整合素纳米银螯合肽复合涂层及其制备方法和应用

1.本发明涉及骨外固定螺钉涂层材料技术领域，是一种整合素纳米银螯合肽复合涂层及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着现代社会的发展，因意外导致的骨损伤正逐年增加，越来越多的患者因骨关节、创伤和脊柱疾病接受了手术治疗，骨外固定支架构造灵活、易于掌握、损伤性低，受到了骨科手术医师的青睐，尤其是当面对四肢骨折且软组织条件较差时更能凸显其治疗优势，起到了不可替代的作用。
3.然而，外固定支架在治疗患者的同时也带来了许多的并发症，尤其是需要长期带架的患者。螺钉松动和钉道感染是外固定术的常见并发症，钉骨界面是外固定系统中最薄弱的环节，钛基螺钉因表面由于生物惰性氧化层的存在，致使无法产生与骨组织稳定结合的化学键性结构，钉骨界面易形成纤维隔层，使螺钉产生松动，导致手术失败。另有一系列研究指出，采用外固定支架治疗的患者中，钉道感染的发生率甚至可达到100%，也就是说钉道感染几乎是使用外固定支架时不可避免的问题，如果感染仅局限于皮肤的表面，往往不需要做过多的处理，但是若对深层骨及软组织造成侵袭，则会引起固定螺钉松动，导致骨折复位丢失，甚至骨髓炎的发生。螺钉松动和钉道感染两大并发症的存在极大的提高了手术失败的风险，也限制了外固定支架的临床应用。
4.为了提高螺钉稳定性和减少并发症的发生，学者们尝试采用新型材料或是在医用螺钉表面进行改性的方式加以解决，由此羟基磷灰石、生物活性肽等各种涂层螺钉应运而生。在种种外固定螺钉涂层材料中，羟基磷灰石涂层螺钉具有促进骨整合，改善骨界面力学锚固的功效，被广泛用于外固定螺钉的临床试验及治疗中。然而，羟基磷灰石涂层螺钉较为昂贵，且该涂层的抗菌性并不尽如人意，在由于创面重度污染，无法做到彻底清创的情况下，发生钉道感染的概率极大；并且羟基磷灰石涂层相关种植体的逐渐松动也是骨科实践中的一个关键问题，此外羟基磷灰石涂层的机械强度差，容易破裂，这导致种植体失败率较高。
5.随着近年来材料学的蓬勃发展，各种新型材料和生物涂层被应用于钛基材料的表面改性工程，其中集合了rgd序列和dopa基团两者优势的整合素靶向肽仿生多肽(dopa-rgd)因其高度仿生、天然亲和的独特优势走入了学者的视野，其被证实可以用于钛植入物表面的改性，并起到改善植入物周围骨量的作用。
6.因此，研究开发具有促进骨整合，加速新骨形成，增强内植物与周围骨的结合，且又能够有效的控制感染、低毒或无毒性的螺钉涂层，是目前亟待解决的一个关键问题。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种整合素纳米银螯合肽复合涂层及其制备方法和应用，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决骨外固定支架现有存在容易引起钉道感染和螺钉松动的
问题。
8.本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种整合素纳米银螯合肽复合涂层，其材料的化学结构式为：。
9.下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：上述整合素纳米银螯合肽复合涂层按照下述制备方法得到：第一步，将钛片或/和钛钉经蒸馏水清洗后，在无水乙醇中浸泡，然后用氧等离子体处理；第二步，将处理后的钛片或/和钛钉浸入含(dopa)
4-g
5-grgds的pbs溶液中进行第一层涂层；第三步，将第一层涂层后的钛片或/和钛钉浸入医用酒精中消毒，并洗去未附着的(dopa)
4-g
5-grgds，进行干燥；第四步，将干燥的钛片或/和钛钉浸泡在agno3溶液中静置后进行第二层涂层，用医用酒精浸泡消毒并晾干，在钛片或/和钛钉表面得到整合素纳米银螯合肽复合涂层。
