在哺乳动物中引发针对冠状病毒和流感病毒的免疫应答的方法。
13.公开了针对sars-cov-2具有免疫原性的组合物以及针对sars-cov-2和流感病毒具有免疫原性的共组合物及其使用方法。sars-cov-2免疫原性组合物包括由表达流感病毒抗原和sars-cov-2抗原的基因修饰流感病毒制备的嵌合病毒。共组合物包括与活减毒甲型或乙型流感病毒(laiva/b)组合的嵌合病毒，所述活减毒流感病毒由于缺失病毒毒力元件ns1(非结构蛋白1)(delns1)的修饰而被减毒。
14.嵌合病毒建立在laiva/b的骨架上。由delns1活减毒甲型或乙型流感病毒(laiva/b)产生并且表达sars-cov-2抗原(cov2ag)的嵌合病毒毒株在本文中通常被称为a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag，具有名称不同的特异性嵌合病毒，这取决于正被表达的cov-2ag以及流感病毒骨架，即“a-毒株”或“b-毒株”是指特异性甲型或乙型流感病毒毒株。由delns1 laiva产生并且表达cov2ag的嵌合病毒毒株在本文中通常被称为-a-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag。由delns1 laivb产生并且表达cov2ag的嵌合病毒毒株在本文中通常被称为b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag。优选的cov2ag是sars-cov-2rbd(受体结合结构域)。因此，表达sars-cov-2-rbd的嵌合病毒通常被称为a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-rbd。
15.优选的基于甲型流感骨架的嵌合疫苗毒株包括ca04-delns1-sars-cov-2-rbd；hk68-delns1-sars-cov-2-rbd；4801-delns1-sars-cov-2-rbd和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd毒株。在一个实施方案中，优选的laiv骨架是传代适应甲型/加利福尼亚/04/2009毒株(a/ca/04/2009；ca04)，其包括病毒毒力元件ns1(非结构蛋白1)的缺失(在本文中被称为为ca04-delns1)，并且优选地包括位于np(d101n)和nep(e95g)基因中的两个适应性突变。
16.优选的laivb骨架是delns1-b8038(atcc保藏号为pta-125209)，并且在本文中与delns1-8038b可互换地提及。特别优选的基于乙型流感病毒骨架的嵌合病毒毒株是b8038-delns1-sars-cov-2-rbd。
17.公开了包括病毒的混合物的免疫原性组合物，所述混合物使用表达sars-cov-2抗原的基于流感的病毒和表达流感的各种血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)的基于流感的病毒，在下文中公开了共组合物。在这些实施方案中，免疫原性组合物包括表达如本文所公开的sars-cov-2抗原的基于流感的病毒和表达流感的各种血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)的基于流感的病毒的混合物。所公开的混合物针对流感病毒和sars-cov-2具有免疫原性。
18.在一个实施方案中，共组合物包括a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag和活减毒流感病毒(laiv)a(“laiva”)和/或活减毒流感病毒(laiv)b“(laivb”)，并且在任选的实施方案中，其中laiv a/b被工程化以表达流感的各种血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)。laiva和laivb由于缺失病毒毒力元件ns1(非结构蛋白1)(delns1)的修饰而是减毒病毒。优选来自维多利亚(victoria)谱系的laivb，其具有病毒毒力元件ns1(非结构蛋白1)的缺失。laivb额外地在区段3和5-7中包括如下的适应性核苷酸突变(am)：pa(t210c)、na t(1424c)、np(c182t)和m(a281g)。具有适应性突变的laivb在本文中被称为am/laivb/delns1。am/laivb/delns1优选地不能在干扰素活性细胞(interferon-competent cell)(例如，a549细胞)中复制，并且优选地在低温如低于37℃的温度下复制，更优选地在30℃至33℃之间的温度下复制，并且最优选地在约33℃的温度下复制。优选的laivb是保藏在美国典型培养物保藏中心(the american type culture collection)的deins1-b8038hk，并且
b8038hk与delns1-b8038组合。
23.还提供了通过将药物组合物施用于有此需要的受试者来治疗所述受试者的方法。所述方法可以是疫苗方案。因此，在一些实施方案中，将组合物施用于受试者，以提供针对单独的或与流感病毒组合的sars-cov-2的预防性或治疗性保护。通过皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、肌内(i.m.)、静脉内(i.v.)、口服或鼻内施用；或通过注射或吸入，将根据本文公开的方法生成的所公开的嵌合laiv a/b-sars-cov-2病毒(其被例示为例如ca04-delns1-cov2ag或delns1-b8038)单独或与所公开的laiva和/或laivb组合施用于有此需要的哺乳动物。在其他方面，毒株经鼻内施用。将含有嵌合delns1-cov2ag的组合物施用于需要针对sars-cov-2-感染的保护性免疫的哺乳动物。
附图说明
24.图1a和1b示出了delns1-mers-rbd和delns1-mers-n laiv的构建。
25.图2a-2c通过接种mers冠状病毒的致死性攻击(2mld
50
)对dpp4转基因小鼠的保护。
26.图3a-3c通过接种mers冠状病毒的致死性攻击(10mld
50
)对dpp4转基因小鼠的保护。
27.图4a和4b示出了mers冠状病毒的受体结合结构域的序列(seq id no:27)(图4a)和sars-cov-2的受体结合结构域的序列(seq id no:28)(图4b)。
28.图5示出了将sars-cov-2克隆到delns1 laiv载体中。
29.图6是示出对delns1-sars-cov-2-rbd疫苗毒株中的ns区段和rbd插入物的验证的印迹。
30.图7示出了sars-cov-2-rbd在delns1-sars-cov-2-rbd活减毒病毒感染的mdck细胞中的表达。
31.图8示出了保护ace2转基因小鼠免受由sars-cov-2感染引起的疾病。
32.图9a是通过反向遗传学生成8308b-delns1乙型流感病毒的图示。将含有delns1区段和其他七个衍生自乙型/香港/8038/2011(维多利亚)病毒的基因组区段的phw2000质粒转染到293t/mdck细胞混合物中。将拯救的病毒在mdck细胞中传代直到病毒滴度稳定。图9b示出了生长适应delns1-b8308病毒中的已鉴定的适应性突变。已鉴定出四种突变：pa(t210c)、na t(1424c)、np(c182t)和m(a281g)。图9c是flu bdelns1-sars-rbd laiv疫苗的构建的图示。将衍生自sars-cov2感染患者的临床样品的rbd克隆到乙型流感delns1 laiv载体中。将重组ns区段与乙型流感(乙型/hk/8038/2011)的其余七个区段(pb1、pb2、pa、np、ha、na和m)一起在反向遗传载体中克隆，并且转染到293t/mdck细胞混合物中。将拯救的病毒首先在mdck细胞中传代，然后在鸡含胚卵中传代。
33.发明详述
34.i.定义
35.材料
36.公开了材料、组合物和组分，它们可以用于所公开的方法和组合物、可以与所公开的方法和组合物结合使用、可以在所公开的方法和组合物的制备中使用或是所公开的方法和组合物的产物。本文公开了这些和其他材料，并且应当理解，当公开了这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可以不明确地公开这些化合物的每种不同的单个和集体的组
合和排列的具体引用，但在本文中每种组合和排列都得到了具体的考虑和描述。因此，如果一类分子a、b和c被公开，以及一类分子d、e和f以及组合分子a-d的实例被公开，那么即使没有单独列举每一个，每一个也得到了单独和共同的考虑。因此，在这一实例中，组合a-e、a-f、b-d、b-e、b-f、c-d、c-e和c-f中的每一个都得到了具体的考虑，并且应该被认为是从a、b和c；d、e和f；以及实例组合a-d的公开内容中公开的。同样地，这些的任何子集或组合也得到了具体的考虑和公开。因此，例如，a-e、b-f和c-e的亚组得到了具体的考虑，并且应该被认为是从a、b和c；d、e和f；以及实例组合a-d的公开内容中公开的。进一步地，如上文考虑和公开的材料、组合物、组分等中的每一种也可以具体地和独立地被包括或被排除在此类材料的任何组、亚组、列表、集合等之外。这些概念适用于本技术的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以进行的多个额外步骤，则应当理解，这些额外步骤中的每一个可以与所公开方法的任何具体实施方案或实施方案的组合一起进行，并且每种此种组合都得到了具体的考虑并且应当被认为是公开的。
37.如本文所用，术语“佐剂”是指增强免疫应答的化合物或混合物。
38.如本文所用，“减毒”是指减弱疾病的媒介(病原体)的程序。减毒病毒是减弱的、不太活跃的病毒。针对病毒性疾病的疫苗可以由病毒的减毒、低毒性毒株制成，所述病毒是能够刺激免疫应答并产生免疫力但不导致疾病或不太严重的疾病的病毒。减毒可以使用本领域技术人员已知的方法通过对病原体进行化学处理、通过辐射或通过遗传修饰来实现。减毒可能导致增殖降低、对宿主细胞的附着降低或者毒素的产生或强度降低。
39.如本文所用，“老年人”是指65岁以上的受试者。
40.如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”意指足以治疗、抑制或减轻正被治疗的疾病状态的一种或多种症状或足以以其他方式提供期望药理学效果的用量。确切用量将取决于多种因素，如受试者因变量(例如，年龄、免疫系统健康等)、疾病和受试者年龄。
41.如本文所用，术语“基因”是指核酸(例如，dna或rna)序列，其包括产生多肽、rna(例如，包括但不限于mrna、trna和rrna)或前体所必需的编码序列。多肽、rna或前体可以由全长编码序列或其任何部分编码。所述术语还涵盖结构基因的编码区和位于邻近编码区的5”末端和3”末端上与任一末端相邻约1kb距离的序列，使得所述基因对应于全长mrna的长度。术语“基因”涵盖基因的cdna和基因组形式二者，它们可以由dna或rna制备。基因的基因组形式或克隆可以含有被称为“内含子”或“间插区域”或“间插序列”的非编码序列中断的编码区。内含子是被转录成核rna(hnrna)的基因区段；内含子可以含有调控元件，如增强子。内含子从核转录物或初级转录物中去除或“剪接出来”；因此在信使rna(mrna)转录物中不存在内含子。mrna在翻译期间发挥作用，以指定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。
42.如本文所用，“免疫原性组合物”意指所述组合物可以诱导免疫应答并且因此具有抗原性。所谓“免疫应答”意指免疫系统的任何反应。这些反应包括改变生物体免疫系统响应抗原的活性，并且可能涉及例如抗体产生、细胞介导免疫的诱导、补体活化或免疫耐受的发展。
43.如本文所用，“鼻腔施用”是指任何形式的施用，由此将活性成分推进或以其他方式引入到受试者的鼻腔通道中，以使其接触鼻腔空腔的呼吸上皮，并从中被吸收到系统循环中。鼻腔施用还可以涉及接触嗅觉上皮，嗅觉上皮位于鼻腔空腔的顶部，鼻腔空腔介于中央鼻中隔和每个主要鼻腔通道的侧壁之间。直接围绕嗅觉上皮的鼻腔空腔区域没有气流。
因此，通常必须采用专业化的方法来实现通过嗅觉上皮的显著吸收。
44.如本文所用，“口服”、“肠内”、“经肠内”、“经口腔”、“非胃肠外”、“不经胃肠外”等是指通过沿着消化道的途径或模式将化合物或组合物施用于个体。组合物的“口服”施用途径的实例包括但不限于从口中吞咽液体或固体形式的疫苗组合物、通过鼻空肠管或胃造口术管施用疫苗组合物、疫苗组合物的十二指肠内施用和直肠施用，例如，使用释放本文描述的活细菌疫苗毒株的栓剂。
45.如本文所用，“哺乳动物”包括人和非人二者，并且包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠、牛、马和猪。
46.如本文所用，“局部施用”是指将药剂应用于皮肤外表面或粘膜(包括鼻、肺和口的表面膜)，使得药剂穿过皮肤外表面或粘膜并且进入下层组织。局部施用可以导致药剂在皮肤和周围组织中的有限分布，或者当通过血流将药剂从治疗区域中去除时，导致药剂的系统性分布。在优选的形式中，药剂通过透皮递送来递送，例如使用透皮贴剂来递送。透皮递送是指药剂透过皮肤(角质层和表皮)的扩散，皮肤充当很少有制剂能够穿透的屏障。相比之下，真皮对许多溶质和药物的吸收是可渗透的，并且局部施用因此更容易通过被磨损或被以其他方式剥去表皮以暴露真皮的皮肤进行。通过完整皮肤的吸收可以通过在应用于皮肤之前(称为涂擦的过程)将活性剂与油状媒介物(如例如remington’s pharmaceutical sciences,current edition,gennaro et al.,eds.中所描述的例如乳膏剂、润肤剂、渗透增强剂等)组合来增强。
47.如本文所用，术语“肽”是指一类由化学地结合在一起的氨基酸构成的化合物。一般而言，氨基酸经由酰胺键(conh)化学地结合在一起；然而，氨基酸可以通过本领域已知的其他化学键结合在一起。例如，氨基酸可以通过胺键结合。如本文所用，肽包括氨基酸的寡聚体以及小肽和大肽，包括多肽。
48.如本文所用，“嵌合病毒”是指包括来自多于一种类型的病毒毒株的病毒rna的病毒毒株。
49.如本文所用，与相应的野生型或亲本多核苷酸或多肽的多核苷酸或多肽序列相比，“变体”、“突变体”或“突变”多核苷酸或多肽含有至少一种多核苷酸或肽序列改变。突变可以是天然的、人为的或意外的。突变包括取代、缺失和插入。
50.ii.组合物
51.提供了包括活减毒嵌合病毒的免疫原性组合物，其基于含有缺失的ns1区段(delns1)的delns1活减毒甲型或乙型流感病毒(laiva或laiv b)，并且被工程化以表达来自sar-cov-2的一种或多种抗原(在本文中为cov2ag)代替缺失的ns1区段。
