D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用

d-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用
(一)技术领域
1.本发明涉及一种基于crispri筛选的产d-泛酸基因工程菌及构建方法，及其在微生物发酵制备d-泛酸中的应用。
(二)

背景技术：

2.泛酸，也称为维生素b5，是辅酶a的组成成分之一，在能量代谢以及柠檬酸循环等重要生化反应中起到关键作用。因此，作为一种重要的维生素及前体物质，d-泛酸在饲料、医药以及化妆品等方面得到广泛应用。在已知的d-泛酸合成方法中，生物发酵法生产d-泛酸具有底物廉价、易分离、毒性小等优势而受到关注。但目前利用生物法生产d-泛酸仍存在缺陷，例如发酵过程不稳定、产量不高等问题。因此，构建一株更高产的d-泛酸菌株仍是一大挑战。
(三)

技术实现要素：

3.本发明的目的是基于crispri筛选技术来识别内源性基因靶点，提供一种高产d-泛酸的基因工程菌及其构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备d-泛酸中的应用。
4.本发明采用的技术方案是：
5.一种基于crispri筛选的产d-泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
6.(1)以基因工程菌zjutdpal5为底盘菌，在其基因组上增加受启动子ptrc调控的ecilvd基因拷贝数，得到工程菌dpal6 derivative，yjiv::ptrc-ecilvd，记为工程菌dpap7；
7.(2)在工程菌dpap7基因组上通过基因敲入方式增加受启动子ptrc调控的枯草芽孢杆菌bspanb基因拷贝数，得到工程菌dpap7 derivative，flik::ptrc-bspanb，记为工程菌dpap8；
8.(3)在工程菌dpap8基因组上通过基因敲入方式增加受启动子ptrc调控的谷氨酸棒杆菌cgpanc基因拷贝数，得到工程菌dpap8 derivative，ompt::ptrc-cgpanc，记为工程菌dpap9；
9.(4)在工程菌dpap9基因组上通过基因敲入方式增加受启动子ptrc调控的枯草芽孢杆菌alss基因拷贝数，得到工程菌dpap9 derivative，yjip::ptrc-alss，记为工程菌dpap10；
10.(5)制备工程菌dpap10的高压电穿孔法感受态细胞dpap10/pdcas9，设计ptarget同时含有grna-glta和grna-ptsh，将含有grna-glta-ptsh的ptarget电转入dpap10/pdcas9，得到工程菌dpap10/pdcas9grna
[0011]-glta-ptsh，即为所述产d-泛酸的基因工程菌。
[0012]
本发明在底盘菌zjutdpal5(e.coli w3110，trc-pancpanepanbilvc/ilvg*/δavta/ilve*/coaa*/δilva/trc-lpd/δglk/ilva*/trc-pck/trc-maeb/trc-ilvbn/gdha*
t
，已在cn113637618a中公开)的基础上，综合运用系统代谢工程策略，利用crispr/cas9基
因编辑技术，通过基因敲入引入异源基因，增强大肠杆菌生物体内泛解酸合成途径中关键基因表达水平，构建无质粒、无抗生素使用的d-泛酸生产菌株dpap10，再运用crispri筛选技术、代谢通量的优化等方式，构建了一株性能更优的d-泛酸生产菌株。
[0013]
所述受ptrc启动子调控的ecilvd、bspanb、cgpanc、alss基因核苷酸序列分别如seq id no.1～4所示，所述grna-glta核苷酸序列如seq id no.5所示，所述grna-ptsh核苷酸序列如seq id no.6所示。
[0014]
本发明构建了crispri双基因抑制系统，同时干扰双基因pgk-glta，pgk-ptsh，glta-ptsh，pgk-ptsi，glta-ptsi，pgk-crp和glta-crp，组合抑制后得到最优菌株dpap10/pdcas9grna-glta-ptsh的d-泛酸产量达到了5.3g/l，提高了49.5％。
[0015]
本发明还涉及构建所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
[0016]
(1)以基因工程菌zjutdpal5为底盘菌，运用crispr-cas9介导的基因编辑技术，将受来源于ptrc99a的ptrc启动子调控的ecilvd基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjiv，增强ecilvd的表达强度，得到工程菌dpal6 derivative，yjiv::ptrc-ecilvd，记为工程菌dpap7；
[0017]
(2)以工程菌dpap7为出发菌株，运用crispr-cas9介导的基因编辑技术，将受来源于ptrc99a的ptrc启动子调控的bspanb基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因flik，增强bspanb的表达强度，得到工程菌dpap7 derivative，flik::ptrc-bspanb，记为工程菌dpap8；
[0018]
(3)以工程菌dpap8为出发菌株，运用crispr-cas9介导的基因编辑技术，将受来源于ptrc99a的ptrc启动子调控的cgpanc基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因ompt，增强cgpanc的表达强度，得到工程菌dpap8 derivative，ompt::ptrc-cgpanc，记为工程菌dpap9；
[0019]
(4)以工程菌dpap9为出发菌株，运用crispr-cas9介导的基因编辑技术，将受来源于ptrc99a的ptrc启动子调控的alss基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjip，增强alss的表达强度，得到工程菌dpap9 derivative，yjip::ptrc-alss，记为工程菌dpap10；
[0020]
(5)制备工程菌dpap10的高压电穿孔法感受态细胞dpap10/pdcas9，设计ptarget同时含有grna-glta和grna-ptsh，将含有grna-glta-ptsh的ptarget电转入dpap10/pdcas9，得到工程菌dpap10/pdcas9grna
[0021]-glta-ptsh，即为所述产d-泛酸的基因工程菌。
[0022]
具体的，所述受ptrc启动子调控的ecilvd、bspanb、cgpanc、alss基因核苷酸序列分别如seq id no.1～4所示，所述grna-glta核苷酸序列如seq id no.5所示，所述grna-ptsh核苷酸序列如seq id no.6所示。
[0023]