10.上述第一步中，无水乙醇中的浸泡时间为2h，氧等离子体处理的时间为60秒。
11.上述第二步中，含(dopa)
4-g
5-grgds的pbs溶液为每1毫升pbs溶液中含10μg(dopa)
4-g
5-grgds，第一层涂层的时间为2h。
12.上述第三步中，消毒温度为25℃，消毒时间为1h，医用酒精体积分数为75%。
13.上述第四步中，第二层涂层时间为10min，agno3溶液的浓度为2μg/ml，消毒时间为10min，医用酒精体积分数为75%。
14.本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种整合素纳米银螯合肽复合涂层的制备方法，按照下述方法进行：第一步，将钛片或/和钛钉经蒸馏水清洗后，在无水乙醇中浸泡，然后用氧等离子体处理；第二步，将处理后的钛片或/和钛钉浸入含(dopa)
4-g
5-grgds的pbs溶液中进行第一层涂层；第三步，将第一层涂层后的钛片或/和钛钉浸入医用酒精中消毒，并洗去未附着的(dopa)
4-g
5-grgds，进行干燥；第四步，将干燥的钛片或/和钛钉浸泡在agno3溶液中静置后进行第二层涂层，用医用酒精浸泡消毒并晾干，在钛片或/和钛钉表面得到整合素纳米银螯合肽复合涂层。
15.本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种整合素纳米银螯合肽复合涂层在作为治疗骨损伤时抑制外固定架钉道周围感染的医疗器械中的应用。
16.本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种整合素纳米银螯合肽复合
涂层在作为治疗骨损伤时防止医用螺钉松动的医疗器械中的应用。
17.本发明整合素纳米银螯合肽复合涂层通过对医用钛基材料螺钉进行改性，可在骨损伤时作为骨外固定支架，不仅具有强效抗菌性，还可促进钉道周围骨整合和有效预防螺钉松动。
附图说明
18.附图1为本发明整合素纳米银螯合肽复合涂层中ag
⁺
释放曲线图。
19.附图2为本发明合素纳米银螯合肽复合涂层在激光功率密度为1w/cm2照射下的循环升温曲线图。
20.附图3为本发明中不同复合涂层培养24h抗菌性能定性测试图。
21.附图4为本发明中不同复合涂层培养24h抗菌性能定量数据图。
22.附图5为本发明中bmscs在不同复合涂层表面培养7天的sem图。
23.附图6为本发明中bmscs细胞分别在不同复合涂层表面培养的cck-8细胞活性柱状图。
24.附图7为本发明中bmscs细胞分别在不同复合涂层表面培养的细胞核dapi染色图。
25.附图8为本发明中大鼠股骨外固定螺钉的拔出峰值力图。
26.附图9为本发明中不同螺钉植入6周后钉道微环境组织学图像。
27.附图10为本发明中von kossa硬组织染色沉积参数百分比的直方图。
具体实施方式
28.本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品。
29.下面结合实施例对本发明作进一步描述：实施例1：该整合素纳米银螯合肽复合涂层，其材料的化学结构式为：。
30.实施例2：作为上述实施例的优化，整合素纳米银螯合肽复合涂层按照下述制备方
法得到：第一步，将钛片或/和钛钉经蒸馏水清洗后，在无水乙醇中浸泡，然后用氧等离子体处理；第二步，将处理后的钛片或/和钛钉浸入(dopa)
4-g
5-grgds中pbs溶液中进行第一层涂层；第三步，将第一层涂层后的钛片或/和钛钉浸入医用酒精中消毒，并洗去未附着的(dopa)
4-g
5-grgds，进行干燥；第四步，将干燥的钛片或/和钛钉浸泡在agno3溶液中静置后进行第二层涂层，用医用酒精浸泡消毒并晾干，在钛片或/和钛钉表面得到整合素纳米银螯合肽复合涂层。
31.实施例3：作为上述实施例的优化，第一步中，无水乙醇中的浸泡时间为2h，氧等离子体处理的时间为60秒。