52.所述组合物包括单独或与laiva和/或laivb一起作为共组合物的嵌合病毒，在一些实施方案中，所述嵌合病毒被工程化以表达流感的各种血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)。流感病毒被分类为三种类型：甲型、乙型和丙型。甲型和乙型流感病毒的基因组由八个rna区段组成，而丙型流感病毒只有七个rna。甲型和乙型流感病毒都含有两种主要的表面糖蛋白：血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)。丙型流感病毒只有一种主要的表面糖蛋白：hef(血凝素-酯酶融合)。甲型流感病毒基于其血凝素(h)和神经氨酸酶(n)被分成亚型。有18种不同的血凝素亚型(h1-h18)和11种不同的神经氨酸酶亚型(n1-n11)。另参见russell,et al.,tredns in microbiol.26(10):p841-853doi:https://doi.org/10.1016/
j.tim.2018.03.005(2018)，所述文献具体地通过引用以其整体并入本文。另参见mcauley,et al.,front microbiol.10:39,doi:10.3389/fmicb.2019.00039(2019)，所述文献具体地通过引用以其整体并入本文。
53.以下的甲型流感亚型已影响到人类：h1-h3、h5-h7、h9和h10；n1、n2、n6-n9。如今，h1n1和h3n2引起季节性流行病。乙型流感病毒没有被划分为亚型，但代替地进一步被分类为两个谱系：乙型/山行(yamagata)和乙型/维多利亚。与甲型流感病毒相似，乙型流感病毒可以进一步被分类为具体的分支和亚分支。通过对自然产生的变体和抗体选择的逃逸变体进行序列分析，研究了乙型流感病毒ha的抗原结构。参见，例如，wang,et al.,journal of virology,82(6):3011-3020；doi:10.1128/jvi.02477-07(2008)。编码流感病毒血凝素和神经氨酸酶的核酸序列以及蛋白质序列是已知的，例如在以下的genbank编号处：baa01280(甲型/野鸭/亚伯达/35/1976)；cba17655甲型/wdk/jx/12416/2005)；abv25634(甲型/猪/爱荷华/15/1930)、aam75158(甲型/波多黎各/8/1934(西奈山))；abd62843(甲型/bellamy/1942)；aak70453(甲型/香港/1035/1998)；acp41105(甲型/加利福尼亚/04/2009)等。
54.laiva/b可以被工程化以表达来自不同的流感毒株的na、ha或hef。可以将嵌合sars-cov-2病毒包括在用于施用的配制剂中、包括在载剂中，并且在一些实施方案中，可以将其与佐剂组合。佐剂可以用作载剂。在一些实施方案中，含有所公开的嵌合病毒毒株的免疫原性组合物不包括佐剂。在一些优选的实施方案中，组合物不包括全长sars-cov-2刺突蛋白或者全部/完整或减毒sars-cov-2。
55.所公开的嵌合病毒毒株基于delns1活减毒甲型或乙型流感病毒(laiva或laivb，其可与laiva/b互换地使用)平台，所述平台能够从delns1laiva/b基因组的ns区段的ns1位置表达外源抗原。组合物具有免疫原性，因为它们可以用来引发针对由laiva/b编码的一种或多种cov2ag的免疫应答，或针对基于na或ha中的工程化的一个或多个流感毒株的免疫应答。laiva/b由于ns1区段的编码区的缺失(delns1)以及改进其在疫苗产生系统中的生长的适应性突变(am)，具有改进的安全性。当被工程化以表达来自sars-cov-2的抗原时，优选的具有基于传代适应a/ca/04/2009(ca04)病毒的这些突变组合的嵌合甲型流感病毒在本文中被称为ca04-delns1-cov2ag。当被工程化以表达来自sars-cov-2的抗原时，优选的具有基于8308b-delns1病毒毒株的这些突变组合的乙型流感病毒在本文中被称为8308b-delns1-cov2ag。
56.a.活减毒嵌合病毒
57.所公开的嵌合病毒可以含有各种laiv骨架，骨架含有缺失的ns1区段(delns1)，被工程化以表达来自新型冠状病毒的一种或多种抗原(在本文中为cov2ag)。由delns1活减毒甲型或乙型流感病毒(laiva/b)产生并且表达cov2ag的所得嵌合病毒在本文中通常被称为delns1-a/bsars-cov-2-cov2ag。
58.(i)来自甲型流感的laiv骨架
59.在一些实施方案中，用来制备所公开的嵌合sars-cov-2的骨架病毒优选地是活减毒甲型流感病毒毒株。示例性毒株包括ca04以及a/wsn/33和a/pr/8/34。可以用衍生自a/hk/4801/2014(h3n2)或a/hk/2019(h1n1)的毒株的ha和na，在ca04-delns1的内部基因骨架中构建本文例示的hk4801-delns1-sars-cov-2-rbd和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd。
60.(a)ca04-delns1
61.优选的laiv骨架是公布号20190125858中所公开的突变流感病毒，所述文献通过引用并入本文。简而言之，冷适应流感病毒ca04-delns1基于2009年h1n1流感毒株，并且因此包括毒力因子活性的缺失、第一组一个或多个突变以及第二组或第三组一个或多个突变，所述第一组一个或多个突变在不存在所述毒力因子活性的情况下在37℃下赋予复制，并且所述第二组或第三组一个或多个突变在低于35℃的温度下赋予复制。毒力因子活性的缺失可以包括毒力因子基因的至少一部分的缺失。此种缺失可以是延伸超过突变病毒的ns1区段的核苷酸57至528的ns1基因的至少一部分的缺失。
62.第一组一个或多个点突变赋予复制能力，并且可以位于突变h1n1流感病毒的m区域的外部(例如，h1n1流感病毒基因组中的g346a(蛋白质序列中的d101n)突变)。
63.第二组一个或多个突变可以包括一个或多个点突变，如h1n1流感病毒基因组中的t261g(蛋白质序列中的l79v)或a310g(蛋白质序列中的e95g)突变，这些位置已被发现支持冷适应delns1病毒复制。所公开的突变流感病毒还可以包括在低于35℃的温度下赋予复制的第三组一个或多个突变。这些可以包括与第二组突变不同的一个或多个点突变，如h1n1流感病毒基因组中的t261g或a310g突变。相对于35℃或更低的温度、37℃或更高的温度，突变流感病毒可能会示出降低的复制能力。
64.(b)a/wsn/33-delns1和a/pr/8/34-delns1
65.laiv骨架也可以衍生自zheng,et al.,j.virol.,89:10273
–
10285(2015)中所描述的a/wsn/33和a/pr/8/34毒株。这些病毒毒株包括ns1基因的缺失，并且病毒rna(vrna)的m区段的3”非编码区(ncr)中的适应性取代a14u(在delns1病毒的若干次传代之后获得)显著增强了delns1病毒的复制。m-a14u取代支持pr8 delns1病毒在vero和mdck细胞中复制，而没有这种取代的pr8 delns1病毒不能增殖。
66.(ii)来自乙型流感的laiv骨架
67.在一些实施方案中，用来制备所公开的嵌合sars-cov-2的骨架病毒采用活减毒乙型流感病毒毒株。
68.乙型流感病毒基因组各自包括八个负义单链病毒rna(vrna)区段。两种病毒的最小vrna区段都编码非结构ns1蛋白。乙型流感病毒从病毒ns区段的未剪接转录物中表达281个氨基酸的非结构蛋白，其被称为ns1-b。用来制备所公开的嵌合病毒的laivb优选地包括来自aivb基因组的ns1的编码区的完全缺失。am/laivb/delns1可以具有山行或维多利亚谱系。在1988-1989年期间，在用感染后雪貂血清的血凝素抑制测试中识别了两种高度不同的乙型流感抗原变体。这些病毒在抗原上与最近的参考毒株乙型/维多利亚/2/87或1988年5月在日本分离的变体乙型/山行/16/88相关。在1988-1989年冬季的流行病期间，在美国分离的所有乙型流感病毒在抗原上都与乙型/维多利亚/2/87相关。乙型流感病毒的不同毒株公开在the influenza research database.zhang,et al.,nucleic acids research,volume 45(d1):d466
–
d474,2017中。
69.乙型流感病毒的八个区段按长度递减的顺序编号(表1)。区段1、3、4和5每个区段只编码一种蛋白质：pb2、pa、ha和np蛋白质。
70.表1.乙型流感病毒区段及其编码的蛋白质
[0071][0072][0073]
所有流感病毒都在区段2上编码聚合酶亚基pb1。
[0074]
pb2(seq id no:1)
[0075]
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[0076]
pb1(seq id no:2)
[0077]
agcagaagcggagcctttaagatgaatataaatccttattttctcttcatagatgtgcccgtacaggcagcaatttcaacaacattcccatacactggtgttccccctt
[0078]
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[0079]
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[0080]
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[0081]
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[0082]
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[0083]
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[0084]
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[0085]
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[0086]
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[0087]
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[0088]
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[0089]
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[0090]
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[0091]
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[0092]
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[0093]
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[0094]
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[0095]
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[0096]
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[0097]
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[0098]
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[0099]
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[0100]
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[0101]
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[0102]
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[0103]
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[0104]
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[0105]
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[0106]
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[0107]
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[0108]
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[0109]
pa(seq id no:3)
[0110]
