嗜黏蛋白阿克曼菌及囊泡在制备治疗癌症的药物中的用途

1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及嗜黏蛋白阿克曼菌及囊泡在制备治疗癌症的药物中的用途。


背景技术：

2.肝癌是全球癌症相关死亡最常见的原因之一，具有起病隐匿、进展迅速以及易转移的特点。目前，仅少数肝癌患者能被早期诊断并接受手术切除或肝移植治疗，而晚期患者多以化疗以及靶向药物(索拉菲尼)治疗等手段为主。但上述手段疗效有限，亟需探索肝癌治疗的新策略。
3.近年来，肠道细菌组成的失衡被发现与肿瘤的发生、发展密切相关。肠道特定活菌的移植更被证实可以抑制肿瘤进展以及增强靶向药物的疗效。然而，使用活的生物治疗剂存在引起败血症等风险。因此，确定细菌发挥功能的特定分子和功能机制对于确保治疗的安全和有效的临床应用具有重要意义。


技术实现要素：

4.根据第一方面，在一实施例中，提供嗜黏蛋白阿克曼菌在制备治疗癌症的药物中的用途。
5.根据第二方面，在一实施例中，提供囊泡在制备治疗癌症的药物中的用途。
6.在一实施例中，本发明证实了akk丰度的减少与肝癌侵袭性的联系，并且服akk显示出抗肿瘤的效果。
7.在一实施例中，本发明进一步发现，akk衍生的细菌胞外囊泡(bevs)可以从肠道中进入宿主循环并到达肝脏部位，并通过传递膜蛋白hxs抑制了肝癌的生长和转移。通过qpcr以及wb实验验证，akk-evs-hxs通过上调肿瘤细胞铁死亡相关基因(zip8/14,nox2以及vdac2/3)，诱导了肝癌细胞的铁死亡，从而可以增强索拉非尼介导的体内抗肿瘤疗效。本发明为细菌于宿主相互作用提供新的见解，并证实akk-evs-hxs作为肝癌新型治疗手段的潜力。
附图说明
8.图1为粪便样本检测结果，其中，(a).对照组和肝癌患者的粪便样本中微生物群落结构的主坐标图(pcoa)；(b).健康体检人群或肝癌患者不同阶段的粪便样本中akk的相对丰度；(c).在健康体检人群或不同阶段的肝癌患者中，粪便样本akk dna序列阳性(akk阳性)的对象百分比；(d).根据粪便样本中akk的丰度评估健康体检人群和肝癌患者之间的roc曲线；(e).akk补充处理小鼠实验示意图；(f).使用akk或pbs处理小鼠模型的死亡率；(g).肝脏组织he染色和肿瘤肝脏转移率(比例尺：100μm)；
9.图2为akk-ev电镜图、wb以及nta表征结果；
10.图3为小鼠成像图，其中，(a).荧光染色akk-ev处理小鼠后的活体成像图；(b).荧
光染色akk-ev处理小鼠后不同器官荧光成像图；
11.图4为akk-evs的细胞侵袭及小鼠实验结果，其中，(a).akk-evs,e.coli-evs或者pb s处理huh-7细胞划痕实验；(b).akk-evs,e.coli-evs或者pbs处理huh-7细胞emt实验结果；(c).akk-evs,e.coli-evs或者pbs处理huh-7细胞后细胞emt相关基因的蛋白水平；(d).akk-evs,e.coli-evs或者pbs处理小鼠实验示意图；(e).akk-evs,e.coli-evs或者pbs处理后小鼠死亡率；(f).huh-7细胞皮下荷瘤21天内不同处理小鼠肿瘤生长情况；(g).不同处理小鼠肿瘤肝脏转移情况以及切片he染色图像(比例尺：100μm)；(h).不同处理小鼠结肠病理评分以及切片he染色图像(比例尺：100μm)；
12.图5为akk-evs-hxs结构示意图；
13.图6为akk-evs-hxs的细胞侵袭及小鼠实验结果，其中，(a).akk-evs-hxs或者pbs处理huh-7细胞划痕实验；(b).akk-evs-hxs或者pbs处理huh-7细胞emt实验；(c).akk-evs-hxs或者pbs处理huh-7细胞后细胞emt相关基因的蛋白水平；(d).akk-ev-hxs或者pbs处理小鼠实验示意图；(e).akk-evs-hxs或者pbs处理后小鼠死亡率；(f).huh-7细胞皮下荷瘤21天内不同处理小鼠肿瘤生长情况；