本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备d-泛酸中的应用。
[0024]
所述应用为：将所述高产d-泛酸的基因工程菌接种至发酵培养基中，于28～42℃、150～250rpm条件下进行发酵培养48～96h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到所述d-泛酸。
[0025]
具体的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10～30g/l、(nh4)2so
4 10～30g/l、kh2po
4 1～5g/l、mgso
4 0.1～2.0g/l、酵母提取物1～5g/l、caco
3 5～20g/l，0.5～2ml/l微量元素溶液，溶剂为去离子水，ph值自然；微量元素溶液组成为：10g/lcucl2、10g/l feso4·
7h2o、10g/lznso4·
7h2o、0.20g/l cuso4、0.02g/lnicl2·
7h2o，溶剂为去离子水。
[0026]
本发明利用crispri技术设计sgrna，筛选影响工程菌株d-泛酸生物合成的内源性基因靶点。通过对筛选的基因进行高强度抑制，调节碳代谢流，增强泛解酸合成路径上游供应，提高了d-泛酸的合成能力，与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
[0027]
本发明运用crispri技术，筛选识别内源性基因靶点大幅度提高基因工程菌d-泛酸生物合成能力，菌株dpap10/pdcas9grna-glta-ptsh相对于原始菌株dpap10，在摇瓶中dpa产量提高了49.5％达到5.3g/l；中间代谢物检测分析发现，改变丙酮酸通量分布和降低tca循环速率，会导致碳流更多流向dpa合成代谢路径中，从而提高dpa的产量，这一发现为构建更高产菌株提供了新思路。
(四)附图说明
[0028]
图1为d-泛酸代谢途径图和改造位点；
[0029]
图2为dpap7的od
600
和d-泛酸效价变化；
[0030]
图3为dpap8的od
600
和d-泛酸效价变化；
[0031]
图4为dpap9的od
600
和d-泛酸效价变化；
[0032]
图5为dpap10的od
600
和d-泛酸效价变化；
[0033]
图6为d-泛酸合成相关抑制靶点代谢路径图；
[0034]
图7为对关键基因crispri单点抑制后d-泛酸产量图；
[0035]
图8为对关键基因crispri单点抑制后d-泛酸合成中间代谢物变化图；
[0036]
图9为对关键基因crispri组合抑制后d-泛酸产量图；
[0037]
图10为对关键基因crispri组合抑制后d-泛酸合成中间代谢物变化图。
(五)具体实施方式
[0038]
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0039]
以下实施例中，所述壮观霉素在培养基中终浓度为0.05mg/l，卡那霉素在培养基中终浓度为0.05mg/，氯霉素在培养基中终浓度为0.03mg/l。
[0040]
本发明所述亲本菌株e.coli w3110来自耶鲁大学cgsc保藏中心(coli genetic stock center)，保藏日期1975年8月5日，保藏编号cgsc#4474，已在专利us 2009/0298135 a1，us 2010/0248311 a1中公开。
[0041]
实施例2-11中使用的引物序列信息如表2所示：
[0042]
表1：基因编辑所涉及的基因及相应途径
[0043][0044][0045]
表2：引物序列
[0046]
[0047]
[0048]
[0049]
[0050][0051]
表3：sgrna核苷酸序列
[0052][0053]
实施例1：
[0054]
d-泛酸含量的hplc测定，检测方法如下：
[0055]
色谱条件：c
18
柱(250
×
4.6mm，particle size 5μm，agilent technologies co.，santa clara，ca，usa)、检测波长：200nm、柱温：30℃；
[0056]
样品处理：将样品用超纯水稀释，保持d-泛酸含量在0.05g/l到0.40g/l之间；
[0057]
流动相：乙腈/水/磷酸：(50/949/1)；
[0058]
数据采集时间：25min
[0059]
有机酸含量测定，检测方法如下：
[0060]
色谱柱：aminex hpx-87h lon exclusion column(300
×
7.8mm)
[0061]
流动相：8mm h2so4(加入435μl h2so4，并用水定容到1l)(无梯度)
[0062]
流速：0.6ml/min
[0063]
进样量：20μl
[0064]
柱温：60℃
[0065]
检测波长：210nm
[0066]
检测时长：20min。
[0067]
实施例2：dpap7(dpal6 derivative，yjiv::ptrc-ecilvd)构建及摇瓶发酵
[0068]
以zjutdpal5(e.coli w3110,trc-pancpanepanbilvc/ilvg*/δavta/ilve*
[0069]
/coaa*/δilva/trc-lpd/δglk/ilva*/trc-pck/trc-maeb/trc-ilvbn/gdha*
t
)为出发菌株，运用crispr-cas9介导的基因编辑技术，通过基因敲入方式，将受来源于ptrc99a的ptrc启动子调控的ecilvd基因(核苷酸序列如seq id no.1所示)替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjiv，以增强ecilvd的表达强度。
[0070]
(1)构建ptarget-yjiv质粒：以ptarget f质粒(addgene plasmid#62226)为模版，以pt-yjiv-f/r为引物进行pcr扩增，pcr产物经核酸凝胶电泳验证后，使用dpn i消化酶在37℃保温消化3h，再转化到e.coli dh5α，经过壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的ptarget-yjiv质粒，用于后续连接donor dna。
[0071]
(2)构建ptd-ecilvd质粒：首先，以e.coli w3110基因组为模版，yjiv-s6f/r为引物扩增获得donor dna的上游部分(f1)，yjiv-x6f/r为引物扩增获得donor dna的下游部分(f2)。然后，以e.coli w3110基因组为模板，使用ptrc-ecilvd-18f/r为引物扩增出带有启动子ptrc的ecilvd基因片段(f3)，通过胶回收纯化pcr片段得到f1、f2以及f3；质粒ptarget-yjiv经过xba i和pst i在37℃保温8h，clean up试剂盒回收dna片段；按照(one step clone kit，vazyme biotech，nanjing，china)说明书将ptarget-yjiv载体、片段f1、f2以及f3连接在一起，通过测序验证得到ptd-ecilvd质粒。
