一种基于Cu3(HHTP)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器的制备及应用

一种基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器的制备及应用
技术领域
1.本发明涉及免疫传感器领域，具体的说是一种基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器的制备及应用。


背景技术：

2.c-反应蛋白(crp)是与身体炎症有关的关键性标志物，血清中crp水平与多种复杂的慢性疾病密切相关，因此定量检测crp具有重大的意义。crp的异常表达与心血管疾病、阿尔茨海默症、肺癌等有密切联系，因此在低丰度水平上实现crp的灵敏测定对于精确评估临床疾病至关重要。
3.目前血清中crp的检测主要基于免疫学原理；临床常用的检测方法有免疫浊度法和比浊法，以及酶联免疫吸附、荧光、放射等方法。由于上述方法普遍不够敏感，耗时长，容易产生假阴性结果或者成本高，效益低,并且操作繁琐、仪器庞大、不适合于冠心病潜在人群的现场筛查。
4.免疫传感器具有成本低，灵活性强和高灵敏度，快速和便携等优点，最具发展前景，在临床类样品检测中应用越来越广泛。目前报道的夹心法型酶联免疫传感器常用辣根过氧化物酶做标记物，存在易失活,实验条件苛刻,不易保存,制备困难,成本高等缺点，无法满足现场检测的需要。
5.本技术以ru@cu3(hhtp)2为供体，go-au为受体实现电化学发光共振能量转移(ecl-ret)，并以此能量转移机制构筑电化学发光免疫传感器，实现对c-反应蛋白的高灵敏分析。


技术实现要素：

6.本发明旨在提供一种基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器的制备及应用，以对c-反应蛋白进行高灵敏度的检测。
7.为了解决以上技术问题，本发明采用的具体方案为：一种基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
8.s1：制备ru@cu3(hhtp)2纳米片；将cu(co2ch3)2·
h2o和hhtp分别溶于甲醇中，混合、离心处理得到cu3(hhtp)2纳米片，再加入ru(bpy)3cl2水溶液得到ru@cu3(hhtp)2纳米片；
9.s2：制备bsa封闭的ru@cu3(hhtp)
2-ab1生物偶联物；将步骤s1得到的ru@cu3(hhtp)2纳米片分散在水中，加入aptes交联反应，再加入ab1溶液，离心处理，加入bsa溶液，得到bsa封闭的ru@cu3(hhtp)
2-ab1生物偶联物，备用；
10.s3：制备go-au纳米复合体；将au nps加入go@pei溶液中，搅拌、离心处理得到go-au纳米复合体；
11.s4：制备bsa封闭的go-au-ab2生物偶联物；将步骤s3制备的go-au纳米复合体分散在pbs中得到go-au悬液；加入ab2溶液，离心处理，再加入bsa溶液，得到bsa封闭的go-au-ab2生物偶联物，备用；
12.s5：制备基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器；将bsa封闭的ru@cu3(hhtp)
2-ab1缓慢滴在工作电极上；干燥后再将不同浓度的crp抗原置于工作电极上识别并结合到已与ru@cu3(hhtp)2偶联的ab1，将bsa封闭的go-au-ab2生物偶联物作为ecl猝灭剂添加到涂有crp抗原和ru@cu3(hhtp)
2-ab1的工作电极上；用缓冲溶液洗脱未结合的go-au-ab2，完成工作电极的制备，再将制备完成的工作电极装配在免疫传感器上，即制得所述基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器。
13.作为上述技术方案的进一步优化，步骤s1具体为：s101：将cu(co2ch3)2·
h2o溶解于甲醇中，制得溶液ⅰ；将hhtp溶于甲醇中制得溶液ⅱ；将溶液ⅰ和溶液ⅱ混合，热反应、离心处理得到cu3(hhtp)2纳米片；s102：将cu3(hhtp)2纳米片真空干燥制得cu3(hhtp)2粉末；s103：将cu3(hhtp)2粉末分散在水中并注入ru(bpy)3cl2水溶液，油浴后离心、冻干处理处理得到ru@cu3(hhtp)2纳米片。