14.图7为肿瘤抑制实验结果，其中，(a).索拉菲尼、akk-evs、akk-evs-hxs、hxs+索拉菲尼或者pbs处理小鼠实验示意图；(b).不同处理后小鼠死亡率；(c).huh-7细胞皮下荷瘤21天内不同处理小鼠肿瘤生长情况；
15.图8为akk-evs水平检测结果，其中，(a).索拉菲尼不同反应性患者akk-evs水平；(b).不同akk-evs水平患者生存率；(c).akk-evs水平用于患者索拉菲尼反应性评估的roc曲线。
具体实施方式
16.下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本技术能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本技术相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本技术的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
17.另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
18.本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
19.本发明前期研究结果发现，akk-evs关键作用分子hxs可以调控肝癌细胞铁死亡正相关基因表达上调，并首次提出akk-evs-hxs联合索拉菲尼作为肝癌治疗新手段的创新应用设想，有望为肿瘤药物治疗提供新策略。
20.根据第一方面，在一实施例中，提供嗜黏蛋白阿克曼菌在制备治疗癌症的药物中
的用途。
21.在一实施例中，所述癌症包括但不限于肝癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌中的至少一种。
22.根据第二方面，在一实施例中，提供囊泡在制备治疗癌症的药物中的用途。
23.在一实施例中，所述囊泡包括但不限于细菌源性囊泡。
24.在一实施例中，所述细菌源性囊泡来自嗜黏蛋白阿克曼菌。
25.在一实施例中，所述囊泡含有hxs蛋白(hepatic xenosignal protein，肝脏异种信号蛋白)。
26.在一实施例中，所述癌症包括但不限于肝癌。
27.在一实施例中，所述细菌源性囊泡用于制备抑制癌细胞增殖的药物。
28.在一实施例中，所述药物中还含有靶向药物。
29.在一实施例中，所述靶向药物包括但不限于索拉非尼、瑞戈非尼、辛伐他汀、氟伐他汀、爱拉斯汀、柳氮磺胺吡啶、gpx4抑制剂、姜黄素、青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯、荜茇酰胺中的至少一种。
30.在一实施例中，细菌源性囊泡可单独用于制备治疗肝癌等癌症的药物，也可与其他药物(例如靶向药物)联合用于制备治疗肝癌等癌症的药物。
31.本发明前期研究发现，肝癌患者肠道菌群出现结构紊乱以及共生菌akkermansia mucini phila(akk)缺失等特征(见图1a～d)。更有趣的是，通过对肝癌模型小鼠补充akk菌可有效抑制肝癌的进展，并增强靶向药物索拉菲尼对肝癌的抑制作用。
32.细菌源性囊泡(bacterial extracellular vesicles,bevs)由细菌释放、具有脂质双层膜结构的纳米级颗粒。这些携带了多种细菌母体活性分子、性质稳定的bevs可作为肠菌影响肠道甚至肠外器官功能的关键信息传导载体，并逐渐成为肿瘤治疗的研究前沿。
33.然而akk是否通过bevs的方式在肝癌进展中发挥远程调控的作用，其中的关键作用成分及分子机制是什么，akk来源的bevs(akk-evs)能否作为肝癌的治疗手段仍未见报道。
34.在一实施例中，本发明研究发现，肝癌患者肠道akk丰度显著降低，而akk-evs可以穿过肠道-血液屏障，将功能蛋白akk-evs-hxs输送到肝癌细胞，以调节基因表达。因此，本发明为探索akk-evs在肝癌生物治疗中的应用提供了依据。此外，本发明从体内外实验证实了akk-evs-hxs可以诱导肿瘤细胞铁死亡，从而增强肿瘤药物索拉菲尼的反应性。akk-evs-hxs无论是单独使用还是与索拉非尼联合使用，都可能成为无法手术的晚期肝癌患者在目前有限的治疗之外的一种治疗选择。