[0072]
(3)将pcas质粒(addgene plasmid#62225)导入zjutdpal5(e.coli w3110,trc-pancpanepanbilvc/ilvg*/δavta/ilve*/coaa*/δilva/trc-lpd/δglk/ilva*/trc-pck/trc-maeb/trc-ilvbn/gdha*
t
)中，转接单克隆菌落到含0.05mg/l卡那霉素的lb试管中，30℃过夜培养；再以体积浓度1％的接种量接种到含50ml lb培养基的250ml摇瓶中，并加入500μl 1mol/l的l-阿拉伯糖，150rpm、30℃培养至od
600 0.4～0.6；4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(molecular cloning:alaboratory manual，3ed edition，99-102)的描述。
[0073]
(4)使用移液枪吸取适量ptd-ecilvd(约200ng)质粒与事先准备好的100μl电击感受态细胞混合，一同转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1-2min左右后，使用电穿孔仪(micropluser
tm
，bio-rad)进行电击转化，电击完成后立即加入800μl lb培养基并立即轻柔吸出，转移到2ml ep管中，30℃复苏3-4h后涂布含0.05mg/l卡那霉素和0.05mg/l壮观霉素的lb固体平板，30℃倒置培养12-16h，以ilvd-vf/r为引物进行菌落pcr验证，若能成功克隆出一段约3500bp左右的片段，则证明是dpap7(dpal6 derivative，yjiv::ptrc-ecilvd)阳性菌落。
[0074]
(5)质粒消除：使用接种环挑取阳性单菌落接种到含1mm iptg和0.05mg/l卡那霉素的lb液体试管中，30℃培养过夜，次日菌液划线于含0.05mg/l卡那霉素的lb固体平板，30
℃培养24h，待菌体长到一定大小时，挑取部分单菌落划线于含0.05mg/l壮观霉素的lb平板，不能在含0.05mg/l壮观霉素的lb平板的单菌落则显示其ptarget-yjiv质粒成功消除，之后挑取ptarget-yjiv质粒成功消除的单菌落于lb试管，37℃培养过夜，用于消除pcas质粒，次日菌液划线于lb平板，37℃培养12h后，挑取部分单菌落划线于含0.05mg/l卡那霉素的lb平板，不能在含0.05mg/l卡那霉素的lb平板的单菌落则其pcas质粒成功消除，最终得到无质粒菌株dpap7(dpal6 derivative，yjiv::ptrc-ecilvd)。
[0075]
(6)摇瓶发酵：将dpap7(dpal6 derivative，yjiv::ptrc-ecilvd)，以出发菌株zjutdpal5为对照组，分别接种到10ml的lb培养基中，37℃、200rpm培养用作预培养物；8-12h后，以2％接种量接种1ml预培养物到装有50ml的ms培养基的500ml摇瓶中，然后在30℃、180rpm恒温摇床中培养48h进行菌株发酵；发酵结束后取1ml发酵液测定od
600
值的同时，使用移液枪吸取1ml发酵液，12000rpm室温离心3min，将发酵上清稀释5倍后，使用水系滤膜对稀释后样品进行除杂处理后，根据实施例1进行hplc检测，od
600
及发酵液上清中的d-泛酸含量如图2所示。
[0076]
由图可见，基因组上额外增加ilvd基因拷贝数后，对菌体生长并没有明显影响，同时对于d-泛酸摇瓶效价提升并没有促进作用，与出发菌株相当约为2.9g/l，可能是前面途径碳通量不足导致，考虑到后续改造需要，因此继续在此基础上对菌株进行相关改造。
[0077]
lb培养基：10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物，5g/l nacl，溶剂为去离子水，ph值自然。
[0078]
ms培养基：葡萄糖20g/l、(nh4)2so
4 16g/l、kh2po
4 2g/l、mgso
4 0.5g/l、酵母提取物2g/l、caco
3 10g/l，1ml/l微量元素溶液，溶剂为去离子水，ph值自然；10g/l碳酸钙(单独灭菌)；微量元素溶液组成为：10g/l cucl2、10g/l feso4·
7h2o、1g/l znso4·
7h2o、0.20g/l cuso4、0.02g/l nicl2·
7h2o，溶剂为去离子水。
[0079]
实施例3：dpap8构建及摇瓶发酵
[0080]
以dpap7为出发菌株，运用crispr-cas9介导的基因编辑技术，通过基因敲入方式，将受来源于ptrc99a的ptrc启动子调控的bspanb基因(核苷酸序列如seq id no.2所示)替换掉出发菌株基因组上原有假基因flik，以增强bspanb的表达强度。
[0081]
(1)构建ptarget-flik质粒：以ptarget f质粒(addgene plasmid#62226)为模版，以pt-flik-f/r为引物进行pcr扩增，pcr产物经核酸凝胶电泳验证后，使用dpn i消化酶在37℃保温消化3h，再转化到e.coli dh5α，经过壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的ptarget-flik质粒，用于后续连接donor dna。
[0082]
(2)构建ptd-bspanb(1)质粒：首先，以e.coli w3110基因组为模版，flik-s8f/r为引物扩增获得donor dna的上游部分(f1)，flik-x8f/r为引物扩增获得donor dna的下游部分(f2)。然后，以b.subtilis 168基因组为模板，使用ptrc-bspanb(1)-9f/r为引物扩增出带有启动子ptrc的bspanb基因片段(f3)，通过胶回收纯化pcr片段得到f1、f2以及f3；质粒ptarget-flik经过xba i和pst i在37℃保温8h，clean up试剂盒回收dna片段；按照(one step clone kit，vazyme biotech，nanjing，china)说明书将ptarget-flik载体、片段f1、f2以及f3连接在一起，通过测序验证得到ptd-bspanb(1)质粒。
[0083]
(3)将pcas质粒(addgene plasmid#62225)导入实施例2获得的dpap7感受态中，dpap7电转感受态制备方法同实施例2(3)。
[0084]
(4)构建得到dpap8阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
[0085]
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒dpap8。
[0086]
(6)将构建的dpap8生产菌株以实施例2构建的dpap7为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。od
