一种调控CVB5复制的circRNA及应用

一种调控cvb5复制的circrna及应用
技术领域
1.本发明涉及基因生物技术领域，具体涉及一种调控cvb5复制的circrna及应用。


背景技术：

2.柯萨奇病毒b5(coxsackievirusb5,cvb5)归属于小rna病毒科的肠道病毒属b组，它是一种无包膜的单正链rna病毒。cvb5基因组全长约7.4kb，包括两个非翻译区和一个开放阅读框架(orf)，其中orf可编码2,194个氨基酸的多聚蛋白前体，被病毒自身编码的蛋白酶进一步水解为三个前体蛋白(p1、p2和p3)。cvb5不仅参与了手足口病的爆发和流行，而且能够引起严重的无菌性脑炎、心肌炎和糖尿病等疾病，以5岁以下儿童发病率最高，疾病常发于夏秋季节。然而目前，还没有获得批准的针对cvb5感染的疫苗及特异性药物。
3.环状rna(circular rna,circrna)是近年发现的一种特殊的内源性非编码rna，广泛存在于哺乳动物细胞中。与线性rna结构不同，circrna是一类共价闭合环状rna分子，缺乏可结合的非编码末端，且不易被核酸外切酶降解，因此具有更高的稳定性。circrna不仅可以作为竞争性内源rna(competing endogenous rna,cerna)捕捉mirna，也可以调控选择性剪接和基因表达，还可以作为支架组装形成蛋白质复合物，此外也编码蛋白质以及充当rrna和trna生物合成的调节器，在细胞各种生物学过程中发挥作用。研究表明，circrna在病毒感染和宿主免疫中起着重要作用，因此，我们对cvb5感染后的circrna功能进行了深度挖掘。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于，提供一种调控cvb5复制的circrna，所述circrna是具有显著抑制cvb5复制的circrna002006，可为cvb5感染的疾病提供新的治疗方案。
5.为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
6.一种circrna，所述circrna为circrna002006；所述circrna的核苷酸序列及剪接位点如seq id no.1所示。
7.本发明的另一目的在于，提供一种抑制cvb5复制的circrna，所述circrna为上述circrna002006。
8.进一步的，所述circrna在cvb5感染rd细胞中下调表达。
9.进一步的，所述circrna表达与cvb5感染时间及剂量呈依赖性。
10.本发明的另一目的在于，提供circrna002006的过表达载体序列，其序列如seq id no.2所示。
11.本发明的另一目的在于，提供circrna002006在制备预防或治疗cvb5产品中的应用。
12.进一步的，所述预防或治疗cvb5产品为手足口病预防或治疗药物。
13.本发明的有益效果：
14.本发明公开一种circrna，所述circrna为circrna002006，在细胞中过表达本发明
所述的circrna002006后，cvb5的复制水平较对照细胞中有显著的降低，即本发明中所提供的circrna002006具有抑制cvb5病毒复制的作用；
15.本发明中所提供的circrna002006调节抗病毒免疫因子isgs的表达。
16.本发明中所提供的circrna002006，通过干扰素通路发挥抑制cvb5复制的作用，可用于手足口病的预防或治疗。
17.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
18.图1为本发明实施例所述cvb5感染组和空白对照组中候选circrna表达水平差异结果图(左：rna-seq测序结果；右：qrt-pcr检测结果)；
19.图2为本发明实施例所述cvb5感染不同剂量circrna002006的表达结果图；
20.图3为本发明实施例所述cvb5感染不同时间circrna002006的表达结果图；
21.图4为本发明实施例所述circrna002006过表达质粒载体图谱；
22.图5为本发明实施例所述circrna002006过表达后，可显著抑制cvb5结构蛋白vp1的表达水平结果图；
23.图6为本发明实施例所述circrna002006过表达后，可激活isgs表达结果图。
具体实施方式
24.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将结合附图对实施例对本发明进行详细说明。
25.本发明所使用的药品、试剂、仪器、设备等如无特殊说明，均可通过商业化途径购买获得，涉及的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规实验操作或依照相应试剂的产品说明书进行。
26.在本发明的前期研究中，我们通过对cvb5感染rd细胞后进行rna-seq分析，筛选出circrna002006，核苷酸序列如seq id no.1所示；为了研究circrna002006潜在的生物学功能，在细胞中过表达circrna002006，检测circrna002006对病毒复制的作用及其机制。
27.本发明用到的细胞及病毒均为实验室保存，circrna002006过表达载体自行合成。
28.本发明涉及的circrna引物序列见表1，isgs引物序列见表2；
29.circrna002006过表达载体图谱见图4。
30.表1circrna引物序列
[0031][0032][0033]
表2isgs引物序列
[0034][0035]
实施例1
[0036]
circrna002006的筛选及特征分析
[0037]
1.cvb5感染rd后，circrna表达谱分析
[0038]
本发明采用rna-seq对cvb5感染组与空白对照组中circrna表达量进行分析，circrna的rna-seq结果由北京诺禾致源科技股份有限公司提供。根据rna测序结果，挑选6条circrna进行实验验证。
[0039]
2.circrna002006下调表达
[0040]
cvb5感染rd细胞24h后，收集细胞沉淀，用trizol试剂提取总rna。利用qrt-pcr方法验证挑选出的6条circrna表达情况，数据采用2
‑△△
ct法进行分析。其中，circrna002006的表达水平下调，rna-seq与qrt-pcr检测结果一致。所述circrna002006的核苷酸序列如seq id no.1所述。
[0041]
3.circrna002006表达特征与cvb5感染相关
[0042]
上述结果表明，circrna002006表达与cvb5感染密切相关，因此用qrt-pcr方法进一步检测circrna002006表达与cvb5感染的关系。不同moi(0,0.01,0.1,1,5)cvb5感染rd细胞24h后收集细胞沉淀，用trizol试剂提取总rna，利用qrt-pcr方法检测circrna002006的表达。如图2所示，circrna002006的表达与病毒感染剂量呈正相关。1moi cvb5感染rd细胞后，分别于0h,6h,12h,24h和36h收集细胞沉淀，用trizol试剂提取总rna，利用qrt-pcr方法检测circrna002006的表达。如图3所示，circrna002006的表达与病毒感染时间呈正相关。综上，circrna002006表达与cvb5感染剂量及感染时间具有依赖性，circrna002006在cvb5感染中具有重要作用。
[0043]
实施例2
[0044]
circrna002006功能研究
[0045]
1.构建circrna002006过表达载体
[0046]
根据circrna002006的序列(seq id no.1)，构建含有circrna002006序列的pcdna3.1质粒载体即pcdna3.1-circrna002006-2flag载体(图谱如图4所示)。其中，ecori和bamhi之间为circrna002006插入区间。
[0047]
2.细胞转染
[0048]
将对数生长期的rd细胞接种于6cm细胞培养皿中，约细胞长满60-70％时，
[0049]
采用transindm el转染试剂，分别转染空载对照组(pcdna3.1)和过表达circrna002006组(pcdna3.1-circrna002006-2flag)，置37℃、5％co2细胞培养箱中孵育24h。
[0050]
3.病毒感染
[0051]
转染后的细胞按照1moi的感染剂量感染cvb524h。
[0052]
4.western blot检测cvb5 vp1表达
[0053]
将上述细胞pbs清洗两遍，加入ripa裂解液(加入1
×
的pmsf，1
×
的磷酸酶裂解液)，收取细胞裂解液。利用western blot的实验检测cvb5的结构蛋白vp1的表达。
[0054]
结果表明，circrna002006显著抑制cvb5复制(如图5所示)。
[0055]
实施例3
[0056]
circrna002006促进isgs表达
[0057]
将上述细胞pbs清洗两遍，trizol试剂提取细胞总rna。通过qrt-pcr检测isgs表达。
[0058]
结果表明，circrna002006过表达显著诱导isgs表达(如图6所示)，提示circrna002006通过干扰素通路发挥作用。
[0059]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

