一种一步式蛋白体外泛素化反应盒

1.本发明属生物化学与分子生物学领域，涉及蛋白功能的检测，具体涉及一种一步式蛋白体外泛素化反应盒，应用于人源蛋白体外泛素化修饰。


背景技术：

2.蛋白质的修饰有多种类型，除了常见的无机和有机小分子修饰，如磷酸化、糖基化、脂酰化等，还有一类用小肽进行修饰的，例如泛素化（ubiquitination），类泛素化nedd化（neddylation）、苏木化（sumoylation）等。泛素化修饰是细胞内重要的蛋白翻译后修饰之一，可以直接影响蛋白质的降解、活性和定位，调控包括细胞周期、细胞凋亡、转录调控、dna损伤修复以及免疫应答等在内的多种细胞活动。其功能异常可诱发神经退行性疾病，癌症，免疫紊乱以及细菌、病毒感染等人类疾病。因此研究蛋白质的泛素化具有重要的意义，而鉴定e3泛素连接酶对底物蛋白的泛素化修饰能力是泛素相关研究中最重要的内容之一。


技术实现要素：

3.本发明提供一种一步式蛋白体外泛素化反应盒，应用于体外人源蛋白泛素化能力或被泛素化能力的验证。
4.本发明中所涉及的一种一步式蛋白体外泛素化反应盒，其包括，泛素化e1酶pet-21a-ube1，e2酶pgex-5x-1-ubch5c和泛素分子pet-21a-ha-ubiquitin混合蛋白，泛素化e3，缓冲液a，缓冲液b，底物蛋白，反应管和可移动加热制冷板。
5.本发明中所涉及的混合蛋白配方为：30 ng/μl泛素化e1酶pet-21a-ube1、30 ng/μle2酶pgex-5x-1-ubch5c、100 ng/μl泛素分子pet-21a-ha-ubiquitin；单次反应所用混合蛋白体积为10μl；200 ng/μl泛素化e3酶pet-21a-flag-smurf1单次反应所用体积为7 μl，也可替换为所需的其他等量泛素化e3酶；200 ng/μl底物蛋白pgex-5x-1-pten单次反应所用体积为7 μl，也可替换为所需的其他等量底物蛋白。
6.本发明的实施例中，公开了泛素化e1酶pet-21a-ube1、e2酶pgex-5x-1-ubch5c、泛素分子pet-21a-ha-ubiquitin和e3酶为pet-21a-flag-smurf1的氨基酸序列，如seqid no:1
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seqid no:4所示的氨基酸序列；所述的氨基酸序列，还包括seqid no:1
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seqid no:4的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列。
7.本发明中所涉及的泛素化e1酶pet-21a-ube1、e2酶pgex-5x-1-ubch5c、泛素分子pet-21a-ha-ubiquitin、e3酶为pet-21a-flag-smurf1、底物蛋白为pgex-5x-1-pten使用大肠杆菌原核表达并纯化。
8.本发明中所涉及的缓冲液a配方为500 mm tris-hcl（ph 7.5）、50 mm mgcl2、20 mm naf、100 nm okadaic acid、6 mm dtt（超纯水溶解），单次反应所用体积为3μl。
9.本发明中所涉及的缓冲液b配方为20 mm atp（超纯水溶解），单次反应所用体积为3μl。
10.本发明中所涉及的可移动加热制冷板包括金属导热板、半导体加热制冷片、温度
传感器、控制板、电源、基座。其特征在于，控制板、电源位于基座内；金属导热板置于基座上；半导体加热制冷片、温度传感器嵌于金属导热板内；金属导热板设置放置腔，用于放置反应管；控制板上设置开关、4℃、30℃三个按钮；控制板内预设两种温度：用于融化冷冻液体防止其失效的4℃和进行体外泛素化反应的30℃。
11.本发明中所涉及的体外泛素化反应时间为3 h。
12.泛素化e1酶pet-21a-ube1、e2酶pgex-5x-1-ubch5c、泛素分子pet-21a-ha-ubiquitin、e3酶pet-21a-flag-smurf1、底物蛋白pgex-5x-1-pten使用大肠杆菌原核表达并纯化。
13.本发明提供了一种一步式蛋白体外泛素化反应盒，其包括泛素化修饰系统的e1，e2，e3与泛素分子的核苷酸序列，蛋白体系配方，反应缓冲液配方和可移动加热制冷板。本发明中泛素化e1酶、e2酶、e3酶、泛素分子和底物，在所述反应缓冲液、时间、温度和蛋白浓度配比下，可以高效地进行体外泛素化修饰反应。所述试剂盒可以方便、准确地鉴定底物蛋白是否具有泛素化修饰，能被广范围应用于泛素化验证实验。
附图说明
14.为便于理解，以下将通过具体的附图和具体实施方式对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实施方式和附图仅是为了说明，显示本领域的技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
15.图1示出一种一步式蛋白体外泛素化反应盒操作过程。
16.图2示出可移动加热制冷板的结构示意图附图说明：其他底物蛋白 1，其他e3泛素连接酶 2，底物蛋白pgex-5x-1-pten 3，e3酶pet-21a-flag-smurf1 4，可移动加热制冷板 5，泛素化e1酶pet-21a-ube1，e2酶pgex-5x-1-ubch5c和泛素分子pet-21a-ha-ubiquitin混合蛋白 6，缓冲液a 7，缓冲液b 8，反应管a 9，反应管b 10，金属导热板11，温度传感器12，基座13，控制板14，电源15，半导体加热制冷片16，放置腔17。
实施方式
17.下面结合附图对本发明进行进一步描述。
实施例
18.如图1所示，一种一步式蛋白体外泛素化反应盒包括，泛素化e1酶pet-21a-ube1，e2酶pgex-5x-1-ubch5c和泛素分子pet-21a-ha-ubiquitin混合蛋白 6，泛素化e3酶pet-21a-flag-smurf1 4，其他e3泛素连接酶 2，底物蛋白pgex-5x-1-pten 3，其他底物蛋白 1，缓冲液a 7，缓冲液b 8，反应管a 9，反应管b 10和可移动加热制冷板 5。
19.图1所示一种一步式蛋白体外泛素化反应盒的具体使用步骤包括：（1）打开可移动加热制冷板 5，将温度设为4 ℃；（2）将所需蛋白及缓冲液放置于可移动加热制冷板 5上融化；该融化过程亦可在4℃冰箱或冰盒中进行。
20.（3）使用时吸取10μl混合蛋白 6，7μl泛素化e3酶pet-21a-flag-smurf1 4，7μl底物蛋白pgex-5x-1-pten 3，3μl缓冲液a 7，3μl缓冲液b 8于反应管a 9中，作为阳性对照。混匀后将反应管a 9置于可移动加热制冷板 5上。
21.（3）使用时吸取单次所需的10μl混合蛋白 6，1400 ng其他e3泛素连接酶 2，1400 ng其他底物蛋白 1（总体积应为30μl，不足部分用预冷的pbs补足）于反应管b 10中，混匀后将反应管b 10置于可移动加热制冷板 5上，并将剩余液体回收储存。
22.（4）将可移动加热制冷板 5温度调整为30℃，进行泛素化反应3 h。该泛素化反应亦可在水浴锅或金属浴进行。
23.（5）加入蛋白上样缓冲液终止反应，经煮样（98℃，10 min）之后进行sds-page考马斯亮蓝染色或是western blot检测。
实施例
24.图2所示可移动加热制冷板 5包括金属导热板 11、半导体加热制冷片 16、温度传感器12、控制板 14、电源 15、基座13。控制板14位于基座13内；金属导热板11置于基座13上；半导体加热制冷片16、温度传感器12嵌于金属导热板11内；金属导热板 11设置放置腔17，用于放置反应管、蛋白与缓冲液；控制板 13上设置开关（左）、4℃（中）、30℃（右）三个按钮；控制板13内预设两种温度：用于融化冷冻液体防止其失效的4℃和进行体外泛素化反应的30℃。