14.作为上述技术方案的进一步优化，步骤s101中，将溶液ⅰ和溶液ⅱ混合混合在圆底烧瓶中，磁搅拌10min后，将混合物缓慢加入到聚四氟乙烯高压釜中，65℃下保存24h，溶剂热反应后，离心得到cu3(hhtp)2纳米片。
15.作为上述技术方案的进一步优化，步骤s2具体为：s201：将步骤s1制得的ru@cu3(hhtp)2纳米片分散在水中，加入aptes，油浴、离心处理得到表面负载aptes的ru@cu3(hhtp)2纳米片；s203：将表面负载aptes的ru@cu3(hhtp)2纳米片与ga作为交联剂混合，以使连接在ru@cu3(hhtp)2纳米片表面的aptes氨基激活；s204：将aptes氨基激活的ru@cu3(hhtp)2纳米片在pbs中分散，加入ab1溶液，离心处理，得到ru@cu3(hhtp)
2-ab1生物偶联物；s205：将ru@cu3(hhtp)
2-ab1生物偶联物溶解在pbs中，加入bsa溶液，以将ru@cu3(hhtp)
2-ab1表面残留的非特异性活性位点封闭，即制得bsa封闭的ru@cu3(hhtp)
2-ab1。
16.作为上述技术方案的进一步优化，步骤s3具体为：s301：将haucl4·
4h2o溶液加入水中，加热至沸腾后加入还原剂，搅拌、冷却、离心处理得到au nps；s302：将pei溶液加入到go溶液中，搅拌、离心处理得到go@pei；s303：将au nps加入go@pei溶液中，搅拌、离心处理得到go-au纳米复合体。
17.作为上述技术方案的进一步优化，步骤s302具体为：将pei溶液加入到go溶液中，然后在60℃下搅拌12h，通过离心和洗涤得到go@pei，并在水中进一步分散，得到go@pei溶液中。
18.作为上述技术方案的进一步优化，步骤s4具体为：s401：将步骤s3制备的go-au纳米复合体分散在pbs中得到go-au悬液；s402：将edc和nhs组成的偶联液加入到go-au悬液中以活化分布在go-au表面的羧基；s403：将ab2溶液引入羧基活化的go-au中，离心处理得到go-au-ab2生物偶联物；s404：将go-au-ab2生物偶联物在pbs中分散，加入bsa以封闭go-au-ab2生物偶联物表面的非特异性活性位点，即制得bsa封闭的go-au-ab2生物偶联物。
19.作为上述技术方案的进一步优化，步骤s5具体为：s501：由氧化铝粉末和水组成的抛光液对工作电极进行抛光，再用水/乙醇冲洗，并用n2干燥；s502：将bsa封闭的ru@cu3(hhtp)
2-ab1作为ecl发射物缓慢滴到预处理后的工作电极上；s503：将不同浓度的crp抗原置于工作电极上识别并结合到已与ru@cu3(hhtp)2偶联的ab1；s504：将bsa封闭的go-au-ab2生物偶联物作为ecl猝灭剂添加到涂有crp抗原和ru@cu3(hhtp)
2-ab1的工作电极上进行免疫；s505：免疫结束后，用缓冲溶液洗脱未结合的go-au-ab2，即制得免疫传感器。
20.作为上述技术方案的进一步优化，步骤s503中，将bsa封闭的ru@cu3(hhtp)
2-ab1作为ecl发射物缓慢滴到预处理的gce之后，在4℃下干燥，再将不同浓度的crp抗原置于上述gce上识别并结合到已与ru@cu3(hhtp)2偶联的ab1，在37℃下保持30min后，用pbs洗脱未结合的crp。
21.一种基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器在c-反应蛋白检测中的应用。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
23.本发明所使用的cu3(hhtp)2纳米片是一种电子导电金属有机框架(mof)，其具有空腔大小为2nm的周期性排列多孔结构，不仅能够容纳大量的ru(bpy)
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，同时也限制了活性物质的空间扩散。因此，ru@cu3(hhtp)2作为ecl发射器能表现出更高的ecl效率。本发明所制备的go-au复合材料中go允许承载大量的au颗粒，避免了其在空间中的聚集，从而有效地猝灭了ru@cu3(hhtp)2的ecl。采用基于ecl-ret机制的夹心型电化学发光免疫传感器，可靶向检测人血清样本中的crp，并且检测限低达0.26pg ml-1