35.在一实施例中，本发明提供富含hxs蛋白的嗜黏蛋白阿克曼菌(akkermansia muciniphi la，akk)来源的细菌源性囊泡(bacterial extracellular vesicles,bevs)及其应用。具体为akk来源富含hxs蛋白的细菌源性囊泡影响肝癌发生发展并联合索拉菲尼在制备治疗肝癌的药物中的应用。
36.实施例
37.(1)akk-evs的分离及表征
38.①
使用超高速离心法分离提取akk-evs：
39.a.细菌培养：将-80℃冻存的细菌菌液快速转移到水浴箱中解冻(37℃)；取50μl细
菌悬浊液到200ml的高压灭菌的培养基中，在厌氧培养箱(37℃，5％二氧化碳，85％氮气和10％氢气)培养3天；当培养基液体出现浑浊或者培养瓶底部出现沉淀时，说明细菌扩增成功；
40.b.evs分离：将菌液用1000
×
g离心15min后取上清，再将上清12000
×
g离心15min后取上清，随后用0.22μm滤膜过滤并收集滤过液。滤过液在110000
×
g下超速离心35min，弃上清液后加入pbs重悬，并110000
×
g超速离心35min，弃上清液后加入100μl pbs吹打重悬，完成囊泡的提取。
41.②
通过透射电镜、纳米示踪分析(nta)及免疫印迹等手段验证各种evs的成功分离：
42.(2)在多种肝癌细胞系上明确akk-evs的抑癌作用
43.将akk-evs与肝癌细胞(bel-7402、mhcc97和huh-7)共培养，验证其对肝癌细胞迁移、侵袭以及emt样变化的影响
44.a.细胞体外迁移实验：待细胞增殖至覆盖皿底70-80％时用胰酶把细胞消化并铺在6孔板中(约2
×
105/孔)，放置于孵育箱过夜(37℃，5％二氧化碳)；待细胞增殖至覆盖皿底70-80％时，用枪头(200μl)在孔底划一直线，从而把单层细胞出现划痕；弃去细胞上清，并用无菌pbs清洗细胞3次；清洗完毕后，往培养皿加入无血清dmem培养基以及处理物，并在显微镜下记录并记下记号；然后把培养皿放置在孵育箱(37℃，5％二氧化碳)培养不同时间段(24h及48h)；在不同的时间点下在显微镜下观察并记录划痕大小；
45.b.细胞体外侵袭实验：将细胞培养液更换成无血清dmem培养基并放置在孵育箱(37℃，5％二氧化碳，12h)培养；将matrigel胶用无血清dmem培养基进行稀释(按体积计，mat rigel胶：无血清dmem培养基＝1：8)，并在transwell chamber上加入matrigel胶稀释液(100μl)，并放置在孵育箱(37℃，5％二氧化碳)；将dmem完全培养基加入到transwell下室中，上室而加入饥饿处理后的细胞悬液(500μl，dmem完全培养基，细胞数：1
×
105/ml)并放置在孵育箱(37℃，5％二氧化碳，24h)；然后取出chamber用无菌pbs清洗干净后转移到甲醇中固定(室温，30min)；随后吸干chamber的固定液，并加入结晶紫进行染色(室温，30min)；最后将chamber清洗干净后在显微镜下观察分析；
46.c.emt样变化实验：通过wb实验对不同组别肝癌细胞中间充质相关蛋白(vimentin)以及细胞黏附蛋白(e-cadiherin)的表达进行分析，评估akk-evs对肝癌细胞emt样变化的影响。
47.(3)通过构建的肝癌小鼠模型明确akk-evs对肝癌发展的抑制作用
48.通过akk-evs对肝癌模型小鼠进行灌胃处理，验证其对肝癌模型小鼠体重、进食量、肿瘤大小、数量、转移率、死亡率、生存时间以及肿瘤emt样变化的影响。
49.把小鼠按实验需求分成三组(组1：4～5周龄spf级nude小鼠+pbs组；组2：4～5周龄spf级nude小鼠+e.coli-evs组；组3：4～5周龄spf级nude小鼠+akk-evs组)；待细胞增殖至覆盖皿底90％时，用胰酶消化细胞并用预冷的无菌pbs将细胞清洗2次；然后用无菌pbs将细胞浓度调节为1