32.实施例4：作为上述实施例的优化，第二步中，含(dopa)
4-g
5-grgds的pbs溶液为每1毫升pbs溶液中含10μg(dopa)
4-g
5-grgds，第一层涂层的时间为2h。
33.实施例5：作为上述实施例的优化，第三步中，消毒温度为25℃，消毒时间为1h，医用酒精体积分数为75%。
34.实施例6：作为上述实施例的优化，第四步中，第二层涂层时间为10min，agno3溶液的浓度为2μg/ml，消毒时间为10min，医用酒精体积分数为75%。
35.实施例7：该整合素纳米银螯合肽复合涂层的制备方法，按照下述方法进行：第一步，将钛片或/和钛钉经蒸馏水清洗后，在无水乙醇中浸泡，然后用氧等离子体处理；第二步，将处理后的钛片或/和钛钉浸入(dopa)
4-g
5-grgds中pbs溶液中进行第一层涂层；第三步，将第一层涂层后的钛片或/和钛钉浸入医用酒精中消毒，并洗去未附着的(dopa)
4-g
5-grgds，进行干燥；第四步，将干燥的钛片或/和钛钉浸泡在agno3溶液中静置后进行第二层涂层，用医用酒精浸泡消毒并晾干，在钛片或/和钛钉表面得到整合素纳米银螯合肽复合涂层。
36.实施例8：该整合素纳米银螯合肽复合涂层在作为治疗骨损伤时抑制外固定架钉道周围感染的医疗器械中的应用。
37.实施例9：该整合素纳米银螯合肽复合涂层在作为治疗骨损伤时防止医用螺钉松动的医疗器械中的应用。
38.实施例10：钛片或/和钛钉经蒸馏水清洗后，无水乙醇浸泡2h，然后用氧等离子体处理60秒。将其浸入浓度为10μg/ml的(dopa)
4-g
5-grgds中pbs溶液中2h。后在25℃，将钛片或/和钛钉浸入75%的医用酒精中1h消毒，并洗去未附着的(dopa)
4-g
5-grgds。在超净台待其干燥，浸泡在浓度为2μg/mlagno3溶液中，下静置10min，并用75%的医用酒精中浸泡消毒30min，在钛片或/和钛钉表面得到整合素纳米银螯合肽（以下可简称为ti@dopa-rgd-nag）复合涂层，超净台中晾干备用。
39.一、根据上述实施例10，在钛（ti）片及钛（ti）钉表面得到整合素纳米银螯合肽复合涂层，对其进行稳定性及抗菌性的测定：（一）材料和试剂(1)纯钛(四川阿尔泰医疗器械公司)(2)血琼脂平板培养基(常德比克曼生物科技有限公司)(3)cck-8试剂盒(北京博奥森)(4)1,3-二苯基异苯并呋喃(上海百舜生物科技有限公司)(5)(dopa)
4-g
5-grgds(江苏申琅生物科技有限公司)
(6)agno3(上海精细化工材料研究所)(7)4%多聚甲醛(北京雷根生物技术有限公司)（二）仪器(1)扫描电子显微镜(sem,日立su8010，日本)(2)恒温培养箱(pbh-9082,中国一恒)(3)电感耦合等离子体光谱发射仪(icp，北京普析通用仪器有限公司)(4)808nmnir激光器(北京宏蓝光电科技)(5)傅立叶红外光谱仪(bruker公司，德国)(6)生物安全柜(中国苏州安泰空气技术有限公司)(7)直立式压力蒸汽灭菌锅(中国上海博迅实业有限公司医疗设备厂)(8)电热鼓风干燥(天津市泰斯特仪器有限公司)(9)nacl(天津市致远化学试剂有限公司)(10)固体紫外-可见分光光度计(日立高新技术公司，日本)（三）整合素纳米银螯合肽复合涂层生理稳定性测试在钛片或/和钛钉表面得到整合素纳米银螯合肽复合涂层中，ag
+
释放曲线图如图1所示，图1中ag
+
释放结果表明，在开始的两天内观察到ag
+
的突释，并且随着浸没时间的进一步延长，在第10天时，复合涂层的ag
+
的释放量为0.24mg
·
l-1
，在低细胞浓度以下，这可能是由于dopa的儿茶酚基团对ag
+
具有螯合作用，会形成dopa-ag
+
配位键，减少其释放量。因此，本发明整合素纳米银螯合肽复合涂层具有良好的生理稳定性。