。
24.电化学发光(ecl)，一种电驱动发光现象，因具有背景信号低、响应速度快、电位可调、信号易读出等优点而被广泛用于生物传感领域。基于cu3(hhtp)2纳米片较高的孔密度及优异的电催化性能，可负载大量ru(bpy)
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发光体，构筑ru@cu3(hhtp)2ecl复合体，从而实现在共反应剂三丙胺(tpa)存在下较强的ecl。同时，利用氧化石墨烯纳米片(go)较大的比表面积和优良的电子传输性能，可承载大量的au颗粒，避免了其在空间中的聚集，形成go-au复合体。
附图说明
25.图1中：(a)go-au-ab2的制备过程图；(b)ru@cu3(hhtp)
2-ab1制备过程图；(c)ecl-ret免疫传感器的组装过程图；
26.图2中：(a)cu3(hhtp)2晶体的透射电镜图；(b)不同粒子对应的zeta-电势图(cu3(hhtp)2、ru@cu3(hhtp)2、ru@cu3(hhtp)
2-aptes)；(c)(a)ru@cu3(hhtp)2，(b)cu3(hhtp)2，(c)ru(bpy)
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的紫外-可见吸收光谱；(d)所合成的cu3(hhtp)2、ru@cu3(hhtp)2、ru@cu3(hhtp)
2-aptes的红外光谱；
27.图3中：不同浓度crp(a-i：0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50ng ml-1
)信号猝灭ecl-ret免疫分析系统的ecl曲线(a)和相应的校准曲线(b)；所述免疫传感器的稳定性(c)(crp水平分别为0.1和10ng ml-1
)和选择性(d)(crp：5ng ml-1
；其他干扰剂：500ng ml-1
)。误差条表示标准差(n＝3)；
28.图4中：(a)cu3(hhtp)2的扫描电镜图像；(b)go的透射电镜图像；(c)go-au的透射电镜图像；
29.图5中：(a)go、(b)go-au、(c)au的紫外-可见吸收光谱；
30.图6中：(a)go-au(a)的紫外-可见吸收光谱和ru@cu3(hhtp)2(b)的ecl发射光谱；(b)不同修饰电极的ecl曲线：(a)gce/ru@cu3(hhtp)2/ab1/bsa/crp；(b)gce/ru@cu3(hhtp)2/ab1/bsa/crp/go-ab2；(c)gce/ru@cu3(hhtp)2/ab1/bsa/crp/au-ab2；(d)gce/ru@cu3(hhtp)2/ab1/bsa/crp/go-au-ab2。
具体实施方式
31.下面对本发明的技术方案做进一步的详细阐述，本发明以下实施例中未详细记载和公开的部分，均应理解为本领域技术人员所知晓或应当知晓的现有技术。
32.本发明公开了一种基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
33.s1：制备ru@cu3(hhtp)2纳米片；将cu(co2ch3)2·
h2o和hhtp分别溶于甲醇中，混合、离心处理得到cu3(hhtp)2纳米片，再加入ru(bpy)3cl2水溶液得到ru@cu3(hhtp)2纳米片；
34.s101：将cu(co2ch3)2·
h2o溶解于甲醇中，制得溶液ⅰ；将hhtp溶于甲醇中制得溶液ⅱ；将溶液ⅰ和溶液ⅱ混合，热反应、离心处理得到cu3(hhtp)2纳米片；具体是将溶液ⅰ和溶液ⅱ混合混合在圆底烧瓶中，磁搅拌10min后，将混合物缓慢加入到聚四氟乙烯高压釜中，65℃下保存24h，溶剂热反应后，离心得到cu3(hhtp)2纳米片。
35.s102：将cu3(hhtp)2纳米片真空干燥制得cu3(hhtp)2粉末；
36.s103：将cu3(hhtp)2粉末分散在水中并注入ru(bpy)3cl2水溶液，油浴后离心、冻干处理处理得到ru@cu3(hhtp)2纳米片。