技术特征：
1.一种circrna，其特征在于：所述circrna为circrna002006，所述circrna的核苷酸序列及剪接位点如seq id no.1所示。2.一种抑制cvb5复制的circrna，其特征在于：所述circrna为权利要求1所述circrna002006。3.如权利要求2所述的一种抑制cvb5复制的circrna，其特征在于：所述circrna在cvb5感染rd细胞中下调表达。4.如权利要求2所述的一种抑制cvb5复制的circrna，其特征在于：所述circrna表达与cvb5感染时间及剂量呈依赖性。5.circrna002006的过表达载体序列，其特征在于：其序列如seq id no.2所示。6.circrna002006在制备预防或治疗cvb5产品中的应用。7.如权利要求6所述的circrna002006在制备预防或治疗cvb5产品中的应用，其特征在于：所述预防或治疗cvb5产品为手足口病预防或治疗药物。

技术总结
本发明公开一种调控CVB5复制的circRNA及应用，涉及基因生物技术领域。本发明公开的circRNA，所述circRNA为circRNA002006，序列表如SEQ ID NO.1；本发明通过分析CVB5感染人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD)的circRNA的表达谱发现，circRNA002006在病毒感染的细胞中下调表达，且与病毒感染时间及剂量呈依赖性；同时，circRNA002006可显著抑制CVB5复制；此外，circRNA002006可激活干扰素刺激因子(ISGs)的表达。本发明发现了具有显著抑制CVB5复制的circRNA(circRNA002006)，从而为CVB5的感染的疾病提供新的治疗方案。疾病提供新的治疗方案。疾病提供新的治疗方案。


技术研发人员：陈伟 李静 滕培英 杨帆 张继虹 李金伟 李帅鹏
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：2023.03.28
技术公布日：2023/8/23