agcagaagcggtgcgtttgatttgtcataatggatacttttattacaagaaacttccagactacaataatacaaaaggccaaaaacacaatggcagaatttagtgaagatcctgaattgcaaccagcaatgctattcaatatctgcgtccatctagaggtttgctatgtaataagtgacatgaattttcttgacgaagaaggaaaagcacatatagcattagaaggacaagggaaagaacaaaacttgagaccacaatatgaagtaattgagggaatgccaagaaccatagcatggatggtccagagatccttagctcaagagcatggaatagagactcccaagtatctggctgatttgtttgattataaaaccaaaagatttatagaagttggaataacaaaaggattggctgatgattacttttggaaaaagaaagaaaagttgggaaatagcatggaactgatgatattcagctacaatcaagactactcgttaagtaatgaatcctcattggatgaggaagggaaagggagagtgctaagcagactcacagaacttcaggctgagttaagtctgaaaaacttatggcaagttctcataggagaggaagatgttgaaaagggaattgattttaaacttggacaaacaatatctagactaagggatatatctgttccggctggtttttccaattttgaaggaatgaggagctacatagacaatatagacccaaaaggagcaatagagagaaatctagcaaggatgtctcccttagtatcagtcacacctaaaaagttaacatgggaggacctaagaccgatagggcctcacatttatgaccatgagctaccagaagttccatataatgcctttcttctaatgtctgatgaactgggactggccaatatgactgagggaaaatccaaaaaaccgaagacattagccaaagaatgtctagaaaagtactcaacactacgggatcaaactgacccaatattaataatgaaaagcgaaaaagctaacgaaaatttcctatggaagctttggagagactgtgtaaacacaataagtaatgaggaaacaagtaacgagttacagaaaaccaattatgccaaatgggctacaggggacggattaacataccagaaaataatgaaagaagtagcaatagatgacgaaacaatgtgccaagaagagcctaaaatccctaacaaatgtagagtggctgcttgggttcaaacagagatgaatctattgagcactctgacaagtaaaagagctctggacctaccagaaatagggccagacatagcacccgtggagcatgtaggaagtgaaagaaggaaatactttgttaatgaaatcaactactgtaaggcctctacagttatgatgaagtatgtgctttttcacacttcattgttgaatgaaagcaatgccagcatgggaaaatacaaagtaataccaataaccaatagagtagtaaatgaaaaaggagaaagtttcgacatgctttacggtctagcggttaaaggacaatctcatctgaggggagatactgatgttgtaacagttgtaactttcgaatttagtggtacagatccaagagtggactcaggaaagtggccaaaatatactgtgtttaggattggctccctatttgtgagtgggagggaaaaatctg
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[0111]
ha(seq id no:4)
[0112]
agcagaagcagagcattttctaatatccacaaaatgaaggcaataattgtactactcatggtagtaacatccaatgcagatcgaatctgcactgggataacatcgtcaaactcaccacatgtcgtcaaaactgctactcaaggggaggtcaatgtgactggtgtaataccactgacaacaacacccaccaaatctcattttgcaaatctcaaaggaacagaaaccagagggaaactatgcccaaaatgccccaactgcacagatctggacgtagccttgggcagaccaaaatgcacgggaaaaataccctcggcaagagtttcaatactccatgaagtcagacctgttacatctgggtgctttcctataatgcacgacagaacaaaaattagacagctgcctaaccttctccgaggatacgaacatatcagattatcaactcataacgttatcaatgcagaaagtgcaccaggaggaccctacaaaattggaacctcagggtcttgccctaacgttaccaatggaaacggatttttcgcaacaatggcttgggccgtcccaaaaaacgacaaaaacaaaacagcaacagatccattaacaatagaagtaccatacatttgtacagaaggagaagaccaaattaccgtttgggggttccactctgataacgagatccaaatggcaaagctctatggggactcaaagccccagaagttcacctcatctgccaacggagtgaccacacattacgtttcacagattggtggcttcccaaatcaaacagaagacggaggactaccacaaagtggtagaattgttgttgattacatggtacaaaaatctgggaaaacaggaacaattacctatcaaagaggtattttattgcctcaaaaggtgtggtgcgcaagtggcaggagcaaggtaataaaaggatccttgcctttaattggagaagcagattgcctccacgaaaaatacggtggattaaacaaaagcaagccttactacacaggggaacatgcaaaggccataggaaattgcccaatatgggtgaagacacccttgaagctggccaatggaaccaaatatagacctcctgcaaaactattaaaggaaaggggtttcttcggagctattgctggtttcttagaaggaggatgggaaggaatgattgcaggttggcacggatacacgtcccatggggcacatggagtagcggtggcagcagaccttaagagcactcaagaggccataaacaagataacaaaaaatctaaactctttgagtgagctggaagtaaagaatcttcaaagactaagcggtgccatggatgaactccacaacgaaatactagaactagacgagaaagtagatgatctcagagctgatacaataagctcacaaatagaactcgcagtcctgctttccaatgaaggaataataaacagtgaagatgaacatctcttggcgcttgaaagaaagctgaagaaaatgctggggccctctgctgtagagatagggaatggatgctttgaaaccaaacacaagtgcaaccagacctgtctcgacagaatagctgctggtacctttgacgcaggagaattttctctccccacctttgattcactgaatattactgctgcatctttaaatgacgatggattggataatcataccatactgctttactactcaactgctgcctccagtttggctgtaacactgatgatagctatctttgttgtttatatggtctccagagacaatgtttcttgctccatctgtctataagggaagttaagccctgtgttttcctttgttgtagtgcttgtttgcttgttgccattacaaagaaacgttattgaaaaatgctcttgttact
[0113]
np(seq id no:5)
[0114]
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[0115]
na(seq id no:6)
[0116]
agcagaagcagagcatcttctcaaaattgaagcaaataggccgaaaatgaacaatgctaccctcaactatacaaacgttaaccctatttctcacatcagggggagtattattatcactatatgtgtcagcttcactgtcatacttactatattcggatatattgctaaaattcccatcaacagaaattactgcaccaacaatgccattagattgtgcaaacgcatcaaatgttcaggctgtgaaccgttctgcaacaaaaggggtgacacttcttctcccagaaccggagtggacatacccgcgtttatcttgcccgggctcaacctttcagaaagcactcctaattagccctcatagattcggagagaccaaaggaaactcagctcccttgataataagggaaccttttattgcttgtggaccaaaggaatgcaaacactttgctctaacccactatgcagcccaaccagggggatactacaatggaacaagaggagacagaaacaagctgaggcatctaatttcagtcaaattgggcaaaatcccaacagtagaaaactccattttccacatggcagcatggagcgggtccgcatgtcatgatggtaaggaatggacatatatcggagttgatggccctgacaataatgcattgctcaaaataaaatatggggaagcatatactgacacataccattcctatgcaaacaacatcctaagaacacaagaaagtgcctgcaattgcatcggaggaaattgttatcttatgataactgatggctcagcttcaggtgttagtgaatgcagatttcttaaaattcgagagggccgaataataaaagaaatatttccaacaggaagaatacaacatactgaagaatgcacatgcggatttgctagcaataaaaccatagaatgtgcctgtagagataacagttacacagcaaaaagaccctttgtcaaattaaacgtggagactgatacagcagaaataagattgatgtgcacaaagacttatttggacacccccagaccagaggatggaagcataactgggccttgtgaatctaatggaggcaaagggagtggaggcatcaagggaggatttgtccatcaaagaatggcatccaagattggaaggtggtactctcgaacgatgtctaaaactgaaaggaaggggatggggctgtatgtcaagtataatggagacccatgggctgaca
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[0117]
m(seq id no:7)
[0118]
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[0119]
ns(seq id no:8)
[0120]
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[0121]
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[0122]
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[0123]
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[0124]
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[0125]
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[0126]
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[0127]
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[0128]
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[0129]
acaattagactggtcacggaagaactttatcttttaagtaaaagaattgatgataa
[0130]
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[0131]
tatcattatcattattagaaacattgtatgaaatgaaggatgtggttgaagtgtac
[0132]
agcaggcagtgcttgtgaatttaaaataaaaatcctcttgttactact
[0133]
pct/cn2018/115938(公布为wo 2020/097923)中公开了特别优选的用于共组合物的laivb，其也用作嵌合实施方案骨架为8308b-delns1的laiv骨架()，所述文献通过引用并入本文。简而言之，8308b-delns1是来自提供的维多利亚谱系的活减毒流感病毒(laiv)b“laivb”)，其具有病毒毒力元件ns1(非结构蛋白1)的缺失，8308b-delns1。8308b-delns1优选地额外地在区段3和5-7中包括如下的适应性核苷酸突变(am)：pa(t210c)、na t(1424c)、np(c182t)和m(a281g)。具有适应性突变的8308b-delns1在本文中被称为am/8308b-delns1。am/8308b delns1不能在干扰素活性细胞(例如，a549细胞)中复制，并且优选地在低温如低于37℃的温度下复制，更优选地在30℃至33℃之间的温度下复制，并且最优选地在约33℃的温度下复制。在特别优选的实施方案中，所公开的laivb的特征在于，其在37℃下在mdck细胞中的复制与其在33℃下在所述mdck细胞中的复制相比较差。在特别优选的实施方案中，突变laivb/dellns1能够在疫苗产生系统(例如，卵或mdck细胞)中以与同一毒株的野生型流感病毒相当的水平复制。例如，8308b-delns1能够以》107个噬班形成单位(pfu/ml)的水平(例如在10
7-108pfu/ml之间)复制。可以将8308b-delns1或am/8308b-delns1骨架的如本文所公开的相似突变引入到其他乙型流感病毒的相应区段中；其区段序列已公开发布。例如，各种乙型流感病毒区段7核苷酸序列的genbank登录号为：dq792908.1(乙型流感病毒(乙型/lee/40)冷适应m1蛋白(m1)和bm2蛋白(bm2)基因，完整的编码序列)；m20175.1(乙型流感/安阿伯/1/66(冷适应)膜蛋白m1(区段7)rna，完整的编码序列)；cy018758.1(乙型流感病毒(乙型/维多利亚/02/1987)区段7，完整的序列)；cy018686.1(乙型流感病毒(乙型/香港/1434/2002)区段7，完整的序列。被定名为deins1-b8038hk的8308b-delns1乙型流感病毒已保藏在美国典型培养物保藏中心，并且其atcc保藏号为pta-125209。8308b-delns1、delns1-8308b和deins1-b8038hk在本文中可互换地使用。