40.（四）整合素纳米银螯合肽复合涂层的光热性能分析对在钛片或/和钛钉表面得到整合素纳米银螯合肽复合涂层进行了5次升温降温循环测试，结果如图2所示。由图2可知，整合素纳米银螯合肽复合涂层的光热转换性能在5个升温-降温循环保持稳定，因此本发明整合素纳米银螯合肽复合涂层具有良好的光热转换稳定性。
41.（五）整合素纳米银螯合肽复合涂层的抗菌性能测试对ti、ti@dopa-rgd、ti@dopa-rgd-nag、光照ti@dopa-rgd-nag行复合涂层抗菌性能测试：将e.coli和s.aureus接种于lb培养基中，反复接种三次，得到较纯的菌落；通过紫外照射对各组材料进行预灭菌，然后将材料固定于培养皿中；刮取两种菌株单菌落细菌，取生理盐水进一步制成0.5麦氏单位菌悬液。分别在各组材料表面滴50μl菌悬液，在恒温培养箱中培育1d；分别在各复合涂层表面移取10μl菌液，并用生理盐水稀释至2ml后移去50μl涂平板，恒温培养箱中再次培育1d后取出培养板；对培养板进行摄片，结果如图3所示。
42.根据图3中e.coli和s.aureus在培养板表面的生长情况做抗菌定性分析，在孵育24小时后，对照组纯ti组未显现其具有抗菌性，在纯ti表面形成了许多堆积的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落，增殖强大，代谢旺盛。与对照组相比，ti@dopa-rgd展现出了一定的抗菌能力，大肠杆菌及金黄色葡萄菌落数较对照组有着显著减少。无光照ti@dopa-rgd-nag表面大肠杆菌和金黄色葡萄球菌较之ti@dopa-rgd组更是显著减少。而在有光照ti@dopa-rgd-nag表面上没有发现任何大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
43.对图3中培养板菌落数目进行抗菌定量分析，结果如图4所示。图4可以看出，ti@dopa-rgd对金黄色葡萄球菌的抗菌率为42%，对大肠杆菌的抗菌率为35%，无光照的ti@
dopa-rgd-nag对金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为85%，对大肠杆菌的抗菌率均为97%，有光照的ti@dopa-rgd-nag对两种细菌的抗菌率均为100%。事后两两比较结果显示，ti@dopa-rgd-nag组和ti@dopa-rgd-nag+light组两者之间无统计学差异(p＞0.05)，余下各组之间均互相存在统计学差异(p＜0.05)。这些结果表明ti@dopa-rgd-nag及ti@dopa-rgd-nag+light对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌两种菌体均具有良好的抗菌能力。其中，计算平均抗菌率的公式如下:抗菌率=对照组菌落数&实验组菌落数/对照组菌落数因此，本发明整合素纳米银螯合肽复合涂层生理稳定性良好，且在近红外光的激发下具备良好的快速杀菌能力。
44.二、根据上述实施例10，在钛（ti）片及钛（ti）钉表面得到整合素纳米银螯合肽复合涂层，对细胞活性及成骨能力的影响测定（一）材料和试剂(1)spf级雄性sd大鼠(新疆医科大学实验动物中心)(2)磷酸盐缓冲液(thermo，美国)(3)胎牛血清(hyclone，美国)(4)α-mem培养基(bi，以色列)(5)青链霉素(gibco，澳洲)(6)胰蛋白酶/edta溶液(bi，以色列)(7)cck-8(北京博奥森)(8)整合素靶向肽(dopa)4-g5-grgds(江苏申琅生物科技有限公司)(9)bca试剂盒(thermo，美国)(10)4%多聚甲醛(北京雷根生物技术有限公司)(11)大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