600
及发酵液上清中的d-泛酸含量如图3所示。
[0087]
由图可见，基因组上通过基因敲入方式增加异源bspanb基因拷贝数后，没有影响菌体生长，但d-泛酸摇瓶效价提升至3.72g/l，可能是该基因引入使得一部分流向支链氨基酸碳通量转向了泛解酸的合成，从而促进了菌株d-泛酸的生物合成。
[0088]
实施例4：dpap9构建及摇瓶发酵
[0089]
以dpap8为出发菌株，运用crispr-cas9介导的基因编辑技术，通过基因敲入方式，将受来源于ptrc99a的ptrc启动子调控的cgpanc基因(核苷酸序列如seq id no.3所示)替换掉出发菌株基因组上原有假基因ompt，以增强cgpanc的表达强度。
[0090]
(1)构建ptarget-ompt质粒：以ptarget f质粒(addgene plasmid#62226)为模版，以pt-ompt-f/r为引物进行pcr扩增，pcr产物经核酸凝胶电泳验证后，使用dpn i消化酶在37℃保温消化3h，再转化到e.coli dh5α，经过壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的ptarget-ompt质粒，用于后续连接donor dna。
[0091]
(2)构建ptd-cgpanc质粒：首先，以e.coli w3110基因组为模版，ompt-s6f/r为引物扩增获得donor dna的上游部分(f1)，ompt-x6f/r为引物扩增获得donor dna的下游部分(f2)。然后，以c.glutamicum atcc 13032基因组为模板，使用ptrc-cgpanc-8f/r为引物扩增出带有启动子ptrc的cgpanc基因片段(f3)，通过胶回收纯化pcr片段得到f1、f2以及f3；质粒ptarget-ompt经过xba i和pst i在37℃保温8h，clean up试剂盒回收dna片段；按照(one step clone kit，vazyme biotech，nanjing，china)说明书将ptarget-ompt载体、片段f1、f2以及f3连接在一起，通过测序验证得到ptd-cgpanc质粒。
[0092]
(3)将pcas质粒(addgene plasmid#62225)导入实施例3获得的dpap8感受态中，dpap8电转感受态制备方法同实施例2(3)。
[0093]
(4)构建得到dpap9阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
[0094]
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒dpap9。
[0095]
(6)将构建的dpap8生产菌株以实施例3构建的dpap8为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。od
600
及发酵液上清中的d-泛酸含量如图4所示。
[0096]
由图可见，基因组上通过基因敲入方式增加异源cgpanc基因拷贝数后，对于菌株生长并没有显著影响，d-泛酸摇瓶效价有轻微提升为3.76g/l，但提升幅度并没有异源引入bspanb大，可能是基因组上该基因编码酶活性足够，需要进一步加大流向泛解酸合成的碳通量，才能使发酵液中d-泛酸含量显著提升。
[0097]
实施例5：dpap10构建及摇瓶发酵
[0098]
以dpap9为出发菌株，运用crispr-cas9介导的基因编辑技术，通过基因敲入方式，将受来源于ptrc99a的ptrc启动子调控的alss基因(核苷酸序列如seq id no.4所示)替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjip，以增强alss的表达强度。
[0099]
(1)构建ptarget-yjip质粒：以ptarget f质粒(addgene plasmid#62226)为模版，以pt-yjip-f/r为引物进行pcr扩增，pcr产物经核酸凝胶电泳验证后，使用dpn i消化酶在37℃保温消化3h，再转化到e.coli dh5α，经过壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的
ptarget-yjip质粒，用于后续连接donor dna。
[0100]
(2)构建ptd-alss质粒：首先，以e.coli w3110基因组为模版，yjip-s5f/r为引物扩增获得donor dna的上游部分(f1)，yjip-x5f/r为引物扩增获得donor dna的下游部分(f2)。然后，以b.subtilis 168基因组为模板，使用ptrc-alss-17f/r为引物扩增出带有启动子ptrc的alss基因片段(f3)，通过胶回收纯化pcr片段得到f1、f2以及f3；质粒ptarget-yjip经过xba i和pst i在37℃保温8h，clean up试剂盒回收dna片段；按照(one step clone kit，vazyme biotech，nanjing，china)说明书将ptarget-yjip载体、片段f1、f2以及f3连接在一起，通过测序验证得到ptd-alss质粒。
[0101]
(3)将pcas质粒(addgene plasmid#62225)导入实施例4获得的dpap9感受态中，dpap9电转感受态制备方法同实施例2(3)。
[0102]
(4)构建得到dpap10阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
[0103]
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒dpap10。
[0104]
(6)将构建的dpap10生产菌株以实施例4构建的dpap9为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。od
600
及发酵液上清中的d-泛酸含量如图5所示。
[0105]
由图可见，基因组上通过基因敲入方式增加异源alss基因拷贝数后，d-泛酸摇瓶效价提升至3.87g/l，效果不明显，因此丙酮酸前体供应或者下游d-泛解酸途径合成能力尚有不足需进一步加强。
[0106]
实施例6：电转感受态dpap10/pdcas9构建
[0107]
(一)构建出发菌株dpap10由实验室保藏(按照实施例5方法构建)。
[0108]
(二)以dpap10为出发菌株，将pdcas9(由实验室菌种库保存)化转导入底盘菌dpap10，构建得到dpap10/pdcas9，再将其制备成高压电穿孔法感受态细胞。
[0109]
(1)d-泛酸工程菌株dpap10化学转化感受态制备：取dpap10划线平板，从中挑取单菌落，接种到10ml的lb液体培养基中，37℃，180rpm培养过夜。然后取过夜培养菌液转接于50ml的lb液体培养基中，37℃，180rpm培养至od