[0134]
8308b-delns1可以用来表达其他冠状病毒抗原或衍生自其他具有临床意义的呼吸道病毒制剂的抗原。
[0135]
用于本文公开的共组合物的有用laiva公开在美国公布号2019/012585中，所述文献通过引用并入本文。laiva优选地基于h1n1流感病毒基因组，所述基因组包括毒力因子活性的缺失、第一组一个或多个突变以及第二组一个或多个突变，所述第一组一个或多个突变在不存在所述毒力因子活性的情况下在37℃下赋予复制，并且所述第二组一个或多个突变在低于35℃的温度下赋予复制。毒力因子活性的缺失可以包括毒力因子基因的至少一部分的缺失。此种缺失可以是延伸超过突变病毒的ns1区段的核苷酸57至528的ns1基因的至少一部分的缺失。第一组一个或多个点突变赋予复制能力，可以位于突变h1n1流感病毒的m区域的外部(例如，h1n1流感病毒基因组中的g346a突变)。第二组一个或多个突变可以包括一个或多个点突变，如h1n1中的t261g或a310g突变。美国公布号2019/012585中公开了特别优选的laiva，其是从此种2009h1n1毒株甲型/加利福尼亚/04/09中开发的，其中延伸的部分或所有的ns1编码内含子(例如，延伸超过核苷酸57至528所涵盖的区段的编码内含子)已缺失。美国公布号2019/012585公开了此种甲型流感病毒的delns1-a毒株(在所述文献中为冷适应(ca)4-delns1)，其在np区域内包括g345a突变，所述突变使得delns1-a病毒能够在细胞培养物和卵中有效复制。ca4-delns1在ns区段的nep编码区中包括两个适应性取代：
t261g(l79v)和a310g(e95g)。
[0136]
(iii)cov2ag
[0137]
尽管sars-cov和sars-cov-2之间有相似性，但两者之间存在遗传变异，并且引发针对sars-cov的免疫应答的表位是否对sars-cov-2有效尚不明显。
[0138]
优选的cov2ag是sars-cov-2的受体结合结构域(rbd)，其导致在本文中被命名为delns1-a/b sars-cov-2-rbd的嵌合病毒。a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-rbd laiv平台涉及关键毒力元件ns1被敲除的区别性特性，但a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-rbd laiv仍然可以在疫苗产生系统(卵或mdck细胞)中复制。当将sars-cov-2的受体结合结构域(rbd)插入到病毒基因组的ns1位点中时，rbd从被a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-rbd laiv感染的细胞中稳定地表达。
[0139]
使用rbd作为抗原使由于使用如sars冠状病毒中所示的全长刺突蛋白或全病毒而引起的潜在抗体依赖性增强病状最小化。因此，在一些优选的实施方案中，抗原不是sars-cov-2的全长刺突蛋白。可以进一步对rbd优化以覆盖多于一种的冠状病毒毒株，以防止未来出现的冠状病毒。a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-rbd嵌合病毒可以诱导中和抗体和t细胞免疫二者。可以生成具有流感表面蛋白的ha和na的不同组合的各种疫苗种子。a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-rbd嵌合病毒可以通过将具有缺失的ns1区段的流感病毒工程化以表达rbd来产生。所得嵌合病毒包括但不限于ca04-delns1-sars-cov-2-rbd；hk68-delns1-sars-cov-2-rbd；4801-delns1-sars-cov-2-rbd、h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rb、8308b-delns1-sars-cov-2-rbd。这些都是a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag，其中cov2ag部分是rbd。所公开的嵌合病毒可以用来制备活减毒疫苗，其包括如下文配制剂中所公开的a/b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag。
[0140]
ca04-delns1-ncov-rbd的全基因组序列存储在genbank中，并且其genbank登录号为mt227009-mt227016。如本文所公开制备ca04-delns1-ncov-rbd疫苗种子，其于2020年4月7日保藏在美国典型培养物保藏中心(atcc)，10801university_boulevard,manassas,va 20110usa中，并且被给予专利保藏号pta-126682。所公开的嵌合病毒可以用来制备活减毒疫苗，其包括如下文的配制剂中所公开的delns1-sars-cov-2-cov2agcov2ag。
[0141]
b.佐剂
[0142]
所公开的laiv可以与包括佐剂在内的其他免疫调节剂结合施用。有用的佐剂包括但不限于如下阐述的一种或多种：
[0143]
含有矿物质的佐剂组合物包括矿物盐，如铝盐和钙盐。示例性的矿物盐包括氢氧化物(例如，氢氧化合物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等或不同矿物化合物的混合物(例如，磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，其任选地具有过量的磷酸盐)，其中这些化合物采取任何合适的形式(例如，凝胶、晶体状、无定形等)，并且优选地吸附到盐上。含有矿物质的组合物也可以被配制成金属盐的颗粒(wo/0023105)。可以将铝盐包括在本发明的组合物中，使得al
3+
的剂量在每剂量0.2至1.0mg之间。
[0144]
适合用作本发明中的佐剂的油乳状液佐剂可以包括角鲨烯水乳状液，如mf59(5％角鲨烯、0.5％ tween 80和0.5％ span 85，使用微流控器将其配制成亚微米颗粒)。参见，例如，wo90/14837,podda,vaccine 19:2673-2680,2001。用于组合物的额外佐剂是亚微米水包油乳状液。用于本文的亚微米水包油乳状液的实例包括任选地含有不同量的mtp-pe的
角鲨烯/水乳状液，如含有4-5％w/v角鲨烯、0.25-1.0％w/v tween 80(单油酸聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯)和/或0.25-1.0％ span 85(三油酸脱水山梨糖醇酯)以及任选的n-乙酰基胞壁酰基-l-丙氨酰基-d-异谷氨酰胺酰基-l-丙氨酸-2-(1
’‑2’‑
二棕榈酰基-s
‑‑
n-丙三基-3-乳状液磷酰基氧基)-乙胺(mtp-pe)的亚微米水包油乳状液，例如，被称为“mf59”的亚微米水包油乳状液(国际公布号wo90/14837；美国专利号6,299,884和6,451,325，这些文献通过引用以其整体并入本文。mf59可以含有4-5％w/v角鲨烯(例如，4.3％)、0.25-0.5％w/v tween 80和0.5％w/vspan 85，并且任选地含有各种量的mtp-pe，使用微流控器(如model 110y微流控器(microfluidics,newton,mass.))将其配制成亚微米颗粒。例如，mtp-pe可以以约0-500μg/剂、或0-250μg/剂或0-100μg/剂的量存在。用于组合物的亚微米水包油乳状液、其制备方法以及免疫刺激剂(如胞壁酰肽)详细地描述在国际公布号wo90/14837和美国专利号6,299,884和6,451,325中。
[0145]
完全弗氏佐剂(cfa)和不完全弗氏佐剂(ifa)也可以用作本发明中的佐剂。
[0146]
皂苷佐剂配制剂也可以用作本发明中的佐剂。皂苷是存在于很多种植物物种的皮、叶、茎、根甚至花中的甾醇糖苷和三萜糖苷的异源组。来自皂树树皮的皂苷已被作为佐剂广泛研究。皂苷也可以从墨西哥菝葜(菝葜属植物)(smilax ornata(sarsaprilla))、满天星(垂茉莉)(gypsophilla paniculata(brides veil))和肥皂草(皂根)(saponaria officianalis(soap root))中商业获得。皂苷佐剂配制剂可以包括纯化的配制剂，如qs21，以及脂质配制剂，如免疫刺激复合物(iscom；参见下文)。已经使用高效薄层色谱法(hplc)和反相高效液相色谱法(rp-hplc)纯化了皂苷组合物。已经鉴定了使用这些技术的具体纯化级分，包括qs7、qs17、qs18、qs21、qh-a、qh-b和qh-c。qs21的产生方法公开在美国专利号5,057,540中。皂苷配制剂还可以包含甾醇，如胆固醇(参见wo96/33739)。皂苷和胆固醇的组合可以用来形成被称为iscom的独特颗粒。iscom通常还包括磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷都可以用于iscom。例如，iscom可以包括quil a、qha和qhc中的一种或多种。iscom描述在ep0109942、wo96/11711和wo96/33739中。任选地，iscom可以不含额外的去污剂。参见wo00/07621。基于皂苷的佐剂的开发的描述可以见于barr,et al.,"iscoms and other saponin based adjuvants",advanced drug delivery reviews 32:247-27,1998。另参见sjolander,et al.,"uptake and adjuvant activity of orally delivered saponin and iscom vaccines",advanced drug delivery reviews 32:321-338,1998。
[0147]
病毒体和病毒样颗粒(vlp)也可以用作佐剂。这些结构通常含有来自病毒的一种或多种蛋白质，所述蛋白质任选地与磷脂组合或与其一起配制。它们通常是非致病性的、非复制性的，并且通常不含有任何天然的病毒基因组。病毒蛋白质可以从全病毒中重组地产生或分离。适合于病毒体或vlp的这些病毒蛋白质包括衍生自流感病毒(如ha或na)、乙型肝炎病毒(如核心或衣壳蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、反转录病毒、诺沃克病毒、人乳头瘤病毒、hiv、rna噬菌体、qb噬菌体(如外壳蛋白)、ga噬菌体、fr噬菌体、ap205噬菌体和ty(如反转录转座子ty蛋白pl)的蛋白质。
[0148]
可用作佐剂的细菌或微生物衍生物包括：(i)肠道细菌脂多糖(lps)的无毒衍生物；(ii)脂质衍生物，(iii)免疫刺激性寡核苷酸和adp核糖基化毒素及其脱毒衍生物，(iv)adp核糖基化毒素及其脱毒衍生物。lps单磷酰脂质a(mpl)和3-o-脱酰化mpl(3dmpl)的无毒
衍生物的实例。3dmpl是3de-o-酰化单磷酰脂质a与4、5或6个酰化链的混合物。3de-o-酰化单磷酰脂质a的“小颗粒”形式的实例公开在ep 0 689 454中。3dmpl的此种“小颗粒”小到足以通过0.22微米的膜进行无菌过滤(参见ep 0 689 454)。其他的无毒lps衍生物包括单磷酰脂质a模拟物，如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，例如，rc-529(johnson et al.,bioorg med chem lett,9:2273-2278,1999)。脂质a衍生物的实例可以包括来自大肠杆菌的脂质a的衍生物，如om-174。om-174描述在例如meraldi et al.,vaccine 21:2485-2491,2003；以及pajak,et al.,vaccine 21:836-842,2003中。含有cpg基序的免疫刺激性寡核苷酸核苷酸序列的实例(包含未甲基化胞嘧啶后跟鸟苷并通过磷酸键连接的序列)。含有回文或聚(dg)序列的细菌双链rna或寡核苷酸也已被显示出具有免疫刺激性。
[0149]
cpg可以包括核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，并且可以是双链的或单链的。任选地，鸟苷可以用类似物(如2
’‑
脱氧-7-去氮鸟苷)代替。类似物取代的实例参见kandimalla,et al.,"divergent synthetic nucleotide motif recognition pattern:design and development of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotide agents with distinct cytokine induction profiles",nucleic acids research 31:2393-2400,2003；wo02/26757和wo99/62923。在krieg,nature medicine(2003)9(7):831-835；mccluskie,et al.,fems immunology and medical microbiology(2002)32:179-185；wo98/40100；美国专利号6,207,646；美国专利号6,239,116以及美国专利号6,429,199中进一步讨论了cpg寡核苷酸的佐剂效应。cpg序列可能涉及toll样受体(tlr9)，如基序gtcgtt或ttcgtt。参见kandimalla,et al.,"toll-like receptor 9:modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic cpg dnas",biochemical society transactions(2003)31(part 3):654-658。cpg序列可以特异性地用于诱导th1免疫应答，如cpg-a odn，或者它可以更特异性地用于诱导b细胞应答，如cpg-b odn。在blackwell,et al.,j.immunol.170:4061-4068,2003；krieg,trends in immunology 23:64-65,2002以及wo01/95935中讨论了cpg-a和cpg-b odn。在一些方面，cpg寡核苷酸可以被构建使得5’末端可以用于受体识别。任选地，两个cpg寡核苷酸序列可以在它们的3’末端处附接以形成“免疫单体(immunomer)”。参见，例如，kandimalla,et al.,bbrc 306:948-95,2003；kandimalla,et al.,biochemical society transactions 31:664-658,2003；bhagat et al.,"bbrc 300:853-861,2003以及wo03/035836。细菌adp核糖基化毒素及其脱毒衍生物可以用作本发明中的佐剂。例如，毒素可以衍生自大肠杆菌(即，大肠杆菌热不稳定肠毒素(lt))、霍乱(ct)或百日咳(ptx)。脱毒adp核糖基化毒素作为粘膜佐剂的用途描述在wo95/17211中，并且其作为胃肠外佐剂的用途描述在wo98/42375中。在一些方面，佐剂可以是脱毒lt突变体，如lt-k63、lt-r72和ltr192g。adp核糖基化毒素及其脱毒衍生物，特别是lt-k63和lt-r72作为佐剂的用途可以见于以下的参考文献，这些参考文献各自都具体地通过引用以其整体并入本文：beignon,et al.,infection and immunity 70:3012-3019,2002；pizza,et al.,vaccine 19:2534-2541,2001；pizza,et al.,int.j.med.microbiol 290:455-461,2003；scharton-kersten et al.,,infection and immunity 68:5306-5313,2000；ryan et al.,infection and immunity 67:6270-6280,2003；partidos et al.,immunol.lett.67:09-216,1999；peppoloni etal.,vaccines 2:285-293,2003；以及pine et al.,j.control release 85:263-270,2002。