化试剂盒(广州赛业)(12)dapi溶液(北京索莱宝)(13)无水乙醇(山东卓健医疗科技有限公司)(14)95%的乙醇(山东卓健医疗科技有限公司)(15)75%乙醇(山东卓健医疗科技有限公司)(16)茜素红染色液(北京索莱宝)(17)alp染色液(北京索莱宝)(18)pagerulerprestainedproteinladder(thermo，美国)(19)sds-page凝胶制备试剂盒(北京索莱宝)(20)5xtris-甘氨酸电泳缓冲液(北京索莱宝)(21)ap显色液(invitrogen，美国)(22)ripa裂解液(sigma，美国)(23)rabbit-anti-gapdh-antibody(abcam，美国)(24)rabbit-anti-runx2-antibody(北京博奥森)(25)rabbit-anti-osterix-antibody(abcam，美国)(26)rabbit-anti-osteopontin-antibody(abcam，美国)（二）仪器
(1)流式细胞仪(bd，美国)(2)细胞培养箱(thermo，美国)(3)酶标仪(thermo，美国)(4)倒置相差显微镜(zeiss，德国)(5)超纯水系统(泽拉布公司，美国)(6)直立式自动双重纯水蒸馏器(泽拉布公司，美国)(7)20℃冰箱(西门子公司，德国)(8)4℃冰箱(西门子公司，德国)(9)imageproplus4.5图像分析软件(mediacybernetics，美国)(10)移液枪0.2μl-1000μl(eppendorf，德国)(11)低温超速离心机(eppendorf，德国)(12)western-blot电泳装置(bio-rad公司，美国)(13)恒温脱色摇床(ika，德国)(14)电子天平(ika，德国)(15)光学显微镜(zeiss，德国)(16)正置光学显微镜(尼康，日本)（三）sd大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养断颈脱臼法处死sd大鼠，浸入75%乙醇溶液中1min，置于无菌单上，用手术刀片沿股骨表面切开皮肤、肌肉，直达骨面，解脱髋、膝关节，将软组织完整剥除，抽出股骨，无菌纱进一步清理骨面残余软组织，取含10%双抗的磷酸盐缓冲液重复冲洗，组织剪剪开两端骨骺，10ml注射器抽取α-mem完全培养基，并注入骨髓腔中冲出骨髓，然后用10ml、5ml、1ml注射器依次反复抽吸混匀骨髓液，直至骨髓液大体色泽均一，收集骨髓液上机离心(1500r/min、5min)，更换培养基，继续重悬离心2次，末次重悬后将细胞悬液接种于培养瓶中，置于co2细胞孵育箱中，以后每3d全换液。
45.待细胞增殖至90%时进行传代，弃培养基，用适量磷酸盐缓冲液清洗细胞，用0.25%胰蛋白酶+0.02%edta消化细胞，按照1∶2比例传代，镜下观测细胞形态，并摄片记录。
46.（四）整合素纳米银螯合肽复合涂层细胞相容性测试实验共设有三个钛基涂层培养组，分为ti、ti@dopa-rgd、ti@dopa-rgd-nag。将ti、ti@dopa-rgd、ti@dopa-rgd-nag培养板分别置于6孔培养板中，将密度为1
×
104/ml的细胞接种到复合涂层表面，将1.0mlα-mem的培养基分别加到培养板中，放置在co2培养箱中恒温37℃培养，用于细胞形态和活性、增殖情况检测，操作如下:(1)细胞形态：将培养7天后的样品经磷酸盐缓冲液漂洗后，进行血清封闭，戊二醛溶液(2.5%)细胞固定，分别用乙醇溶液、乙酸乙酯脱水脱醇，并通过sem观察细胞在ti、ti@dopa-rgd、ti@dopa-rgd-nag涂层表面生长的形态，人体骨骼是由骨髓基质细胞（以下简称为bmscs）增殖分化为成骨细胞而形成的，第7天bmscs的sem显微照片如图5所示。