600 0.4～0.6。于超净台中将菌液转移至50ml的无菌离心管中，4℃，5500rpm离心5min，于超净台内弃上清。然后加入适量预冷的0.1m的无菌cacl2溶液，小心轻柔的用移液枪吹打管壁上的菌体使其悬浮，立即至于冰上冰浴30min；冰浴完成后，4℃，5500rpm离心5min收集菌体，超净台内弃上清。根据菌体量加入适量的预冷的无菌cacl2甘油溶液(0.1m cacl2，15％甘油)重悬细胞，于冰上每管100μl分装，-80℃保存备用。
[0110]
(2)pdcas9转化至dpap10：取dpap10化转感受态细胞至于冰上，自然融化后，加入2μl的pdcas9质粒，轻柔混匀，至于冰上冰浴30min。然后，取冰浴后的混合物，于42℃水浴中，热激90s，并立即至于冰上冰浴2～5min。再加入700μl lb培养基，于37℃，180rpm摇床中培养45～60min。取适量的培养物涂布于lb平板上(抗性为氯霉素)，将平板置于30℃培养箱，倒置培养过夜。
[0111]
(3)电转感受态dpap10/pdcas9构建：取dpap10/pdcas9平板，挑取单菌落，接种到10ml的lb培养基中，并加入10μl的氯霉素和100μl的阿拉伯糖，37℃，180rpm过夜培养。然后取过夜培养菌液转接于50ml的lb培养基中，并加入50μl的氯霉素和500μl的阿拉伯糖，37℃，180rpm培养至od
600
0.6～0.8。将菌液转移至50ml灭过菌的离心管中，4℃，5500rpm离心5min，于超净台内弃上清。然后加入适量预冷的无菌水，小心轻柔的用移液枪吹打管壁上的
菌体使其悬浮，4℃，5500rpm离心5min，于超净台内弃上清，重复此步骤2次。加入适量的预冷的无菌10％的甘油溶液重悬细胞，4℃，5500rpm离心5min，于超净台内弃上清。根据菌体量加入适量的无菌10％的甘油溶液重悬细胞，于冰上每管100μl分装，-80℃保存备用。
[0112]
实施例7：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-ptsh构建及摇瓶发酵
[0113]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget的grna-ptsh(参见表3)，将含有grna-ptsh的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h。如图7、8所示，对ptsh进行抑制，d-泛酸的产量提高24.6％，约为4.36g/l，tca循环通量及甲酸乙酸含量有所下降，使更多碳流进入d-泛解酸合成途径。
[0114]
(1)质粒ptgrna-ptsh构建:以质粒ptarget为模板，使用引物pt-ptsh-f和pt-ptsh-r(参见表2)对其进行pam突变，对突变后的pcr产物经核酸胶电泳验证后，使用dpnⅰ对残余模板在37℃下进行1h消化处理，消化结束后，对产物进行clean up纯化、测核酸浓度，最终得到带有grna-ptsh的ptarget质粒线性化载体片段，将其转化到e.coli dh5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的ptgrna-ptsh质粒。
[0115]
(2)菌株dpap10/pdcas9grna-ptsh构建:取200ng ptgrna-ptsh质粒与实施例3中100μl dpap10电击感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(micropluser
tm
，bio-rad)进行电击转化，电击完成后立即加入1ml lb培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5ml离心管中，37℃复苏2-3h后涂布含0.03mg/l氯霉素和0.05mg/l壮观霉素的lb平板，37℃倒置培养12-16h，以ptarget通用验证引物菌落pcr验证阳性菌落。
[0116]
(3)摇瓶发酵:以dpap10/pdcas9grna-avta为对照菌株(avta在dpap10中已被敲除，仅测试dpap10在双质粒负担下的发酵结果，并无阻断任何基因)，分别接种到10ml的lb培养基中，30℃、200rpm培养用作预培养物；8-12h后，接种1.5ml预培养物到装有50ml的发酵培养基的500ml摇瓶中，添加终浓度为0.2mm的iptg，然后在30℃、180rpm培养48h；发酵结束后取1ml发酵液测定od
600
的同时，取1ml发酵液于室温12000rpm离心3min，将发酵上清稀释5倍，根据实施例1进行hplc检测，od
600
及发酵液上清中的d-泛酸含量如图7所示，根据实施例2进行hplc检测，发酵液上清中的主要有机酸含量如图8所示。
[0117]
实施例8：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-ptsi构建及摇瓶发酵
[0118]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget的grna-ptsi(参见表3)，将含有grna-ptsi的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h。如图7、8所示，对ptsi进行抑制，d-泛酸的产量提高10.9％，约为3.88g/l，tca循环通量有所下降，致使进入d-泛解酸合成途径碳通量增加。
[0119]
具体实施方式同实施例7。
[0120]
实施例9：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-crr构建及摇瓶发酵
[0121]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget的grna-crr(参见表3)，将含有grna-crr的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h。如图7所示，对crr进行抑制，d-泛酸的产量提高12％，约为3.92g/l，加强d-泛酸合成能力。
[0122]
具体实施方式同实施例7，区别在于(3)中没有检测有机酸。
[0123]
实施例10：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-pgk构建及摇瓶发酵
[0124]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget的grna-pgk(参见表3)，将含有grna-pgk的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h。如图7、8所示，对
pgk进行抑制，d-泛酸的产量提高29.5％，约为4.53g/l，草酰乙酸、琥珀酸及甲酸含量有所下降，pgk为双向酶，可能涉及到糖异生途径弱化，节约碳流用于d-泛酸合成。
[0125]
具体实施方式同实施例7。
[0126]
实施例11：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-gapa构建及摇瓶发酵