[0150]
生物粘合剂和粘膜粘合剂也可以用作本发明中的佐剂。合适的生物粘合剂可以包括酯化透明质酸微球(singh et al.,j.cont.rel.70:267-276,2001)或粘膜粘合剂，如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳聚糖及其衍生物也可以用作例如wo99/27960中所公开的发明中的佐剂。
[0151]
佐剂微颗粒：微颗粒也可以用作佐剂。设想了由可生物降解和/或无毒的材料(例如，聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯等)使用聚(丙交酯-共-乙交酯)形成的微颗粒(即，直径为约100nm至约150μm、或直径为200nm至约30μm或直径为约500nm至约10μm的微颗粒)，其任选地被处理成具有带负电荷的表面(例如，用sds)或带正电荷的表面(例如，用阳离子洗涤剂，如ctab)。
[0152]
适合用作佐剂的脂质体配制剂的实例描述在美国专利号6,090,406、美国专利号5,916,588和ep 0 626 169中。
[0153]
额外的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯。wo99/52549。此类配制剂可以进一步包括与辛苯聚醇组合的聚氧乙烯山梨醇酐酯表面活性剂(wo 01/21207)，以及与至少一种额外的非离子表面活性剂(如辛苯聚醇)组合的聚氧化乙烯烷基醚或酯表面活性剂(wo 01/21152)。在一些方面，聚氧乙烯醚可以包括：聚氧乙烯-9-月桂基醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂基醚、聚氧乙烯-8-硬脂基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚乙二醇-35-月桂基醚或聚氧乙烯-23-月桂基醚。
[0154]
用作佐剂的pcpp配制剂描述在例如andrianov et al.,biomaterials 19:109-115,1998.1998中。适合用作本发明中的佐剂的胞壁酰肽的实例可以包括n-乙酰基-胞壁酰基-l-苏氨酰基-d-异谷氨酰胺(thr-mdp)、n-乙酰基-降胞壁酰基-1-丙氨酰基-d-异谷氨酰胺(nor-mdp)和n-乙酰基胞壁酰基-1-丙氨酰基-d-异谷氨酰胺酰基-1-丙氨酸-2-(1
’‑2’‑
二棕榈酰基-s
‑‑
n-丙三基-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺mtp-pe)。适合用作本发明中的佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的实例可以包括咪喹莫特及其同源物，它们进一步描述在stanley,"imiquimod and the imidazoquinolones:mechanism of action and therapeutic potential"clin exp dermatol 27:571-577,2002以及jones,"resiquimod 3m",curr opin investig drugs 4:214-218,2003中。适合用作本发明中的佐剂的人免疫调节剂可以包括细胞因子，如白介素(例如，il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-12等)、干扰素(例如，干扰素γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
[0155]
佐剂组合：佐剂以组合的方式用于随后的优选实施方案。例如，佐剂组合物可以包括：皂苷和水包油乳状液(wo99/11241)；皂苷(例如，qs21)+无毒lps衍生物(例如，3dmpl)(参见wo94/00153)；皂苷(例如，qs21)+无毒lps衍生物(例如，3dmpl)+胆固醇；皂苷(例如，qs21)+3dmpl+il-12(任选地+甾醇)(wo98/57659)；3dmpl与例如qs21和/或水包油乳状液的组合(参见欧洲专利申请0835318、0735898和0761231)；saf，其含有10％角鲨烷、0.4％ tween 80、5％普朗尼克嵌段聚合物l121和thr mdp，它们被微流体化为亚微米乳状液或被涡旋以生成更大粒径的乳状液。ribi佐剂系统(ras)(ribi immunochem)含有2％角鲨烯、0.2％ tween 80和来自下组的一种或多种细菌细胞壁组分：单磷酰基脂质a(mpl)、海藻糖二霉菌酸酯(tdm)和细胞壁骨架(cws)，优选mpl+cws(detox)；以及一种或多种矿物盐(如铝盐)+lps的无毒衍生物(如3dpml)。
[0156]
铝盐和mf59是与可注射流感疫苗一起使用的佐剂的实例。细菌毒素和生物粘合剂
是与经粘膜递送疫苗(如鼻腔疫苗)一起使用的佐剂的实例。可以使用本领域众所周知的技术，将上文提到的所有佐剂和如本领域普通技术人员通常已知的其他佐剂配制用于鼻内施用。
[0157]
c.配制剂和载剂
[0158]
可以将本发明的组合物配制在药物组合物中。除delns1-a/b-sars-cov-2-cov2ag中的一种或多种之外，这些药物组合物还可以包含药物上可接受的赋形剂、载剂、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员众所周知的其他材料。这种材料通常应该是无毒的，并且通常不应该干扰活性成分的功效。载剂或其他材料的确切性质可以取决于施用途径，例如口服、静脉内、皮肤或皮下、鼻腔、肌内或腹膜内途径。
[0159]
用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂或液体形式。片剂可以包括固体载剂，如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载剂，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖溶液或者二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。术语“载剂”是指与药物组合物(例如，免疫原性或疫苗配制剂)一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液以及水性右旋糖和丙三醇溶液也可以用作液体载剂，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、乙醇等。合适的药物载剂的实例描述在e.w.martin的“remington’s pharmaceutical sciences”by中。应该根据施用模式选择配制剂。
[0160]
对于静脉、皮肤或皮下注射或者病痛位点处的注射，活性成分将呈胃肠外可接受的水溶液的形式，所述水溶液是无热原的并且具有合适的ph、等渗性和稳定性。本领域的相关技术人员能够使用例如等渗媒介物(如氯化钠注射液、林格氏注射液或乳酸林格氏注射液)来制备合适的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他添加剂。
[0161]
施用优选地以“治疗有效量”或“预防有效量”进行(视情况而定，尽管预防可以被视为疗法)，该量足以示出对个体的益处。实际的施用量以及施用的速率和时间进程将取决于正被治疗的疾病的性质和严重程度。治疗处方(例如，用量决定等)由全科医生和其他医师负责，并且通常会考虑到待治疗的病症、个体患者的病况、递送位点、施用方法和行医者已知的其他因素。上文提及的技术和方案的实例可以见于remington’s pharmaceutical science,mack publishing company,easton,pa.(“remington’s”)的最新版本。
[0162]
iii.制备方法
[0163]
对a/b-delns1-sars-cov-2-cov2ag嵌合病毒进行工程化的方案提供在公布申请号20190125858的实施例部分中，所述文献通过引用并入本文。所述方案包括(a)生成一种流感病毒(例如加利福尼亚(ca)/04/09或乙型/香港/8038/2011)毒株，其中ns1基因的编码区已被从其基因组中去除。ns1基因的编码区可以使用本领域已知的方法来去除。将靶向突变引入到基因组中或在病毒学的背景下引入到病毒中的方法被纳入在术语反向遗传学(rg)之中，并且被公开在例如hoffmann et al.,proc natl acad sci u s a,97(11):6108-13zheng et al.,j.virol.89(20):10273-85以及dauber,et al.,j.virol.,78(4):1865-1872(2004)中，这些文献的材料和方法通过引用并入本文。如公布申请号20190125858中所公开的生成ns1编码区缺失的流感病毒的方法被概括和总结在本文中。如
pct/cn2018/115,938所公开的生成ns1编码区缺失的乙型流感病毒的方法被概括和总结在本文中。
[0164]
a.生成ns1基因的编码区被去除的活减毒流感病毒
[0165]
在一些优选的实施方案中，可以如本文实施例中所公开，用本文公开的方法以ca04-delns1为例来构建laiva。简而言之，构建ns1缺失质粒。ns1缺失质粒的构建：合适的病毒毒株(例如，2009h1n1甲型/加利福尼亚/04/09(ca04))可以用作构建delns1疫苗毒株的骨架。没有ns1表达的质粒可以通过用如下引物的反向pcr来构建：ca04-delns1-529f:gacatacttatgaggatgtc(seq id no:29)；ca04-delns1-56f:ctgaaagcttgacatggtgttg(seq id no:30)。这些引物可以用于通过缺失56-529处的内含子的反向遗传程序从加利福尼亚(ca)/04/09毒株构建ca4-delns1病毒。
[0166]
引物5
’‑
gacatactgtgaggatgtcaaaaatg-3’(ns-529f)(seq id no:31)和5
’‑
ctgaaagcttgacacagtgtttgg-3’(ns-56r)(seq id no:32)可以用于构建a/wsn/33-delns1和a/pr/8/34-delns1。
[0167]
ns1缺失质粒可以根据先前报道(garcia-sastre,j.virology 252:324
–
330,1998)；zheng,et al.,j virol 89:10273
–
10285(2015)中所描述的方案来构建。简而言之，进行反向pcr以缺失插入到phw2000载体中的ns基因的内含子以及被磷酸化并自连接的质粒。对于点突变，可以使用可商购的试剂盒，例如，quikchange ii定点诱变试剂盒(stratagene)。
[0168]
可以如pct/cn2018/115,938中所公开，用其中公开的方法以delns1-b8038为例来构建laivb。简而言之，所述方案包括(a)通过将八种质粒，优选phw2000质粒转染到一个或多个疫苗产生细胞中，来产生ns1基因的编码区被从其基因组中去除的乙型流感病毒，所述八种质粒含有包括表达ns1蛋白的质粒的delns1乙型流感病毒的基因组，(b)拯救lavib/delns1病毒，以及(c)分别在33℃和37℃下将拯救的病毒传代到一个或多个疫苗产生细胞中直到病毒滴度稳定，例如当三次连续传代的病毒滴度保持不变时，以获得am/lavib/delns1，以及(c)针对期望突变的存在进行分析。
[0169]
在优选的实施方案中，将步骤b中的病毒在两个或更多个细胞的混合物(例如，293t/mdck细胞)中培养。所公开的用于制备laivb的方法导致病毒毒力元件ns1蛋白的缺失和允许突变毒株在疫苗产生系统(如卵和mdck细胞)中生长的适应性突变。优选的适应性突变是pa(t210c)、nat(1424c)、np(c182t)和m(a281g)突变。所公开的方法优选地包括反向遗传学。将含有缺失的ns1区段(delns1)和其他七个衍生自流感b病毒毒株的基因组区段的质粒转染到293t/mdck细胞混合物中。优选的病毒毒株包括乙型/山行和乙型/维多利亚拯救病毒，其在mdck细胞中进行传代直到病毒滴度稳定，直到获得高水平的病毒滴度并且所述滴度保持不变达至少三次连续传代。对病毒进行测序以确定适应性突变。
[0170]
ns1基因的编码区可以使用本领域已知的方法来去除。将靶向突变引入到基因组中或在病毒学的背景下引入到病毒中的方法被纳入在术语反向遗传学(rg)之中，并且被公开在例如hoffmann et al.,proc natl acad sci u s a,97(11):6108-13zheng et al.,j.virol.89(20):10273-85以及dauber,et al.,j.virol.,78(4):1865-1872(2004)中，这些文献的材料和方法通过引用并入本文。如dauber et al.中所公开的生成ns1编码区缺失的流感病毒的方法被概括和总结在本文中。
[0171]
(i)rt-pcr和质粒构建
[0172]