37.s2：制备bsa封闭的ru@cu3(hhtp)
2-ab1生物偶联物；将ru@cu3(hhtp)2纳米片分散在水中，加入aptes交联反应，再加入ab1溶液，离心处理，加入bsa溶液，得到bsa封闭的ru@cu3(hhtp)
2-ab1生物偶联物，备用；
38.s201：将步骤s1制得的ru@cu3(hhtp)2纳米片分散在水中，加入aptes，油浴、离心处理得到表面负载aptes的ru@cu3(hhtp)2纳米片；
39.s203：将表面负载aptes的ru@cu3(hhtp)2纳米片与ga作为交联剂混合，以使连接在ru@cu3(hhtp)2纳米片表面的aptes氨基激活；
40.s204：将aptes氨基激活的ru@cu3(hhtp)2纳米片在pbs中分散，加入ab1溶液，离心处理，得到ru@cu3(hhtp)
2-ab1生物偶联物；
41.s205：将ru@cu3(hhtp)
2-ab1生物偶联物溶解在pbs中，加入bsa溶液，以将ru@cu3(hhtp)
2-ab1表面残留的非特异性活性位点封闭，即制得bsa封闭的ru@cu3(hhtp)
2-ab1。
42.s3：制备go-au纳米复合体；将au nps加入go@pei溶液中，搅拌、离心处理得到go-au纳米复合体；
43.s301：将haucl4·
4h2o溶液加入水中，加热至沸腾后加入还原剂，搅拌、冷却、离心处理得到au nps；
44.s302：将pei溶液加入到go溶液中，搅拌、离心处理得到go@pei；
45.s303：将au nps加入go@pei溶液中，搅拌、离心处理得到go-au纳米复合体。
46.s4：制备bsa封闭的go-au-ab2生物偶联物；将步骤s3制备的go-au纳米复合体分散在pbs中得到go-au悬液；加入ab2溶液，离心处理，再加入bsa溶液，离心处理制得bsa封闭的go-au-ab2生物偶联物，备用；
47.s401：将步骤s3制备的go-au纳米复合体分散在pbs中得到go-au悬液；
48.s402：将edc和nhs组成的偶联液加入到go-au悬液中以活化分布在go-au表面的羧基；
49.s403：将ab2溶液引入羧基活化的go-au中，离心处理得到go-au-ab2生物偶联物；
50.s404：将go-au-ab2生物偶联物在pbs中分散，加入bsa以封闭go-au-ab2生物偶联物
表面的非特异性活性位点，即制得bsa封闭的go-au-ab2生物偶联物。
51.s5：制备基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器；将bsa封闭的ru@cu3(hhtp)
2-ab1缓慢滴到工作电极上；将不同浓度的crp抗原置于工作电极上识别并结合到已与ru@cu3(hhtp)2偶联的ab1，将bsa封闭的go-au-ab2生物偶联物作为ecl猝灭剂添加到涂有crp抗原和ru@cu3(hhtp)
2-ab1的工作电极上进行免疫；用缓冲溶液洗脱未结合的go-au-ab2，即制得免疫传感器。
52.s501：由氧化铝粉末和水组成的抛光液对工作电极进行抛光，再用水/乙醇冲洗，并用n2干燥；
53.s502：将bsa封闭的ru@cu3(hhtp)
2-ab1作为ecl发射物缓慢滴到预处理后的工作电极上；
54.s503：将不同浓度的crp抗原置于工作电极上识别并结合到已与ru@cu3(hhtp)2偶联的ab1s504：将bsa封闭的go-au-ab2生物偶联物作为ecl猝灭剂添加到涂有crp抗原和ru@cu3(hhtp)
2-ab1的工作电极上进行免疫；
55.s505：免疫结束后，用缓冲溶液洗脱未结合的go-au-ab2，完成工作电极的制备，再将制备完成的工作电极装配在免疫传感器上，即制得所述基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器。需要说明的是，将工作电极装配在免疫传感器上为现有技术，在此不再赘述。
56.下面结合附图及具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的详细阐述。
57.实施例1
58.ru@cu3(hhtp)2纳米片的制备：