[0127]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget的grna-gapa(参见表3)，将含有grna-gapa的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h。如图7所示，对gapa进行抑制，d-泛酸的产量提高4.2％，约为3.65g/l，gapa为双向酶，抑制gapa可能涉及糖异生途径弱化，减弱逆向反应。
[0128]
具体实施方式同实施例7，区别在于(3)中没有检测有机酸。
[0129]
实施例12：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-acee构建及摇瓶发酵
[0130]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget的grna-acee(参见表3)，将含有grna-acee的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h。如图7所示，对acee进行抑制，d-泛酸的产量提高3.4％，约为3.62g/l，抑制acee减少丙酮酸生成乙酰辅酶a，加强丙酮酸供应。
[0131]
具体实施方式同实施例7，区别在于(3)中没有检测有机酸。
[0132]
实施例13：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-glta构建及摇瓶发酵
[0133]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget的grna-glta(参见表3)，将含有grna-glta的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h。如图7、8所示，对glta进行抑制，d-泛酸的产量提高22.1％，约为4.27g/l，乙酸含量明显增加，草酰乙酸含量下降，推测乙酰辅酶a积累使乙酸含量增加，同时丙酮酸流入乙酰辅酶a受阻，加强丙酮酸积累使d-泛酸产量提升。
[0134]
具体实施方式同实施例7。
[0135]
实施例14：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-sdha构建及摇瓶发酵
[0136]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget的grna-sdha(参见表3)，将含有grna-sdha的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h。如图7所示，对sdha进行抑制，d-泛酸的产量提高4.8％，约为3.67g/l，抑制sdha试图减弱tca循环，减少消耗。
[0137]
具体实施方式同实施例7，区别在于(3)中没有检测有机酸。
[0138]
实施例15：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-crp构建及摇瓶发酵
[0139]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget的grna-crp(参见表3)，将含有grna-crp的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h，以此来测试d-泛酸的产量。如图7、8所示，对crp进行抑制，d-泛酸的产量提高15.4％，约为4.04g/l。全局调控因子crp在整个碳源的选择性运输中起着关键的调节作用，crp-camp的降低抑制了tca循环的代谢基因，且甲酸含量下降。
[0140]
具体实施方式同实施例7。
[0141]
实施例16：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-nac构建及摇瓶发酵
[0142]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget的grna-nac(参见表3)，将含有grna-nac的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h。如图7所示，对nac进行抑制，d-泛酸的产量提高4.5％，约为3.66g/l。大肠杆菌氮调节蛋白nac可以抑制多个
基因的表达，其中包括cyca、ilvn、ilvh、ilvm等d-泛酸生产相关基因，下调nac可能缓解抑制。
[0143]
具体实施方式同实施例7，区别在于(3)中没有检测有机酸。
[0144]
实施例17：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-ilvy构建及摇瓶发酵
[0145]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget的grna-ilvy(参见表3)，将含有grna-ilvy的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h。如图7所示，对ilvy进行抑制，d-泛酸的产量提高10％，约为3.85g/l。下调支链氨基酸转录调节因子ilvy，加强d-泛酸合成。
[0146]
具体实施方式同实施例7，区别在于(3)中没有检测有机酸。
[0147]
实施例18：d-泛酸生产菌株dpap10/pdcas9grna-pgk-glta构建及摇瓶发酵
[0148]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget同时含有grna-pgk和grna-glta(参见表3)，将含有grna-pgk-glta的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h。如图9、10所示，对pgk、glta进行组合抑制，相比对照d-泛酸的产量提高25.5％，效果没有单点抑制好。
[0149]
(1)质粒ptgrna-pgk-glta构建:以ptgrna-glta质粒为模版，使用引物grna-glta-f和grna-glta-r(参见表2)将ptgrna-glta质粒的grna-glta嵌合体pcr扩增为片段(核苷酸序列如seq id no.5所示)，pcr产物经过dpn i在37℃保温消化3h，clean up试剂盒回收grna-glta嵌合体片段。以ptgrna-pgk质粒(由实施例7获得)为模版经过ecor i和xba i在37℃保温8h，clean up试剂盒回收载体线性化片段。按照(one step clone kit，vazyme biotech，nanjing，china)说明书将ptgrna-pgk载体线性化片段与sgrna-glta嵌合体片段连接在一起，再转化到e.coli dh5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的ptgrna-pgk-glta质粒。