rneasy试剂盒(qiagen)可以根据制造商的方案用于从乙型流感病毒的原种中提取病毒rna。通过单个病毒rna区段的反转录酶pcr(rt-pcr)扩增来构建八种反向遗传质粒phw-pb2、phw-pb1、phw-pa、phw-ha、phw-np、phw-na、phw-m1和phw-ns1(表1)，并且将所得cdna克隆到质粒phw2000中。所有八种质粒都可以用来生成野生型乙型流感病毒。
[0173]
可以用于pcr扩增的引物列出在下表2中：
[0174]
表2
[0175][0176][0177]
乙型流感病毒ns1蛋白的编码区与从病毒ns基因区段的剪接转录物表达的nep/ns2蛋白的阅读框部分重叠。对于ns1缺乏型乙型流感病毒的生成，制备了一种被称为phw-lee-δns1-b的ns反向遗传质粒的衍生物，其中缺失了指定ns1蛋白的序列，同时保留了所有nep/ns2编码序列和末端非编码区。例如，对于phw-delns1-b质粒的生成，通过使用oligotex direct mrna midi/maxi试剂盒(qiagen)和用于rt-pcr扩增的ns区段特异性引物，从乙型流感病毒感染的mdck细胞中提取聚腺苷酸化rna。将扩增的nep/ns2区段用qiaex ii凝胶提取试剂盒(qiagen)纯化，用bsmbi消化，并且克隆到phw2000中。
[0178]
这些质粒促进负义病毒rna和正义mrna的双向转录，因为克隆的病毒cdna在上游侧接有人rna聚合酶i启动子，并且在下游侧接有rna聚合酶ii特异性启动子。简而言之，首先用moloney鼠白血病病毒反转录酶(promega)，通过使用与所有八个病毒rna区段的保守
3’末端互补的通用九核苷酸引物(uni-9)对病毒rna进行反向转录。在37℃下进行rt反应60分钟，然后在70℃下进行15分钟。随后，通过使用pfuturbo聚合酶(roche diagnostics)和在5’末端处携带bsmbi(pb1、pb2、pa、na、m和ns)、bspmi(np)或aari(ha)限制位点序列的区段特异性引物，通过pcr来扩增单基因区段。phw-ns-xhoi是用quikchange诱变试剂盒(stratagene)通过在病毒ns区段的核苷酸262至267处引入新型xhoi识别位点来构建的phw
‑‑
ns的衍生物。转染子病毒的ns区段被工程化以携带经工程化的遗传标签位点，使得相应的cdna易于被限制性核酸内切酶xhoi裂解，从而验证分离物的重组性质。
[0179]
(ii)转染介导的重组乙型流感病毒回收。
[0180]
为了生成重组乙型流感野生型病毒，将八种质粒phw-pb2、phw-pb1、phw-pa、phw-ha、phw-np、phw-na、phw-m和phw-ns-xhoi(各0.5μg)用lipofectamine 2000试剂(invitrogen)转染到含106个293t细胞的悬浮液中。在转染后72小时，将转染细胞的上清液接种到11日龄鸡蛋的尿囊腔中，以培养重组病毒的原种。可以将含有突变质粒的转染细胞的上清液传代到6日龄鸡蛋中。重组乙型流感病毒的回收可以通过代表病毒ns区段的rt-pcr产物的凝胶电泳分析来验证。
[0181]
优选地将质粒转染到细胞的混合物(例如，293t/mdck细胞)中，以培养重组病毒的原种。图1a.delns1病毒可以通过基本相同的程序来拯救，不同之处在于用phw-δns1-b代替phw-ns-xhoi并且将0.5μg ns1表达载体(例如，pcdna-ns1)添加到转染混合物中。为了构建质粒pcdna-ns1-b，ns1 cdna可以用phw-lee ns作为模板进行pcr扩增，并且在pcdna3的hindiii/xhoi位点之间进行克隆。
[0182]
完全缺少dauber,et al.j.virol.,78:1865-1872(2004)中所描述的ns1orf的乙型流感病毒在vero细胞中不能有效地复制(分别地，使用0.1的moi时的滴度为1.7-2.5*102ffu/ml，并且在0,001的moi处没有可检测到的滴度。由氨基末端16aa组成的乙型流感ns1缺失突变体在复制中也是高度减毒的，其最大滴度为大约104ffu/ml。(hai et.al；journal of virology；november 2008,p.10580-90.本段落中所公开的这些类型的流感病毒优选地不用作本文公开的嵌合病毒的骨架。
[0183]
phw2000-sars-cov-2-rbd-nep质粒的构建
[0184]
包括sars-cov-2-rbd的质粒可以采用美国公布申请号2019/0125858中所公开的用于phw2000 mers-rbd-nep质粒的方法来制备。
[0185]
简而言之，为了生成表达sars-cov-2受体结合结构域(rbd)的重组ns1缺失流感病毒，可以构建phw2000-sars-cov-2-rbd-nep质粒。它具有开放阅读框，其由ns1的b8038n末端、sars-cov-2rbd结构域、ptv1-2a裂解位点、具有突变n末端ns1序列的delns1-b8038 nep构成。
[0186]
通过pcr扩增sars-cov-2-rbd-ptv1-2a的序列，并且将其通过使用核酸外切酶iii的连接非依赖性克隆插入到仅含有b8038 nep开放阅读框的phw2000-delns1-b8038中。转化后，从正确的克隆中提取质粒，随后进行测序以确认序列。
[0187]
ca-04-delns1病毒的拯救
[0188]
将九种质粒：phw2000-ca04-pb2、phw2000-ca04-pb1、phw2000-ca04-pa、phw2000-ca04-np、phw2000-ca04-ha、phw2000-ca04-na、phw2000-ca04-m、phw2000-ca04-delns1和pcx-ca04-ns1在一管中混合在一起。每种都以1μg存在。在铺板在6孔板中的80％融合性
293t细胞中进行用混合质粒的转染。在转染期间，用不含青霉素和链霉素的1ml opti-mem代替旧培养基。十六个小时后，将上清液丢弃，并且添加2ml含有1μg/ml胰蛋白酶的mem。转染后七十个小时，在将细胞碎片去除之后收集上清液。
[0189]
delns1病毒的传代
[0190]
可以将两百微升拯救的delns1病毒注射到9至10日龄受精卵中，并且在37℃的孵育器中孵育48小时。收集卵尿囊液，并且测量ha滴度。通过以1500g离心10分钟将血细胞和其他碎片去除。将上清液转移到millipore100k超滤器中，并且以3000g的速度离心10分钟。将pbs添加到所述超滤器中以得到10ml的体积来洗涤浓缩的病毒，并且将悬浮液再次以3000g离心10分钟。将两百微升的所得病毒制备剂用于接种9至10日龄受精卵，并且重复所述程序直到病毒ha滴度急剧增加。
[0191]
可以在任何病毒产生细胞中培养拯救的delns1-sars-cov-2-cov2ag嵌合病毒直到病毒滴度稳定，例如当mdck细胞和卵中的至少三次连续传代的病毒滴度保持不变时即可得到证实。收集来自72小时后的转染细胞的上清液，并且将其在mdck细胞中传代。
[0192]
用于传代的优选细胞是mdck(madin-darby犬肾)细胞。然而，用于使用培养基培养病毒的细胞可以是可以在合成培养基中体外生长并且可以用于病毒的增殖的细胞。这些可以是例如bsc-1细胞、llc-mk细胞、cv-1细胞、cho细胞、cos细胞、鼠细胞、人细胞、hela细胞、293细胞、vero细胞、mdbk细胞、mdok细胞、crfk细胞、raf细胞、tcmk细胞、llc-pk细胞、pk15细胞、wi-38细胞、mrc-5细胞、t-fly细胞、bhk细胞、sp2/0细胞、ns0、perc6(人视网膜细胞)、鸡胚细胞或衍生物、含胚卵细胞、含胚鸡蛋或其衍生物。
[0193]
用于产生病毒的培养基可以是现有技术中已知的适合于病毒培养的任何培养基。优选地，培养基是合成培养基。这可以是例如基础培养基，如改良eagle培养基mem、最小必需培养基mem、dulbecco改良eagle培养基d-mem、d-mem-f12培养基、william e培养基、rpmi培养基及其类似物和衍生物。这些也可以是特殊的细胞培养和病毒生长培养基，如vp-sfm、optipro
tm sfm、aim培养基、hyq sfm4 megavir
tm
、ex-cell
tm vero sfm、episerf、provero、任何293或cho培养基及其类似物和衍生物。这些培养基可以补充有现有技术中已知的适合于细胞和病毒培养的任何添加剂，如例如动物血清及其级分或类似物、氨基酸、生长因子、激素、缓冲液、微量元素、胰蛋白酶、丙酮酸钠、维生素、l-谷氨酰胺和生物缓冲液。优选的培养基是补充有l-谷氨酰胺和胰蛋白酶的optipro
tm sfm。
[0194]
因此，所公开的方法包括将病毒培养有效量的时间以获得稳定的病毒滴度。在优选的实施方案中，将拯救的病毒在病毒产生细胞(例如，mdck细胞)中传代一段时间，直到病毒滴度保持不变达3次连续传代。这种培养期可以在从10-50代的范围内，优选在33℃下20代以上。培养的时间和条件导致适应性突变，这允许laivb在疫苗产生系统(如卵或mdck)中复制。实例delns1-sars-cov-2-rbd可以在用于所测试的病毒毒株的疫苗产生细胞系mdck细胞中复制。
[0195]
(iii)sars-cov-2-cov2ag/流感ha/na质粒的构建
[0196]
可以制备包括所选流感毒株的sars-cov-2抗原或na/ha的质粒，如此处针对sars-cov-2-rbd所例示的。可以简单地用所选sars-cov-2抗原或来自流感病毒的不同毒株(与正被使用的骨架laiv不同)的na/ha代替rbd。
[0197]
phw2000-sars-cov-2-rbd-nep质粒的构建
[0198]
包括sars-cov-2-rbd的质粒可以采用美国公布申请号2019/0125858中所公开的用于phw2000 mers-rbd-nep质粒的方法来制备。
[0199]
简而言之，为了生成表达sars-cov-2受体结合结构域(rbd)的重组ns1缺失流感病毒，可以构建phw2000-sars-cov-2-rbd-nep质粒。它具有开放阅读框，其由ns1的ca04 n末端、sars-cov-2rbd结构域、ptv1-2a裂解位点、具有突变n末端ns1序列的ca04 nep构成。
[0200]
通过pcr扩增sars-cov-2-rbd-ptv1-2a的序列，并且将其通过使用核酸外切酶iii的连接非依赖性克隆插入到仅含有ca04 nep开放阅读框的phw2000-ca04-delns1中。转化后，从正确的克隆中提取质粒，随后进行测序以确认序列。
[0201]
(iv)delns1-sars-cov-2cov2ag嵌合病毒的拯救
[0202]
在本文中使用ca04-delns1-rbd病毒例示a-毒株-delns1-sars-cov-2cov2ag嵌合病毒的拯救。这些方法可应用于使用其他laiv骨架的嵌合病毒，例如hk68-delns1-sars-cov-2-rbd；4801-delns1-sars-cov-2-rbd和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd的拯救。
[0203]
ca04-delns1-rbd病毒的拯救
[0204]
将九种质粒：phw2000-ca04-pb2、phw2000-ca04-pb1、phw2000-ca04-pa、phw2000-ca04-np、phw2000-ca04-ha、phw2000-ca04-na、phw2000-ca04-m、phw2000-sars-cov-2-rbd-nep和pcx-ca04-ns1(每种质粒1μg)混合并且用于转染6孔板中的80％融合性293t细胞。在转染期间，用不含抗生素的1ml opti-mem代替旧培养基。十六个小时后，将上清液丢弃，并且添加2ml含有1μg/ml胰蛋白酶的mem。转染后七十个小时，在将细胞碎片去除之后收集上清液。将上清液注射到9至10日龄受精卵中，并且在37℃下孵育48小时。收集卵尿囊液，并且通过离心将其澄清。然后在mdck细胞中通过噬斑测定对病毒进行测序和滴定。
[0205]
b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag嵌合病毒的拯救
[0206]
在本文中使用delns1-b8038-rbd病毒例示b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag嵌合病毒的拯救。这些方法可应用于使用其他laivb骨架进行的嵌合病毒的拯救。
[0207]
delns1-b8038-rbd病毒可以使用以下方案来拯救。将九种质粒：phw2000-b8038-pb2、phw2000-b8038-pb1、phw2000-b8038-pa、phw2000-b8038-np、phw2000-b8038-ha、phw2000-b8038-na、phw2000-b8038-m、phw2000-sars-cov-2-rbd-nep和pcx-b8038-ns1(每种质粒1μg)混合并且用于转染6孔板中的80％融合性293t细胞。在转染期间，用不含抗生素的1ml opti-mem代替旧培养基。十六个小时后，将上清液丢弃，并且添加2ml含有1μg/ml胰蛋白酶的mem。转染后七十个小时，在将细胞碎片去除之后收集上清液。将上清液注射到9至10日龄受精卵中，并且在37℃下孵育48小时。收集卵尿囊液，并且通过离心将其澄清。(iii)然后在mdck细胞中通过噬斑测定对病毒进行测序和滴定。
[0208]
(v)delns1-b和嵌合b-毒株-delns1-sars-cov-2-cov2ag病毒毒株的传代和拯救
[0209]
可以在任何病毒产生细胞中培养拯救的delns1-b和delns1-b-sars-cov-2-cov2ag嵌合病毒直到病毒滴度稳定，例如当mdck细胞和卵中的至少三次连续传代的病毒滴度保持不变时即可得到证实。收集来自72小时后的转染细胞的上清液，并且将其在mdck细胞中传代。
[0210]
用于传代的优选细胞是mdck(madin-darby犬肾)细胞。然而，用于使用培养基培养病毒的细胞可以是可以在合成培养基中体外生长并且可以用于病毒的增殖的细胞。这些可以是例如bsc-1细胞、llc-mk细胞、cv-1细胞、cho细胞、cos细胞、鼠细胞、人细胞、hela细胞、
293细胞、vero细胞、mdbk细胞、mdok细胞、crfk细胞、raf细胞、tcmk细胞，llc-pk细胞、pk15细胞、wi-38细胞、mrc-5细胞、t-fly细胞、bhk细胞、sp2/0细胞、ns0、perc6(人视网膜细胞)、鸡胚细胞或衍生物、含胚卵细胞、含胚鸡蛋或其衍生物。
[0211]