59.将0.110g的cu(co2ch3)2·
h2o溶解于35ml的甲醇中，形成金属前体溶液。将0.087g hhtp加入42ml甲醇中，用超声波处理5min。将以上两个分散的前体溶液混合在100ml圆底烧瓶中。磁搅拌10min后，将混合物缓慢加入到100ml的聚四氟乙烯高压釜中，65℃下保存24h。溶剂热反应后，离心(9000rpm，10min)得到黑色cu3(hhtp)2纳米片。然后，分别用甲醇和丙酮洗涤样品几次。洗涤后，将样品放在323k的空气中干燥6h，在373k的真空下干燥12h。将50mg制备好的cu3(hhtp)2粉末超声分散在10ml水中，然后将0.3ml的50mm ru(bpy)3cl2水溶液注入分散液中。超声处理15min后，将混合物置于油浴中，并在60℃下搅拌12h。随后，通过离心(9000rpm，10min)收集ru(bpy)
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修饰的cu3(hhtp)2纳米片(ru@cu3(hhtp)2)，并用水洗涤。将收集到的最终沉淀物冻干12h，得到ru@cu3(hhtp)2纳米片。
60.go-au纳米复合体的制备:
61.将1ml haucl4·
4h2o溶液(10mg ml-1
)混入97ml水中，生成黄色溶液，加热至沸腾。在剧烈搅拌下，将3ml柠檬酸三钠(10mg ml-1
)作为还原剂快速添加到煮沸的溶液中。将得到的混合物持续搅拌15min，直到其颜色从亮黄色变成酒红色。冷却至室温后，将混合物离心(12000rpm，12min)，用水洗涤，并在5ml水中重新分散。对于go的表面改性，将0.5ml pei溶液(100mg ml-1
)加入到5mlgo溶液(5mg ml-1
)中，然后在60℃下搅拌12h。通过离心和洗涤得到5个pei修饰的go(go@pei)，并在5ml水中进一步分散。对于go和au nps之间的连接，将0.8ml au nps加入5ml go@pei溶液中，在室温下搅拌10h。最后，离心并收集go-au复合体，水洗后，分散在5ml pbs中。
62.ru@cu3(hhtp)
2-ab1生物偶联物的制备:
63.在抗体偶联前，氨基功能化的ru@cu3(hhtp)2合成如下：将4mgru@cu3(hhtp)2固体分散在5ml水中，超声处理15min。倒入100μl aptes，在55℃油浴中搅拌溶液。反应16h，离心/洗涤后得到沉淀的样品。然后在以上沉淀中加入5ml的水，重新分散发光复合物以供后续使用。随后，通过将2.5ml 0.8mg ml-1
ru@cu3(hhtp)2与ga作为交联剂混合，实现了连接在ru@cu3(hhtp)2纳米片表面的aptes氨基的激活。在4℃下反应2h后，将活化产物离心洗涤纯化，并在2.5ml pbs中重新分散。为了将捕获抗体与氨基活化的ru@cu3(hhtp)2偶联，加入100μl的ab1溶液(10μg ml-1
，用100mmpbs稀释)。在4℃下孵育12h后，离心收集ru@cu3(hhtp)
2-ab1生物偶联物，洗涤两次以去除残留的ab1。将纯化后的ru@cu3(hhtp)
2-ab1再次溶解在2.5ml pbs中。然后加入100μl bsa溶液(5％，溶解在100mmpbs中)，将ru@cu3(hhtp)
2-ab1表面残留的非特异性活性位点封闭。通过离心收集bsa封闭的ru@cu3(hhtp)
2-ab1，分散在2.5ml pbs中。
64.go-au-ab2生物偶联物的制备：
65.为制备检测抗体(ab2)修饰的go-au识别体，将100μl由edc(80mm)和nhs(40mm)组成的偶联液加入到2ml的1.8mg ml-1
go-au悬液中以活化分布在go-au表面的羧基。将混合溶液在室温下振荡30min。然后，将100μl的ab2溶液(10μg ml-1
，溶解在100mm的pbs中)引入羧基活化的go-au中。结合过程需要在4℃下进行12h。通过离心获得go-au-ab2生物偶联物，用pbs洗涤去除多余的ab2，并在2ml pbs中重新分散。为封闭go-au-ab2生物偶联物表面的非特异性活性位点，加入100μl bsa作为，在4℃下反应4h，收集纯化的go-au-ab2/bsa生物偶联物，在2ml pbs中分散。