[0150]
(2)菌株dpap10/pdcas9grna-pgk-glta构建:取200ng ptgrna-pgk-glta质粒与实施例2中100μl dpap10电击感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(micropluser
tm
,bio-rad)进行电击转化，电击完成后立即加入1ml lb培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5ml离心管中，37℃复苏2-3h后涂布含0.03mg/l氯霉素和0.05mg/l壮观霉素的lb平板，37℃倒置培养12-16h，以ptarget通用验证引物菌落pcr验证阳性菌落。
[0151]
(3)摇瓶发酵:以dpap10/pdcas9grna-avta为对照菌株(avta在dpap10中已被敲除，仅测试dpap10在双质粒负担下的发酵结果，并无阻断任何基因)，分别接种到10ml的lb培养基中，30℃、200rpm培养用作预培养物；8-12h后，接种1.5ml预培养物到装有50ml的发酵培养基的500ml摇瓶中，添加终浓度为0.2mm的iptg，然后在30℃、180rpm培养48h；发酵结束后取1ml发酵液测定od
600
的同时，取1ml发酵液于室温12000rpm离心3min，将发酵上清稀释5倍，根据实施例1进行hplc检测，od
600
及发酵液上清中的d-泛酸含量如图9所示，根据实施例2进行hplc检测，发酵液上清中的主要有机酸含量如图10所示。
[0152]
实施例19：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-pgk-ptsh构建及摇瓶发酵
[0153]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget同时含有grna-pgk和grna-ptsh(参见表3)，将含有grna-pgk-ptsh的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h。如图9、10所示，对pgk、ptsh进行组合抑制，相比对照d-泛酸的产量提高40.5％，甲酸途径及tca循环被削弱。
[0154]
具体实施方式同实施例18，区别在与使用引物grna-ptsh-f和grna-ptsh-r(参见表2)扩增得到ptgrna-ptsh质粒的grna-ptsh嵌合体片段(核苷酸序列如seq id no.6所示)，与ptgrna-pgk线性化载体相连。
[0155]
实施例20：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-glta-ptsh构建及摇瓶发酵
[0156]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget同时含有grna-glta和grna-ptsh(参见表3)，将含有grna-glta-ptsh的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h。如图9、10所示，对glta、ptsh进行组合抑制，相比对照d-泛酸的产量提高49.5％，甲酸途径及tca循环被削弱。
[0157]
具体实施方式同实施例18，区别在与使用引物grna-ptsh-f和grna-ptsh-r(参见表2)扩增得到ptgrna-ptsh质粒的grna-ptsh嵌合体片段(核苷酸序列如seq id no.6所示)，与ptgrna-glta线性化载体相连。
[0158]
实施例21：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-pgk-ptsi构建及摇瓶发酵
[0159]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget同时含有grna-pgk和grna-ptsi(参见表3)，将含有grna-pgk-ptsi的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h。如图9、10所示，对pgk、ptsi进行组合抑制，相比对照d-泛酸的产量提高35.3％，甲酸途径被削弱，tca循环略微下调。
[0160]
具体实施方式同实施例18，区别在与使用引物grna-ptsi-f和grna-ptsi-r(参见表2)扩增得到ptgrna-ptsi质粒的grna-ptsi嵌合体片段(核苷酸序列如seq id no.7所示)，与ptgrna-pgk线性化载体相连。
[0161]
实施例22：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-glta-ptsi构建及摇瓶发酵
[0162]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget同时含有grna-glta和grna-ptsi(参见表3)，将含有grna-glta-ptsi的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h如图9、10所示，对glta、ptsi进行组合抑制，相比对照d-泛酸的产量提高24.2％，甲酸途径及tca循环被削弱。
[0163]
具体实施方式同实施例18，区别在与使用引物grna-ptsi-f和grna-ptsi-r(参见表2)扩增得到ptgrna-ptsi质粒的grna-ptsi嵌合体片段(核苷酸序列如seq id no.7所示)，与ptgrna-glta线性化载体相连。
[0164]
实施例23：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-pgk-crp构建及摇瓶发酵
[0165]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget同时含有grna-pgk和grna-crp(参见表3)，将含有grna-pgk-crp的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h。如图9、10所示，对pgk、crp进行组合抑制，相比对照d-泛酸的产量提高11.9％，效果没有单点抑制好。
[0166]
具体实施方式同实施例18，区别在与使用引物grna-crp-f和grna-crp-r(参见表2)扩增得到ptgrna-crp质粒的grna-crp嵌合体片段(核苷酸序列如seq id no.8所示)，与ptgrna-pgk线性化载体相连。
[0167]
实施例24：d-泛酸菌株dpap10/pdcas9grna-glta-crp构建及摇瓶发酵
[0168]
以dpap10为出发菌株，使用crispri技术设计ptarget同时含有grna-glta和grna-crp(参见表3)，将含有grna-glta-crp的ptarget电转入dpap10/pdcas9，使其带有双质粒发酵48h。如图9、10所示，对glta、crp进行组合抑制，相比对照d-泛酸的产量提高17.6％，效果