×
107/ml，并加入不同分组的处理物，一起注射进小鼠皮下；观察小鼠成瘤后体重、进食量、肿瘤大小变化，肿瘤器官转移情况以及21天生存率。
50.(4)akk-evs-hxs对肝癌细胞增殖的抑制作用
51.图5为akk-evs-hxs结构示意图。akk-evs-hxs与肝癌细胞(bel-7402、mhcc97和
huh-7)共培养后，进行细胞体外迁移、侵袭实验及wb分析，验证其对肝癌细胞增殖、侵袭以及emt样变化的影响。
52.(5)akk-evs-hxs对肝癌发展的抑制作用
53.用akk-evs-hxs对肝癌模型小鼠进行灌胃处理，验证其对肝癌模型小鼠体重、进食量、肿瘤大小、数量、转移率、死亡率、生存时间以及肿瘤emt样变化的影响：把小鼠按实验需求分成两组(组1：4～5周龄spf级nude小鼠+pbs组；组2：4～5周龄spf级nude小鼠+akk-hxs组)；待细胞增殖至覆盖皿底90％时，用胰酶消化细胞并用预冷的无菌pbs将细胞清洗2次；然后用无菌pbs将细胞浓度调节为1
×
107/ml，并加入不同分组的处理物，一起注射进小鼠皮下；观察小鼠成瘤后体重、进食量、肿瘤大小变化，肿瘤器官转移情况以及21天生存率。
54.(6)探究akk-evs-hxs发挥作用的具体机制
55.①
通过转录组学对akk-evs-hxs处理后的肝癌细胞(bel-7402、mhcc97和huh-7)以及肝肿瘤组织进行分析，探究akk-evs-hxs发挥作用的具体机制；
56.②
通过wb验证akk-evs-hxs抑制肝癌细胞增殖以及肝肿瘤发展的具体机制。
57.(7)在体外水平验证akk-evs-hxs联合索拉菲尼对肝癌细胞的抑制作用
58.akk-evs-hxs、索拉菲尼以及akk-evs-hxs联合索拉菲尼与肝癌细胞(bel-7402、mh cc97和huh-7)共培养后，进行细胞体外迁移、侵袭实验及wb分析，验证其对肝癌细胞增殖、侵袭以及emt样变化的影响。
59.(8)在体内水平验证akk-evs-hxs联合索拉菲尼对肝癌发展的抑制作用
60.把小鼠肝癌模型按实验需求分成三组(组1：4～5周龄spf级nude小鼠+akk-evs-hx s组；组2：4～5周龄spf级nude小鼠+索拉菲尼组；组3：4～5周龄spf级nude小鼠+ak k-evs-hxs+索拉菲尼组)；待小鼠成瘤后分别使用不同处理物，对小鼠进行灌胃处理；观察小鼠体重、进食量、肿瘤大小变化，肿瘤器官转移情况以及21天生存率。
61.实验结果
62.从图1(a,b)可见，与对照组相比，肝癌患者肠道菌群构成发生改变，物种丰富度和α多样性减少。(c,d)图显示肝癌患者粪便中的akk丰度明显下降，且与疾病的严重程度有关。此外，akk丰度显示了区分患者和健康人群的高准确性。
63.从图2可见，高纯度akk-ev被成功提取。
64.从图3可见，肠道中akk-ev可以进入小鼠体内，并主要聚集在肝脏以及结肠。
65.从图4可见，图4(a,b)的结果显示，akk-evs显著降低huh-7细胞的迁移侵袭能力。图4(c)表明akk-evs剂量依赖性地拮抗了肝癌细胞中e-cadherin的下调和vimentin的上调。图4(e,f)的结果显示，akk-evs有效抑制肿瘤生长并降低小鼠死亡率。图4(g,h)显示akk-evs可以抑制肝癌转移，改善肠屏障损伤。
66.图5为akk-evs-hxs结构示意图。
67.从图6可见，图6(a,b)的结果显示，akk-evs-hxs显著降低huh-7细胞的迁移侵袭能力。图6(c)表明akk-evs-hxs剂量依赖性地拮抗了肝癌细胞中e-cadherin的下调和vi mentin的上调。图6(e,f)的结果显示，akk-evs-hxs有效抑制肿瘤生长并降低小鼠死亡率。
68.从图7的结果显示，hxs联合使用有效升高索拉菲尼肿瘤抑制效果。
69.从图8可见，图8(a,b)显示索拉菲尼不同反应性患者akk-evs水平存在差异，且其水平与生存率有关。图8(c)结果说明akk-evs水平用于患者索拉菲尼反应性评估的具有较