66.制备基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器：
67.基于ecl的免疫测定在三电极系统中进行，其制备过程如图1所示。在组装信号探针前，用由氧化铝粉末和水组成的抛光液对工作电极(gce，3mm)进行抛光，再用水/乙醇冲洗，并用n2干燥。然后，将8μl bsa封闭的ru@cu3(hhtp)
2-ab1作为ecl发射物缓慢滴到预处理的gce上。在4℃下干燥完成后，将不同浓度的crp抗原置于上述gce上识别并结合到已与ru@cu3(hhtp)2偶联的ab1。在37℃下保持30min后，用pbs洗脱未结合的crp。为了将ab2固定在gce表面，将8μl的go-au-ab2生物偶联物作为ecl猝灭剂添加到涂有crp抗原和ru@cu3(hhtp)
2-ab1的gce上。免疫反应结束后，用缓冲溶液洗脱未结合的go-au-ab2。最后，将基于ecl的免疫传感器保存于4℃，以供下一步检测。
68.《ru@cu3(hhtp)2纳米片的表征》
69.由醋酸铜(ⅱ)与hhtp水热反应制备的cu3(hhtp)2片状晶体作为该夹心型免疫传感器中发光ru(bpy)
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的支撑材料。扫描电子显微镜(sem)图像(图4a)表明，cu3(hhtp)2晶体倾向于形成平均大小为50nm的团聚球形颗粒。根据透射电子显微镜(tem)分析(图2a)，cu3(hhtp)2晶体由堆叠的片状纳米结构组成。为了确定与ru(bpy)
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和cu3(hhtp)2相关的静电相互作用，使用zeta电位分析仪确定了cu3(hhtp)2和ru@cu3(hhtp)2的表面电势。如图2b所示，cu3(hhtp)2的zeta电位约为-15.27mv，经带正电荷的ru(bpy)
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修饰后，该值变为-6.53mv。表面电位的变化表明，ru(bpy)
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通过静电吸附成功地固定在cu3(hhtp)2的孔隙和表面上。同时，记录了ru(bpy)
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、cu3(hhtp)2和ru@cu3(hhtp)2的紫外-可见光谱，证明了ru(bpy)
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与cu3(hhtp)2的结合。cu3(hhtp)2在275、368和650nm处均有明显的吸收峰(图2c，线b)。对于ru(bpy)
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的水溶液，光谱在243、285和454nm处(线c)处显示出较强的吸收强度。在
ru@cu3(hhtp)2中，ru(bpy)
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为285nm，cu3(hhtp)2为364nm，表明ru(bpy)
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和cu3(hhtp)2成功结合。为了进一步研究ru@cu3(hhtp)2的表面化学性质，对cu3(hhtp)2和ru@cu3(hhtp)2的红外光谱进行了表征(图2d)。cu3(hhtp)2的光谱在1214和1446cm-1
处出现了两个强峰，分别对应于c-o伸缩振动和c-h剪切振动。在3340cm-1
处观察到一个较宽的吸收带，这归因于氢键o-h伸缩振动。与原始cu3(hhtp)2相比，在负载ru(bpy)
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后，ru@cu3(hhtp)2具有了类似的红外图谱，证明了cu3(hhtp)2的结构稳定性。在ru@cu3(hhtp)2表面对与ab1连接的氨基进行修饰。在ru@cu3(hhtp)