47.图5可以看出，bmscs在ti@dopa-rgd及ti@dopa-rgd-nag复合涂层的表面有很好的铺展，并覆盖了涂层。
48.因此可知，与纯ti组相比，ti@dopa-rgd及ti@dopa-rgd-nag复合涂层的细胞兼容性更好，更有利于bmscs的粘附和增殖。
49.细胞活性：在24孔板中加入比例为10%的cck-8混合培养基，恒温箱避光孵育2h。孵育完毕后自24孔板内每孔吸取100μl细胞悬液转移至96孔板中。酶标仪测定吸光度值(波长：450nm)，通过吸光度值对细胞活性及增殖情况进行判断，cck-8细胞活性结果如图6所示。
50.图6可以看出，在1d时纯ti组表面的细胞量显著大于control组和ti@dopa-rgd-ag组(p《0.01)；ti@dopa-rgd组表面的细胞量显著大于control组和ti@dopa-rgd-ag组(p《0.05)，纯ti组和ti@dopa-rgd组之间无统计学差异(p》0.05)；当到了3d时，ti@dopa-rgd-ag组表面细胞量显著大于纯ti组(p《0.01)；ti@dopa-rgd组表面细胞量也显著大于纯ti组(p《0.01)。
51.因此可知，ti@dopa-rgd涂层优越的促进细胞增殖能力的效应，且经dopa-rgd功能基团螯合之后ag
+
的低细胞毒性，且在适宜浓度范围内复合涂层中释放出的ag
+
有利于bmscs细胞生长。
52.染色：将bmscs于不同涂层钛片表面进行共培养，分别于1、3、5、7天后，用pbs清洗3次；4%多聚甲醛固定细胞15min，pbs漂洗2次，每次5min；加入dapi溶液(1:300)，室温避光孵育10min；pbs洗3次，每次5min；后用正置荧光显微镜拍照，结果如图8所示。
53.图7可以看出，bmscs细胞在三组材料表面培养1、3、5、7d后细胞核dapi染色所示，与cck-8所示趋势基本一致，相较于ti上的细胞增殖情况，ti@dopa-rgd及ti@dopa-rgd-nag在各时间段均保持优异的促细胞增殖能力，在3d与5d时尤为突出。
54.三、整合素靶向纳米银螯合肽改性螺钉在外固定架系统中的防松动研究（一）材料及试剂(1)雄性sd大鼠(新疆医科大学实验动物中心)(2)简易外固定系统(新疆大学工程技术学院重点实验室)(3)舒泰50(virbac，法国)(4)4%多聚甲醛(北京白鲨易)(5)von-kossa染液(武汉塞维尔)(6)中性树脂(国药集团)(7)磷酸缓冲盐溶液(thermo，美国)(8)二甲苯(国药集团)(9)95%的乙醇(山东卓健医疗科技有限公司)(10)75%乙醇(山东卓健医疗科技有限公司)(11)无水乙醇(国药集团)(12)von-kossa染液(武汉塞维尔)(13)分化液(武汉塞维尔)(14)返蓝液(武汉塞维尔)(15)乙二醇乙醚乙酸酯(上海麦克林生化科技有限公司)（二）仪器(1)外科手术器械(上海金钟)(2)x射线机(柯达dr7500，美国)(3)microct机(brukerskyscan1176，德国)
(4)硬组织切片机(leicahistocoreautocut，德国)(5)微型摆锯(苏州保力康)(6)微机控制全数字化电子万能性物材料试验机(深圳市瑞格尔仪器有限公司)(7)脱水机(武汉俊杰电子有限公司)(8)包埋机(武汉俊杰电子有限公司)(9)病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)(10)冻台(武汉俊杰电子有限公司)(11)组织摊片机(金华科迪仪器设备有限公司)(12)烤箱(天津市莱玻瑞仪器设备有限公司)(13)正置光学显微镜(尼康，日本)(14)成像系统(尼康，日本)（三）动物分组及大鼠外固定架螺钉效能验证模型建立健康成年sd大鼠45只，雄性，体质量400g至450g，清洁级，由新疆医科大学动物实验中心提供，动物许可证号:syxk(新)2013-0001。均单笼饲养，室温18℃至20℃，湿度50%至60%，通风良好，自由摄食进水，并按照实验动物的3r原则给予人道关怀。本研究严格遵循中国及新疆医科大学动物医学伦理学标准进行(伦理审批号:lacuc-20170222054)。ti组(对照组)(15只)；ti@dopa-rgd组(15只)；ti@dopa-rgd-nag(15只)。