好的性能。
70.在一实施例中，本发明证实了akk丰度的减少与肝癌侵袭性的联系，并且服akk显示出抗肿瘤的效果。进一步发现，akk衍生的细菌胞外囊泡(bevs)可以从肠道中进入宿主循环并到达肝脏部位，并通过传递膜蛋白hxs抑制了肝癌的生长和转移。通过qpcr以及wb实验验证，akk-evs-hxs通过上调肿瘤细胞铁死亡相关基因(zip8/14,nox2以及vdac2/3)，诱导了肝癌细胞的铁死亡，从而可以增强索拉非尼介导的体内抗肿瘤疗效。本发明为细菌于宿主相互作用提供新的见解，并证实akk-evs-hxs作为肝癌新型治疗手段的潜力。
71.基于活菌移植的生物疗法应用于疾病治疗的关键作用途径是亟待探究的科学问题。本发明创新性地提出bevs是akk菌远程对肝癌细胞发挥抑癌效应的关键作用媒介。该研究有望为肠道细菌及bevs的研究提供新视野，为其临床应用提供科学依据。
72.在一实施例中，本发明成功筛选出对肝癌发展有显著抑制作用的akk-evs。
73.鉴于bevs携带了多种细菌母体活性分子、性质稳定，并逐渐成为肿瘤治疗的研究前沿。基于此，本发明成功筛选出对肝癌发展有显著抑制作用的akk-evs，有望为肿瘤相关疾病的治疗提供新的手段，为拓展bevs的研究与临床应用提供新的思路与方向。
74.在一实施例中，本发明提出akk-evs-hxs联合索拉菲尼作为肝癌治疗新药物的创新应用设想。
75.在一实施例中，可以将akk-evs/akk-evs-hxs应用于不同肿瘤类型的治疗；
76.在一实施例中，可以将akk-evs/akk-evs-hxs与不同抗肿瘤药物联用。
77.以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

技术特征：
1.嗜黏蛋白阿克曼菌在制备治疗癌症的药物中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述癌症包括肝癌。3.囊泡在制备治疗癌症的药物中的用途。4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述囊泡包括细菌源性囊泡。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述细菌源性囊泡来自嗜黏蛋白阿克曼菌。6.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述囊泡含有hxs蛋白。7.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述癌症包括肝癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌中的至少一种。8.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述细菌源性囊泡用于制备抑制癌细胞增殖的药物。9.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述药物中还含有靶向药物。10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述靶向药物包括索拉非尼、瑞戈非尼、辛伐他汀、氟伐他汀、爱拉斯汀、柳氮磺胺吡啶、gpx4抑制剂、姜黄素、青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯、荜茇酰胺中的至少一种。

技术总结
本发明提供嗜黏蛋白阿克曼菌及囊泡在制备治疗癌症的药物中的用途。本发明证实了Ak k丰度的减少与肝癌侵袭性的联系，并且服Akk显示出抗肿瘤的效果。示出抗肿瘤的效果。示出抗肿瘤的效果。


技术研发人员：郑磊 欧子豪 郑喜芬 李迁贝
受保护的技术使用者：南方医科大学南方医院
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/8/23