2-aptes的光谱中，在1016和1103cm-1
处发现了si-o特征峰，揭示了aptes的存在。在与aptes相互作用后，ru@cu3(hhtp)2的zeta电位从负电位变为正电位(+5.67mv)，证实了aptes在ru@cu3(hhtp)2表面的成功功能化。
70.《go-au纳米复合材料的及表征》
71.在ecl-ret过程中，保持载体表面的au nps均匀分布对于促进au nps与ru(bpy)
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之间的ecl-ret至关重要。因此，通过透射电镜试验对go-au复合材料的形貌进行了表征。具有褶皱片状结构(图4b)的go作为载体，装载au nps。透射电镜图像(图4c)明确表明，直径为16nm的au nps在氧化石墨烯表面分布良好。
72.《go-au和ru@cu3(hhtp)2之间的ecl-ret行为》
73.为了确认go-au和ru@cu3(hhtp)2之间的ecl-ret行为，测量了go、aunps和ru@cu3(hhtp)2的光谱剖面图。氧化石墨烯薄片和aunps的紫外-可见光谱(图5)的特征峰分别为230和520nm。go-au吸收光谱在230(go)和520(aunps)nm处有两个明显的峰，证明了氧化石墨烯上存在aunps。ru@cu3(hhtp)2的ecl发射峰为620nm(图6a，曲线b)。这些光谱显示，在580-680nm的光谱范围内，go-au吸收光谱与ru@cu3(hhtp)2的ecl发射有完美的重叠，使ret过程成为可能。记录ecl信号以评估go、aunps和go-au对ecl-ret过程的影响(图6b)。当抗原抗体修饰的ru@cu3(hhtp)2在gce电极上孵育时，强度-电位图从1.0v明显上升到1.3v(曲线a)。将ab2连接的氧化石墨烯注入测试系统，在1.3v时ecl强度急剧下降，表明ru(bpy)
32+
和go之间存在猝灭行为。此外，在加入ab2连接的au nps后，ecl信号从8200减小到1850a.u，从而证实了au nps向ru(bpy)
32+
的能量转移。当相同浓度的go-au-ab2存在时，ru@cu3(hhtp)2仅能观察到5％的ecl强度。结果表明，go-au可以有效地猝灭ru@cu3(hhtp)2的ecl。
74.《对c-反应蛋白的基于ret的ecl免疫分析法》
75.在最佳条件下，不同crp浓度的免疫传感器获得的ecl强度-电位图如图3a所示。将ru@cu3(hhtp)2覆盖的gce电极与0.005～50ngml-1
的crp孵育，然后用于捕获ab2标记的go-au，结果导致了ecl强度逐渐降低。因此，本技术开发了基于ret的ecl免疫传感器。图3b显示了ecl强度(i)与crp浓度的对数(lg c)之间的相关性，线性方程为i＝2841-1530.22lgc(相关系数0.991)。检测限为0.26pg ml-1
，表明构建的基于ret的ecl免疫分析法足以评估临床样本中的crp水平。与crp的其他代表性检测方法的检测限和线性范围相比，ru@cu3(hhtp)2/go-au系统为crp的测试提供了良好的性能，如表1所示。
76.表1
77.此外，优越的选择性和稳定性是评估ecl免疫传感器检测结果准确性的关键。稳定性的测量结果如图3c所示。连续扫描10个周期并分别在0.1和10ng ml-1
的crp处记录稳定的ecl响应信号。根据ecl峰值强度，计算出的相对标准差(rsd)分别为1.75％(ccrp＝0.1ng ml-1
)和1.59％(ccrp＝10ng ml-1
)，说明制备的ecl传感器具有优越的稳定性。为了验证夹心型免疫传感器的选择性，本技术进行了一系列的对照实验。虽然干扰蛋白(ca125、afp、bsa和psa)的浓度比目标crp高100倍(干扰和crp分别为500和5ngml)，但得到的ecl强度几乎与空白样品的相同(图3d)。这些结果表明，由于缺乏识别抗原，gec没有捕获go-au-ab2的生物偶联物。然而，当测试系统中含有crp时，ecl强度显著下降，表明只有crp可以与ru@cu3(hhtp)