也可以使用如下例示的方案将delns1-b-sars-cov-2-cov2ag嵌合病毒在卵中传代。可以将两百微升拯救的delns1-b病毒注射到9至10日龄受精卵中，并且在37℃的孵育器中孵育48小时。收集卵尿囊液，并且测量ha滴度。通过以1500g离心10分钟将血细胞和其他碎片去除。将上清液转移到millipore 100k超滤器中，并且以3000g的速度离心10分钟。将pbs添加到所述过滤器中以得到10ml的体积来洗涤浓缩的病毒，并且将悬浮液再次以3000g离心10分钟。将两百微升的所得病毒制备剂用于接种9至10日龄受精卵，并且重复所述程序直到病毒ha滴度急剧增加。
[0212]
用于产生病毒的培养基可以是现有技术中已知的适合于病毒培养的任何培养基。优选地，培养基是合成培养基。这可以是例如基础培养基，如改良eagle培养基mem、最小必需培养基mem、dulbecco改良eagle培养基d-mem、d-mem-f12培养基、william e培养基、rpmi培养基及其类似物和衍生物。这些也可以是特殊的细胞培养和病毒生长培养基，如vp-sfm、optipro
tm sfm、aim培养基、hyq sfm4megavir
tm
、ex-cell
tm vero sfm、episerf、provero、任何293或cho培养基及其类似物和衍生物。这些培养基可以补充有现有技术中已知的适合于细胞和病毒培养的任何添加剂，如例如动物血清及其级分或类似物、氨基酸、生长因子、激素、缓冲液、微量元素、胰蛋白酶、丙酮酸钠、维生素、l-谷氨酰胺和生物缓冲液。优选的培养基是补充有l-谷氨酰胺和胰蛋白酶的optipro
tm sfm。
[0213]
因此，所公开的方法包括将病毒培养有效量的时间以获得稳定的病毒滴度。在优选的实施方案中，将拯救的病毒在病毒产生细胞(例如，mdck细胞)中传代一段时间，直到病毒滴度保持不变达3次连续传代。这种培养期可以在从10-50代的范围内，优选在33℃下20代以上。培养的时间和条件导致适应性突变，这允许laivb在疫苗产生系统(如卵或mdck)中复制。实例delns1-sars-cov-2-rbd可以在用于所测试的病毒毒株的疫苗产生细胞系mdck细胞中复制。
[0214]
可以使用本领域已知的方法，对流感病毒的其他结构域(除本文公开的ns1之外)，如ha和na基因区段进行工程化以表达感兴趣的异源基因。另外，还可能通过额外的基因区段表达全长外源蛋白。因此，可以使用gao etal.,j virol.2010；84:8062
–
71中所描述的相似方法，对所公开的laiva/b进行修饰以表达来自不同流感毒株的感兴趣的ha/na基因。流感病毒基因组rna具有区段特异性包装信号，其包括非编码区(ncr)和相邻的末端编码区序列二者。使用反向遗传学，可以拯救所公开的laiva/b，其含有经修饰的pb1基因，使得pb1包装序列被交换为所选神经氨酸酶(na)/ha基因区段的pb1包装序列。为了实现这一点，其中末端包装信号被一系列同义突变灭活的pb1开放阅读框侧接有包括ncr和编码区包装信号在内的na区段特异性包装序列。接下来，对位于所得pb1嵌合区段的na包装序列的3’末端上的atg进行突变，以允许全长pb1蛋白的正确翻译。参见gao et al.,j virol.2010；84:8062
–
71,materials and methods。
[0215]
iv.使用方法
[0216]
所公开的delns1-a/b-sars-cov-2-cov2ag嵌合病毒可以用于在有此需要的受试者中有效地增加病毒滴度或引发免疫应答。在一些方面，受试者可以包括老年人(例如，＞
65岁)、幼儿(例如，＜5岁)。用于使用佐剂配制剂改进儿童的免疫应答的方法公开在例如美国公布2017/0202955中。delns1-a/b-sars-cov-2-cov2ag，例如b8038-delns1-sars-cov-2-rbd laiv可以诱导中和抗体和t细胞免疫二者。
[0217]
用于使用佐剂配制剂改进儿童的免疫应答的方法公开在例如美国公布2017/0202955中。
[0218]
通常可以将delns1-a/b sars-cov-2-cov2ag嵌合病毒毒株直接施用于有此需要的哺乳动物，以增加所述哺乳动物中的病毒滴度并引发免疫应答。在一些实施方案中，受试者是小于5岁的幼儿。在其他实施方案中，受试者是小于两岁的幼儿。在实施方案中，组合物经鼻内施用。在其他实施方案中，受试者是老年人，并且受试者的年龄可以在5岁至65岁之间。
[0219]
通常将病毒以药物组合物的形式施用于有此需要的患者。含有病毒的药物组合物可以用于系统性或局部施用。可以配制通过胃肠外(肌内(im)、腹膜内(ip)、静脉内(iv)或皮下注射(sc))或透粘膜(鼻、阴道、肺或直肠)施用途径来施用的剂型。在最优选的实施方案中，通过鼻内或通过肌内注射外周地递送免疫病毒，并且通过局部注射递送治疗性病毒。
[0220]
直接递送可以通过以下方式来完成：胃肠外注射(例如，经皮下、经腹膜内、皮内、经静脉内、经肌内或到组织的间质空间)；或者经粘膜，如通过直肠、口服(例如，片剂、喷剂)、阴道、局部、透皮(参见例如，wo99/27961)或经皮(参见例如，wo02/074244和wo02/064162)、吸入、鼻内(参见例如，wo03/028760)、眼、耳、肺或其他粘膜施用。组合物也可以通过直接转移到皮肤的表面中来局部施用。局部施用可以在不使用任何装置的情况下完成，或者通过使用绷带或绷带样装置使裸露皮肤与组合物接触来完成(参见，例如，美国专利号6,348,450)。在一些方面，施用模式是胃肠外的、粘膜的或者粘膜和胃肠外免疫接种的组合。在其他方面，施用模式是胃肠外的、粘膜的或者粘膜和胃肠外免疫接种的组合，总计接种疫苗1-2次，间隔1-3周。在相关方面，施用途径包括但不限于鼻内递送。
[0221]
a.有效量
[0222]
通常，组合物以有效量施用以诱导针对由嵌合病毒编码的一种或多种sars-cov-2抗原的免疫应答。例如，有效量的病毒通常导致产生抗体和/或活化的t细胞，它们阻断或限制sars-cov-2的增殖或由其引起的感染。
[0223]
组合物通常可以用于引发系统性和/或粘膜免疫，例如引发增强的系统性和/或者粘膜免疫。例如，免疫应答可以通过诱导血清igg和/或肠道iga免疫应答来表征。通常，针对流感感染的保护水平可以超过50％，例如60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在一个方面，保护水平可以为100％。
[0224]
由本发明诱导的免疫应答可以是th1免疫应答和th2应答中的一者或二者。免疫应答可以是改进的或增强的或改变的免疫应答。免疫应答可以是系统性和粘膜免疫应答中的一者或二者。例如，免疫应答可以是增强的系统性和/或粘膜应答。增强的系统性和/或粘膜免疫反映在增强的th1和/或th2免疫应答中。例如，增强的免疫应答可以包括增加igg1和/或igg2a和/或iga的产生。在另一方面，粘膜免疫应答可以是th2免疫应答。例如，粘膜免疫应答可以包括增加igg的产生。
[0225]
通常，活化的th2细胞增强抗体产生，并且因此在回应细胞外感染方面具有价值。活化的th2细胞通常可以分泌il-4、il-5、il-6和il-10中的一种或多种。th2免疫应答也可
以导致igg1、ige、iga和/或记忆b细胞的产生以用于未来的保护。通常，th2免疫应答可以包括以下中的一种或多种：增加与th2免疫应答相关的细胞因子(如il-4、il-5、il-6和il-10)中的一种或多种，或增加igg1、ige、iga和记忆b细胞的产生。例如，增强的th2免疫应答可以包括增加igg1的产生。th1免疫应答可以包括以下中的一种或多种：增加ctl、增加与th1免疫应答相关的细胞因子(如il-2、ifn-γ和tnf-α)中的一种或多种、增加活化的巨噬细胞、增加nk活性或增加igg2a的产生。例如，增强的th1免疫应答可以包括增加igg2a的产生。
[0226]
delns1-sars-cov-2-cov2ag嵌合病毒毒株可以单独使用，或可以与其他药剂组合使用，任选地与能够引发th1和/或th2应答的免疫调节剂组合使用。
[0227]
b.用量
[0228]
确切用量将取决于多种因素，如受试者因变量(例如，年龄、免疫系统健康等)和正被治疗的受试者的年龄。考虑到接受者的治疗背景、年龄和一般健康状况，本领域技术人员可以确定适当的用量。所选择的用量取决于期望的治疗效果、施用途径和期望的治疗持续时间。在确定待施用以用于预防的病毒的有效量时，医师可以评价病毒的循环血浆水平和/或针对抗原的现有抗体的产生。活性病毒也可以根据噬斑形成单位(pfu)来测量。噬斑形成单位可以被定义为单层细胞培养中的细胞溶解(cpe)区域，其在覆盖条件下是由单个病毒颗粒感染引发的。通常，将102至10
12
pfu之间的病毒用量水平施用于人。在不同的实施方案中，用量范围为从104至10
10
pfu、105至109pfu、106至108pfu或这些所陈述的范围内的任何剂量。当要施用多于一种疫苗(即，组合疫苗)时，每种疫苗制剂的量可以在其描述的范围内。
[0229]
取决于施用途径，病毒通常以液体悬浮液的形式施用，以范围在10μl至100μl之间的体积施用。通常使用的疫苗体积在从0.1ml至0.5ml的范围内。一般地，与系统性施用或输注相比，局部注射的用量和体积将会更低。
[0230]
疫苗组合物可以以单剂量或多剂量形式施用。疫苗可以在施用前数小时或数天与佐剂一起制备，并且需经受稳定缓冲液和合适佐剂组合物的鉴定。通常，剂量将为100μl，以多剂量的形式局部施用，而经由皮下、肌内、器官内、静脉内或鼻内施用的系统性或区域性施用可以为例如从10至100μl。
[0231]
v.试剂盒
[0232]
还提供了包括所公开的delns1-a/b-sars-cov-2-cov2ag嵌合病毒毒株的试剂盒。试剂盒可以包括单独的容器，其含有合适的载剂、稀释剂或赋形剂。另外，试剂盒可以包括用于混合或组合成分和/或施用的说明书。
[0233]
组合物可以呈液体形式或者可以是冻干的。用于组合物的合适容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以由包括玻璃或塑料在内的多种材料形成。容器可以具有无菌进入孔(例如，容器可以是具有可被皮下注射针穿透的塞子的静脉输液袋或小瓶)。
[0234]
试剂盒可以进一步包括第二容器，其包含药物上可接受的缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。它还可以含有可用于最终用户的其他材料，其包括其他药物上可接受的配制溶液如缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器或其他递送装置。试剂盒可以进一步包括包含佐剂的第三组分。
[0235]
试剂盒还可以包括包装说明书，其含有诱导免疫、预防感染或治疗感染的方法的书面说明。包装说明书可以是未经批准的包装说明书草案，或可以是经美国食品和药物管理局(the food and drug administration，fda)或其他监管机构批准的包装说明书。
cov-2受体结合结构域(rbd)。
[0254]
16.根据段落1至15中任一项所述的嵌合病毒，其选自下组：ca04-delns1-sars-cov-2-rbd；hk68-delns1-sars-cov-2-rbd；4801-delns1-sars-cov-2-rbd和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd。
[0255]
17.药物组合物，其包含有效量的根据段落1至16中任一项所述的嵌合病毒以及任选的laiva和/laib。
[0256]
18.根据段落17所述的组合物，其进一步包含佐剂。
[0257]
19.根据段落17或18中任一项所述的组合物，其适合于鼻腔施用。
[0258]
20.用于在有此需要的受试者中增加对sars-cov-2的免疫应答的方法，所述方法包括将根据段落1至13中任一项所述的组合物施用于所述受试者。
[0259]
21.活减毒嵌合病毒，其包含(a)乙型流感病毒基因组，其中所述乙型流感病毒基因组包含毒力因子活性的缺失(delns1-b)以及任选的选自下组的一个或多个突变：pa(t210c)、na t(1424c)、np(c182t)和m(a281g)(am/laivb/delns1)，以及(b)编码一种或多种sars-cov-2抗原(cov2ag)的一个或多个基因的插入。
[0260]
22.根据段落21所述的减毒嵌合病毒，其中所述乙型流感病毒基因组来自乙型流感(乙型/hk/8038/2011)(delns1-b8038)。
[0261]
23.根据段落21或22所述的减毒嵌合病毒，其中所述乙型流感病毒不能在干扰素活性细胞中复制。
[0262]
24.根据段落21至23中任一项所述的减毒嵌合病毒，其中所述毒力因子活性的缺失包含毒力因子基因的至少一部分的缺失。
[0263]
25.根据段落21至24中任一项所述的嵌合病毒，其中所述缺失包含非结构蛋白1(ns1)基因的完全缺失。
[0264]
26.根据段落21至25中任一项所述的嵌合病毒，其包含第一组一个或多个突变，其中所述第一组一个或多个突变包含赋予复制能力的第一组一个或多个点突变，其中所述一个或多个突变选自下组：pa(t210c)、na t(1424c)、np(c182t)和m(a281g)(am/lavib/delns1)。
[0265]
27.根据段落21至26中任一项所述的嵌合病毒，其中所述病毒在37℃下在mdck细胞中的复制与其在33℃下在所述mdck细胞中的复制相比较差。
[0266]
28.根据段落21至27中任一项所述的嵌合病毒，其中所述一种或多种cov2ag是sar-cov-2受体结合结构域(rbd)。
[0267]
29.根据段落21至28中任一项所述的嵌合病毒，其中所述嵌合病毒是delns1-b8038-sars-cov-2-rbd。
[0268]
30.药物组合物，其包含有效量的根据段落21至29中任一项所述的嵌合病毒。
[0269]
31.根据段落30所述的组合物，其进一步包含佐剂。
[0270]
32.根据段落30或31中任一项所述的组合物，其适合于鼻腔施用。
[0271]
33.用于在有此需要的受试者中增加对sars-cov-2的免疫应答的方法，所述方法包括将根据段落21至32中任一项所述的组合物施用于所述受试者。
rbd)、4801-delns1-sars-cov-2-rb(在本文中也被为称为4801-delns1-ncov-rbd)和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd(在本文中也被为称为h1n1(2019)-delns1-ncov-rbd)中提取rna，随后将其在卵中传代。使用对sars-cov-2(在本文中也被称为ncov)的ns区段和rbd具有特异性的引物进行rt-pcr，并且通过琼脂糖电泳分析pcr产物。从所有delns1疫苗毒株中观察到正确尺寸的pcr产物、ns和rbd。
[0284]