没有单点抑制好。
[0169]
具体实施方式同实施例18，区别在与使用引物grna-crp-f和grna-crp-r(参见表2)扩增得到ptgrna-crp质粒的grna-crp嵌合体片段(核苷酸序列如seq id no.8所示)，与ptgrna-glta线性化载体相连。

技术特征：
1.一种基于crispri筛选的产d-泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：(1)以基因工程菌zjutdpal5为底盘菌，在其基因组上增加受启动子ptrc调控的ecilvd基因拷贝数，得到工程菌dpal6 derivative，yjiv::ptrc-ecilvd，记为工程菌dpap7；(2)在工程菌dpap7基因组上通过基因敲入方式增加受启动子ptrc调控的枯草芽孢杆菌bspanb基因拷贝数，得到工程菌dpap7 derivative，flik::ptrc-bspanb，记为工程菌dpap8；(3)在工程菌dpap8基因组上通过基因敲入方式增加受启动子ptrc调控的谷氨酸棒杆菌cgpanc基因拷贝数，得到工程菌dpap8 derivative，ompt::ptrc-cgpanc，记为工程菌dpap9；(4)在工程菌dpap9基因组上通过基因敲入方式增加受启动子ptrc调控的枯草芽孢杆菌alss基因拷贝数，得到工程菌dpap9 derivative，yjip::ptrc-alss，记为工程菌dpap10；(5)制备工程菌dpap10的高压电穿孔法感受态细胞dpap10/pdcas9，设计ptarget同时含有grna-glta和grna-ptsh，将含有grna-glta-ptsh的ptarget电转入dpap10/pdcas9，得到工程菌dpap10/pdcas9grna-pgk-ptsh，即为所述产d-泛酸的基因工程菌。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述受ptrc启动子调控的ecilvd、bspanb、cgpanc、alss基因核苷酸序列分别如seq id no.1～4所示，所述grna-glta核苷酸序列如seq id no.5所示，所述grna-ptsh核苷酸序列如seq id no.6所示。3.构建权利要求1或2所述基因工程菌的方法，所述方法包括：(1)以基因工程菌zjutdpal5为底盘菌，运用crispr-cas9介导的基因编辑技术，将受来源于ptrc99a的ptrc启动子调控的ecilvd基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjiv，增强ecilvd的表达强度，得到工程菌dpal6 derivative，yjiv::ptrc-ecilvd，记为工程菌dpap7；(2)以工程菌dpap7为出发菌株，运用crispr-cas9介导的基因编辑技术，将受来源于ptrc99a的ptrc启动子调控的bspanb基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因flik，增强bspanb的表达强度，得到工程菌dpap7 derivative，flik::ptrc-bspanb，记为工程菌dpap8；(3)以工程菌dpap8为出发菌株，运用crispr-cas9介导的基因编辑技术，将受来源于ptrc99a的ptrc启动子调控的cgpanc基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因ompt，增强cgpanc的表达强度，得到工程菌dpap8 derivative，ompt::ptrc-cgpanc，记为工程菌dpap9；(4)以工程菌dpap9为出发菌株，运用crispr-cas9介导的基因编辑技术，将受来源于ptrc99a的ptrc启动子调控的alss基因替换掉出发菌株基因组上原有假基因yjip，增强alss的表达强度，得到工程菌dpap9 derivative，yjip::ptrc-alss，记为工程菌dpap10；(5)制备工程菌dpap10的高压电穿孔法感受态细胞dpap10/pdcas9，设计ptarget同时含有grna-glta和grna-ptsh，将含有grna-glta-ptsh的ptarget电转入dpap10/pdcas9，得到工程菌dpap10/pdcas9grna-glta-ptsh，即为所述产d-泛酸的基因工程菌。4.如权利要求3所述的基因工程菌方法，其特征在于：所述受ptrc启动子调控的
ecilvd、bspanb、cgpanc、alss基因核苷酸序列分别如seq id no.1～4所示，所述grna-glta核苷酸序列如seq id no.5所示，所述grna-ptsh核苷酸序列如seq id no.6所示。5.权利要求1或2所述基因工程菌在微生物发酵制备d-泛酸中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述产d-泛酸的基因工程菌接种至发酵培养基中，于28～42℃、150～250rpm条件下进行发酵培养72～96h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到所述d-泛酸。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10～30g/l、(nh4)2so
4 10～30g/l、kh2po
4 1～5g/l、mgso
4 0.1～2.0g/l、酵母提取物1～5g/l、caco
3 5～20g/l，0.5～2ml/l微量元素溶液，溶剂为去离子水，ph值自然；微量元素溶液组成为：10g/l cucl2、10g/l feso4·
7h2o、10g/lznso4·
7h2o、0.20g/l cuso4、0.02g/l nicl2·
7h2o，溶剂为去离子水。

技术总结
本发明基于CRISPRi筛选技术来识别内源性基因靶点，提供一种高产D-泛酸的基因工程菌及其构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。本发明证实CRISPRi筛选可以得到对DPA合成有益的基因靶点；运用CRISPRi技术，筛选识别内源性基因靶点大幅度提高基因工程菌D-泛酸生物合成能力，菌株DPAP10/pdCas9gRNA-gltA-ptsH相对于原始菌株DPAP10，在摇瓶中DPA产量提高了49.5％达到5.3g/L；中间代谢物检测分析发现，改变丙酮酸通量分布和降低TCA循环速率，会导致碳流更多流向DPA合成代谢路径中，从而提高DPA的产量，这一发现为构建更高产菌株提供了新思路。建更高产菌株提供了新思路。建更高产菌株提供了新思路。


技术研发人员：柳志强 张博 贺周霖 唐蒙娜 肖云颖 沈盼 郑裕国
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2023.06.13
技术公布日：2023/8/23