55.术前禁食水6h至8h，按50mg/kg腹腔注射舒泰50进行麻醉，大鼠右后肢剃毛备皮，取左侧卧位，右后肢碘伏、酒精反复消毒。于大鼠右后肢股骨上方取一约30mm纵形切口。切开皮肤后，可见一白线，为肌间隔标志，钝性分离股外侧肌和股后肌，直至骨面，在尽量保持微创的情况下尽量完整显露股骨。期间用拉钩牵拉周围软组织，对周围神经、血管、肌肉等予以保护。于简易外固定器上装配4枚20ml注射器的注射头作为套筒，滑块间距为5mm，由近端向远端依次钻入4枚钛克氏螺钉。钻孔完毕，牵开周围软组织，同时应尽可能不破坏骨膜，于两滑块及两组螺钉间等分点，摆锯截骨，截骨时对截骨区持续冲洗，避免产生热损伤。通过旋转末端螺母调节滑动块将股骨向两端牵引，可见骨段完全截断。反向调节螺母闭合加压骨折断端，构建的大鼠股骨外固定架螺钉效能验证模型造模成功。依次用双氧水、碘伏、生理盐水冲洗，闭合创面，纱布覆盖并缝扎，防止大鼠噬咬脱落，造模完成。
56.（四）术后护理术后将大鼠置于保温毯上，复苏后禁食禁水6h，随及正常饮食。术后连续3d予以抗生素预防感染、止疼药止痛。术后每2d采用碘伏棉球对创面进行消毒、针道护理，更换无菌纱布，直至创面愈合。
57.（五）大鼠股骨标本取材及处理在术后6周骨折愈合后，通过腹腔注射过量的戊巴比妥钠将实验动物诱导安乐死，采集大鼠右侧股骨带螺钉标本。小心将外固定架与克氏针分离，尽量减小牵拉、挫伤与挤压等机械损伤，新鲜标本小心剔除骨表面软组织后，冰袋储存并根据随机抽样法随机抽取6枚股骨带螺钉标本于当天行生物力学检测。
58.（六）生物力学测定螺钉拔出力是判断实验外固定螺钉稳定性最显著的标志，大鼠股骨外固定螺钉的拔出峰值力如图8所示。
59.图8可以看出，外固定大鼠股骨骨折模型中ti@dopa-rgd组和ti@dopa-rgd-nag组的平均拔出力显著高于ti(p《0.05)，在2和4周后ti@dopa-rgd-nag组显著高于ti组(p《0.05)，ti@dopa-rgd组和ti@dopa-rgd-nag组之间无显著差异(p》0.05)。在第6周，ti@dopa-rgd组和ti@dopa-rgd-nag组均显著高于ti组(p《0.05)，ti@dopa-rgd组和ti@dopa-rgd-nag组之间无显著差异(p》0.05)。
60.因此可知，ti@dopa-rgd-nag钉稳定性最佳。
61.（七）组织学染色图像螺钉植入6周后钉道微环境组织学分析，组织学图像显示如图9所示，其中，a: ti，b: ti@dopa-rgd，c: ti@dopa
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rgd-nag。
62.图9可以看出，在ti@dopa-rgd和ti@dopa-rgd-nag上的螺纹之间可以发现广泛的黑色钙盐沉积，其中，钉道的组织学外观，钉道黑色为新生钙盐沉积，呈现为围绕螺钉周围形成的新骨。
63.硬组织染色显示了三个组中螺钉周围新生钙盐沉积的不同情况，vonkossa硬组织染色沉积参数百分比的直方图如图10所示。其中，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
64.图10可以看出，相较于ti钉，ti@dopa-rgd钉周围钙盐沉积量更多，具有统计学差异(p《0.01)；ti@dopa-rgd-nag钉周围钙盐沉积量显著高于ti@dopa-rgd钉(p《0.05)。这显示了ti@dopa-rgd-nag螺钉表面有更多的新结合骨形成。