对sars-cov-2(ncov)rbd在delns1-ncov rbd活减毒病毒感染的mdck细胞中的表达的验证。在0.1moi下用ca04 delns-ncov-rbd、hk68-delns1-ncov-rbd、4801-delns1-ncov-rbd或h1n1(2019)-delns1-ncov rbd感染mdck细胞，或模拟感染16小时。收获细胞裂解物，并且通过使用抗np(针对病毒蛋白np)或抗v5(针对用v5表位标记的rbd)的蛋白质印迹进行分析。如结果中所示，rbd从所有的delns1疫苗毒株中表达。
[0285]
动物研究
[0286]
将两组(每组六只)六至八周龄雌性dpp4转基因小鼠麻醉，然后分别用含有5x10
5 tcid
50
的mers-rbd-delns1、delns1-mers-n或对照(仅pbs)的25μl pbs鼻内接种两次，间隔四周。用mers冠状病毒(500pfu＝10mld
50
；或100pfu＝2mld
50
)攻击小鼠。对小鼠进行为期14天的体重减轻和死亡率监测。
[0287]
实施例1.delns1-mers-rbd和delns1-mers-n laiv疫苗毒株的构建。
[0288]
为了证明概念，将含有衍生自mers冠状病毒的rbd和n的基因区段克隆到ca04-delns1 laiv的ns区段中(wang et al.,mbio 10(5):e12180-19(2019).)(图1a-b)。mers冠状病毒的受体结合结构域(rbd)的序列示出在图4a中。
[0289]
实施例2.接种mers冠状病毒的致死性攻击(2mld
50
)的dpp4转基因小鼠的保护
[0290]
将表达人dpp4受体的转基因小鼠分别用delns1-mers-rbd、delns1-mers-n或对照(pbs)初次免疫两次，间隔四周。然后用致死剂量的mers冠状病毒(100pfu＝2mld
50
)攻击免疫小鼠。对小鼠进行为期14天的体重减轻和死亡率监测。数据示出在图2a和2b中。
[0291]
实施例3.接种mers冠状病毒的致死性攻击(10mld
50
)的dpp4转基因小鼠的保护
[0292]
将表达人dpp4受体的转基因小鼠分别用delns1-mers-rbd、delns1-mers-n或delns1 laivlaiv初次免疫两次，间隔四周。然后用致死剂量的mers冠状病毒(500pfu＝10mld
50
)攻击免疫小鼠。对小鼠进行为期14天的体重减轻和死亡率监测。
[0293]
数据示出在图3a和3b中。
[0294]
实施例4.将2019新型冠状病毒(sars-cov-2)克隆到delns1 laiv载体中
[0295]
sars-cov-2的受体结合结构域的序列示出在图4b中。
[0296]
将含有来自sars-cov-2的rbd的基因区段克隆到ca04-delns1 laiv的ns区段中(wang et al.,mbio 10(5):e12180-19(2019))，如图5中所描绘。对delns1-sars-cov-2-rbd疫苗毒株中的ns区段和rbd插入物的验证示出在图6中。在卵中传代之后，从delns1疫苗毒株ca04-delns-sars-cov-2-rbd、hk68-delns1-sars-cov-2-rbd、4801-delns1-sars-cov-2-rbsd和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbs中提取rna。使用对sars-cov-2的ns区段和rbd具有特异性的引物进行rt-pcr，并且通过琼脂糖电泳分析pcr产物。从所有的delns1疫苗毒株中观察到正确尺寸的pcr产物、ns和rbd。
[0297]
实施例5.sars-cov-2-rbd在delns1-sars-cov-2-rbd活减毒病毒感染的mdck细胞中的表达
[0298]
用0.1moi的ca04-delns-sars-cov-2-rbd、hk68-delns1-sars-cov-2-rbd、4801-delns1-sars-cov-2-rbd或h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd感染mdck细胞，或模拟感染16小时。收获细胞裂解物，并且通过使用抗np(针对病毒蛋白np)或抗v5(针对用v5表位标记的rbd)的蛋白质印迹进行分析。结果表明，rbd从所有的delns1疫苗毒株中表达(图7)。
[0299]
实施例6.保护ace2转基因小鼠免受由sars-cov-2感染引起的疾病
[0300]
用ca04-delns-sars-cov-2-rbd laiv接种ace2转基因小鼠一次或两次(间隔三周)。在最后一次接种疫苗之后三周，用1x10
5 tcid
50
的sars-cov-2或pbs(对照)攻击小鼠。病毒攻击后观察小鼠的体重变化(图8)。用ca04-delns-sars-cov-2-rbd laiv免疫的小鼠示出了较少的体重减轻(一剂)或没有体重减轻，并且在感染后三天之后体重增加(两剂)。
[0301]
应当理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意在限制将仅由所附权利要求限制的本发明的范围。
[0302]
必须注意，如本文和权利要求中所使用的，除非上下文清楚地另有规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。
[0303]
贯穿本说明书的描述和权利要求，词语“包含”和所述词语的变体，如“包括”或“含有”，意指“包括但不限于”，并且不旨在排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。
[0304]“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件、情况或材料可以或可以不发生或存在，并且所述描述包括事件、情况、材料发生或存在的例子以及不发生或不存在的例子。
[0305]
范围在本文中可以被表达为从“约”一个特定值和/或至“约”另一特定值。除非上下文另有明确指示，否则当表达此种范围时，也特别考虑并认为所公开的是从一个特定值和/或到另一个特定值的范围。相似地，除非上下文另有明确指示，否则当通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，将理解特定值形成了另一具体考虑的实施方案，其应被认为是公开的。将进一步理解，除非上下文另有明确指示，否则重要的是每个范围的端点都与另一个端点有关并且独立于另一个终点。应当理解，除非上下文另有明确指示，否则包含在明确公开的范围内的所有单独的值和值的子范围也都是被具体考虑的，并且应当被认为是公开的。最后，应当理解，所有范围是指所列举的范围既作为范围又作为从并包括第一端点到并包括第二端点的个体数字的集合。在后者的情况下，应该理解，可以选择个体数字中的任何一个作为范围所指的数量、值或特性的一种形式。以这种方式，范围描述了从并包括第一端点到并包括第二端点的一组数字或值，从中可以选择所述组的单个成员(即单个数字)作为范围所指的数量、值或特性。无论在特定情况下是否明确公开了这些实施方案中的一些或全部，前述内容都适用。
[0306]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可以用于本方法和组合物的实践或测试，但如所描述的是特别有用的方法、装置、和材料。本文引用的出版物及其引用的材料在此具体地通过引用并入。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权凭借现有发明而先于此种公开。不承认任何引用构成现有技术。对参考文献的讨论陈述了作者的主张，并且申请人保留对引用文件的准确性和针对性提出质疑的权利。将清楚地理解，尽管本文引用了许多出版物，但此种引用并不构成承认这些文件中的任何一个构成本领域公知常识的一部分。
[0307]
尽管对材料、组合物、组分、步骤、技术等的描述可以包括许多的选项和替代方案，但这不应被解释为并且也不是承认此类选项和替代方案彼此等效或者特别是明显的替代方案。因此，例如，不同部分的列表并不指示所列出的部分彼此是显而易见的，也不是对等效性或显而易见性的承认。

技术特征：
1.活减毒嵌合病毒，其包含(a)甲型流感病毒基因组或乙型流感病毒基因组，其中所述甲型流感病毒基因组包含毒力因子活性的缺失以及任选的第一组一个或多个突变和第二组一个或多个突变，所述第一组一个或多个突变在不存在所述毒力因子活性的情况下在37℃下赋予复制，并且所述第二组一个或多个突变在低于35℃的温度下赋予复制，其中所述乙型流感病毒基因组包含毒力因子活性的缺失(delns1-b)以及任选的选自下组的一个或多个突变：pa(t210c)、na t(1424c)、np(c182t)和m(a281g)(am/laivb/delns1)，以及(b)编码一种或多种sars-cov-2抗原(cov2ag)的一个或多个基因的插入，或编码选自下组的一种或多种血凝素(h)或神经氨酸酶(n)亚型的一个或多个基因的插入：h1、h2、h3、h5、h6、h7、h9、h10、n1、n2、n6-n9。2.根据权利要求1所述的减毒嵌合病毒，其中所述流感病毒基因组来自：(a)甲型流感病毒亚型h1n1或h3n2，或(b)乙型流感病毒(乙型/hk/8038/2011)(delns1-b8038)。3.根据权利要求1或2所述的减毒嵌合病毒，其中(a)所述流感病毒基因组来自选自下组的甲型流感病毒亚型h1n1或h3n2毒株：ca04(甲型/加利福尼亚/04/2009)；hk68(甲型/香港/1/68毒株)、4801(h3n2甲型/hk/4801/2014)、h1n1(2019)；a/wsn/33和a/pr/8/34；或(b)其中所述乙型流感病毒不能在干扰素活性细胞中复制。4.根据权利要求1至3中任一项所述的减毒嵌合病毒，其中所述毒力因子活性的缺失包含毒力因子基因的至少一部分的缺失。5.根据权利要求1至4中任一项所述的嵌合病毒，其中所述缺失包含延伸超过突变病毒的非结构蛋白1(ns1)区段的核苷酸57至528的ns1基因的至少一部分的缺失。6.根据权利要求1至5中任一项所述的嵌合病毒，其包含第一组一个或多个突变，其中所述第一组一个或多个突变包含赋予复制能力的第一组一个或多个点突变，任选地其中所述嵌合病毒是laivb并且其中所述一个或多个突变选自下组：pa(t210c)、na t(1424c)、np(c182t)和m(a281g)(am/lavib/delns1)。7.根据权利要求1至5中任一项所述的嵌合病毒，其中所述第一组一个或多个点突变位于突变流感病毒的m区域的外部。8.根据权利要求3所述的嵌合病毒，其中所述流感病毒基因组来自甲型/加利福尼亚/04/2009流感毒株，并且所述第一组一个或多个点突变中的至少一个是所述病毒基因组中的g346a突变；所述嵌合病毒是b8038-delns1-sars-cov-2-rbd，或其中所述一种或多种cov2ag是sar-cov-2受体结合结构域(rbd)。9.根据权利要求1至8中任一项所述的嵌合病毒，其中所述病毒在37℃下在mdck细胞中的复制与其在33℃下在所述mdck细胞中的复制相比较差。10.根据权利要求1至7中任一项所述的嵌合病毒，其中所述第二组一个或多个突变包含第二组一个或多个点突变。11.根据权利要求3所述的嵌合病毒，其中所述第一组一个或多个突变包含病毒rna的m区段的3’非编码区中的a14u取代，并且所述嵌合病毒是delns1-a/b-sars-cov-2-cov2ag。12.根据权利要求1至9中任一项所述的嵌合病毒，其中所述第二组一个或多个点突变中的至少一个成员选自所述流感病毒基因组中的t261g和a310g突变，并且所述嵌合病毒是delns1-a/b-sars-cov-2-cov2ag。13.根据权利要求12所述的嵌合病毒，其包含在低于35℃的温度下赋予复制的第三组
一个或多个突变。14.根据权利要求12所述的嵌合病毒，其中所述第三组一个或多个突变包含第三组一个或多个点突变，所述第三组一个或多个点突变与所述第二组一个或多个点突变不同并且选自h1n1流感病毒基因组中的t261g和a310g突变，并且所述嵌合病毒是delns1-a/b-sars-cov-2-cov2ag。15.根据权利要求1至13中任一项所述的嵌合病毒，其中所述抗原不是sars-cov-2的全长刺突蛋白，并且任选地，其中所述一种或多种cov2ag是所述sar-cov-2受体结合结构域(rbd)。16.根据权利要求1所述的嵌合病毒，其选自下组：ca04-delns1-sars-cov-2-rbd；hk68-delns1-sars-cov-2-rbd；4801-delns1-sars-cov-2-rbd和h1n1(2019)-delns1-sars-cov-2-rbd。17.药物组合物，其包含有效量的根据权利要求1至16中任一项所述的嵌合病毒。18.根据权利要求17所述的组合物，其进一步包含佐剂。19.根据权利要求17或18中任一项所述的组合物，其呈适合于鼻腔施用的形式。20.根据权利要求17至19中任一项所述的组合物，其进一步包含laiva和/或laivb。21.根据权利要求17至20中任一项所述的组合物，其进一步包含ca4-delns1和/或deins1-b8038hk。22.用于在有此需要的受试者中增加对sars-cov-2的免疫应答的方法，所述方法包括将根据权利要求1至16中任一项所述的嵌合病毒或根据权利要求17至21中任一项所述的组合物施用于所述受试者。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述病毒经鼻内或经肌内施用。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述病毒经鼻内施用。25.用于在有此需要的受试者中增加对sars-cov-2和流感病毒的免疫应答的方法，所述方法包括将根据权利要求20所述的组合物施用于所述受试者。

技术总结
提供了用于预防新型冠状病毒Sars-CoV-2的活减毒病毒。活减毒嵌合病毒毒株基于活减毒甲型或乙型流感病毒(LAIVA/B)，其使用包括病毒毒力元件NS1(非结构蛋白1)的缺失(DeLNS1)的骨架，所述骨架被工程化以表达Sars-CoV-2中的一种或多种抗原(在本文中为CoV2Ag)。嵌合病毒毒株在本文中通常被称为DelNS1-A/B-Sars-CoV-2-CoV2Ag。DelNS1-A/B-Sars-CoV-2-CoV2Ag毒株优选地示出自发的冷适应，优选地在30℃-33℃下生长。包括嵌合病毒的组合物还与LAIVA/B一起作为共组合物提供。DelNS1-A/B-Sars-CoV-2-CoV2Ag毒株可以用来保护有此需要的受试者免受Sars-CoV-2的攻击。共组合物可以用来保护有此需要的受试者免受Sars-CoV-2和甲型和/或乙型流感的攻击。和/或乙型流感的攻击。


技术研发人员：陈鸿霖 王培 陈志伟 袁国勇
受保护的技术使用者：港大科桥有限公司
技术研发日：2021.12.10
技术公布日：2023/8/24