2-ab1结合。综上，夹心型免疫传感器具有优良的稳定性和选择性，可以用于测定人血清样本中的crp水平。
78.《人血清中c反应蛋白的检测》
79.为了证明夹心型免疫传感器的适用性，将其插入到人血清样本中，以检测crp水平。采用标准添加法验证免疫传感器的准确性，通过在血清样本中加入几种标准浓度的crp(0.1、2和10ng ml-1
)来获得ecl。所有结果如表2所示，回收范围为98.2％～99.0％，rsd(n＝3)低于3％，证实了夹心型免疫传感器在临床诊断中的实用性。
80.表2
81.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
(hhtp)
2-ab1表面残留的非特异性活性位点封闭，即制得bsa封闭的ru@cu3(hhtp)
2-ab1。5.根据权利要求1所述的一种基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤s3具体为：s301：将haucl4·
4h2o溶液加入水中，加热至沸腾后加入还原剂，搅拌、冷却、离心处理得到au nps；s302：将pei溶液加入到go溶液中，搅拌、离心处理得到go@pei；s303：将au nps加入go@pei溶液中，搅拌、离心处理得到go-au纳米复合体。6.根据权利要求1所述的一种基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤s302具体为：将pei溶液加入到go溶液中，然后在60℃下搅拌12h，通过离心和洗涤得到go@pei，并在水中进一步分散，得到go@pei溶液中。7.根据权利要求1所述的一种基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤s4具体为：s401：将步骤s3制备的go-au纳米复合体分散在pbs中得到go-au悬液；s402：将edc和nhs组成的偶联液加入到go-au悬液中以活化分布在go-au表面的羧基；s403：将ab2溶液引入羧基活化的go-au中，离心处理得到go-au-ab2生物偶联物；s404：将go-au-ab2生物偶联物在pbs中分散，加入bsa以封闭go-au-ab2生物偶联物表面的非特异性活性位点，即制得bsa封闭的go-au-ab2生物偶联物。8.根据权利要求1所述的一种基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤s5具体为：s501：由氧化铝粉末和水组成的抛光液对工作电极进行抛光，再用水/乙醇冲洗，并用n2干燥；s502：将bsa封闭的ru@cu3(hhtp)
2-ab1作为ecl发射物缓慢滴到预处理后的工作电极上；s503：将不同浓度的crp抗原置于工作电极上识别并结合到已与ru@cu3(hhtp)2偶联的ab1s504：将bsa封闭的go-au-ab2生物偶联物作为ecl猝灭剂添加到涂有crp抗原和ru@cu3(hhtp)
2-ab1的工作电极上进行免疫；s505：免疫结束后，用缓冲溶液洗脱未结合的go-au-ab2，即制得免疫传感器。9.根据权利要求8所述的一种基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤s503中，将bsa封闭的ru@cu3(hhtp)
2-ab1作为ecl发射物缓慢滴到预处理的gce之后，在4℃下干燥，再将不同浓度的crp抗原置于上述gce上识别并结合到已与ru@cu3(hhtp)2偶联的ab
1，
在37
°
c下保持30min后，用pbs洗脱未结合的crp。10.一种如权利要求1所述基于cu3(hhtp)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器在c-反应蛋白检测中的应用。

技术总结
一种基于Cu3(HHTP)2的纳米片夹心型电化学发光免疫传感器的制备及应用，涉及免疫传感器领域，该制备方法包括：S1：制备Ru@Cu3(HHTP)2纳米片；S2：制备BSA封闭的Ru@Cu3(HHTP)


技术研发人员：崔晨 吕杰
受保护的技术使用者：河南工业大学
技术研发日：2023.06.13
技术公布日：2023/8/23