65.因此可知，ti@dopa-rgd-nag螺钉与ti@dopa-rgd螺钉比ti螺钉更好整合到骨质中，拥有更优的稳定性，其中，本发明整合素纳米银螯合肽复合涂层螺钉稳定性最佳。
66.综上所述，本发明整合素纳米银螯合肽复合涂层通过对医用螺钉进行改性，可在骨损伤时作为骨外固定支架，不仅具有强效抗菌性，还可促进钉道周围骨整合和有效预防医用螺钉松动。
67.以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

技术特征：
1.一种整合素纳米银螯合肽复合涂层，其特征在于其材料的化学结构式为：。2.根据权利要求1所述的整合素纳米银螯合肽复合涂层，其特征在于按照下述制备方法得到：第一步，将钛片或/和钛钉经蒸馏水清洗后，在无水乙醇中浸泡，然后用氧等离子体处理；第二步，将处理后的钛片或/和钛钉浸入含(dopa)
4-g
5-grgds的pbs溶液中进行第一层涂层；第三步，将第一层涂层后的钛片或/和钛钉浸入医用酒精中消毒，并洗去未附着的(dopa)
4-g
5-grgds，进行干燥；第四步，将干燥的钛片或/和钛钉浸泡在agno3溶液中静置后进行第二层涂层，用医用酒精浸泡消毒并晾干，在钛片或/和钛钉表面得到整合素纳米银螯合肽复合涂层。3.根据权利要求2所述的整合素纳米银螯合肽复合涂层，其特征在于第一步中，无水乙醇中的浸泡时间为2h，氧等离子体处理的时间为60秒。4.根据权利要求2或3所述的整合素纳米银螯合肽复合涂层，其特征在于第二步中，含(dopa)
4-g
5-grgds的pbs溶液为每1毫升pbs溶液中含10μg(dopa)
4-g
5-grgds，第一层涂层的时间为2h。5.根据权利要求2或3所述的整合素纳米银螯合肽复合涂层，其特征在于第三步中，消毒温度为25℃，消毒时间为1h，医用酒精体积分数为75%。6.根据权利要求4所述的整合素纳米银螯合肽复合涂层，其特征在于第三步中，消毒温度为25℃，消毒时间为1h，医用酒精体积分数为75%。7.根据权利要求2或3或4或5或6所述的整合素纳米银螯合肽复合涂层，其特征在于第四步中，第二层涂层时间为10min，agno3溶液的浓度为2μg/ml，消毒时间为10min，医用酒精体积分数为75%。8.一种根据权利要求1或3或4或5或6或7所述的整合素纳米银螯合肽复合涂层的制备方法，其特征在于按照下述方法进行：第一步，将钛片或/和钛钉经蒸馏水清洗后，在无水乙醇中浸泡，然后用氧等离子体处理；第二步，将处理后的钛片或/和钛钉浸入含(dopa)
4-g
5-grgds的pbs溶液中进行第一层涂层；第三步，将第一层涂层后的钛片或/和钛钉浸入医用酒精中消毒，并洗去未附着的(dopa)
4-g
5-grgds，进行干燥；第四步，将干燥的钛片或/和钛钉浸泡在agno3溶液中静置后进行第二层涂层，用医用酒精浸泡消毒并晾干，在钛片或/和钛
钉表面得到整合素纳米银螯合肽复合涂层。9.一种根据权利要求1至7中任意一项所述的整合素纳米银螯合肽复合涂层在作为治疗骨损伤时抑制外固定架钉道周围感染的医疗器械中的应用。10.一种根据权利要求1至7中任意一项所述的整合素纳米银螯合肽复合涂层在作为治疗骨损伤时防止医用螺钉松动的医疗器械中的应用。

技术总结
本发明涉及骨外固定螺钉涂层材料技术领域，是一种整合素纳米银螯合肽复合涂层及其制备方法和应用，将钛片或/和钛钉经蒸馏水清洗后，在无水乙醇中浸泡，然后用氧等离子体处理，将其浸入含(DOPA)


技术研发人员：马创 贾麒钰 程新春 孙学斌 郭晓斌 任鹏 阿不来提 阿力木江 罗雪峰 麻俊超
受保护的技术使用者：新疆医科大学第一附属医院
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/23