技术特征：
1.一种一步式蛋白体外泛素化反应盒，其特征在于，其包括，泛素化e1酶pet-21a-ube1、e2酶pgex-5x-1-ubch5c和泛素分子pet-21a-ha-ubiquitin混合蛋白，泛素化e3酶，缓冲液a，缓冲液b，底物蛋白，反应管和可移动加热制冷板。2.根据权利要求1所述的一种一步式蛋白体外泛素化反应盒，其特征在于，混合蛋白配方为：30ng/μl泛素化e1酶pet-21a-ube1、30ng/μle2酶pgex-5x-1-ubch5c、100ng/μl泛素分子pet-21a-ha-ubiquitin；单次反应所用混合蛋白体积为10μl。3.根据权利要求1所述的一种一步式蛋白体外泛素化反应盒，其特征在于，所述泛素化e1酶pet-21a-ube1的氨基酸序列，如seq id no:1所示的氨基酸序列；还包括含seq id no:1的氨基酸序列的多肽、或其它人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的一种一步式蛋白体外泛素化反应盒，其特征在于，所述泛素化e2酶pgex-5x-1-ubch5c的氨基酸序列，如seq id no:2所示的氨基酸序列；还包括含seq id no:2的氨基酸序列的多肽、或其它人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列。5.根据权利要求1所述的一种一步式蛋白体外泛素化反应盒，其特征在于，所述泛素分子pet-21a-ha-ubiquitin的氨基酸序列，如seq id no:3所示的氨基酸序列；还包括含seq id no:3的氨基酸序列的多肽、或其它人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列。6.根据权利要求1所述的一种一步式蛋白体外泛素化反应盒，其特征在于，所述泛素化e3酶为pet-21a-flag-smurf1，浓度为200ng/μl，单次反应所用体积为7μl；底物蛋白为pgex-5x-1-pten，浓度为200ng/μl，单次反应所用体积为7μl。7.根据权利要求6所述的一种一步式蛋白体外泛素化反应盒，其特征在于，所述泛素化e3酶pet-21a-flag-smurf1的氨基酸序列，如seq id no:3所示的氨基酸序列；还包括含seq id no:3的氨基酸序列的多肽、或其它人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列。8.根据权利要求1所述的一种一步式蛋白体外泛素化反应盒，其特征在于，所述缓冲液a配方为500mm tris-hclph 7.5、50mm mgcl2、20mm naf、100nm okadaic acid、6mm dtt超纯水溶解，单次反应所用体积为3μl。9.根据权利要求1所述的一种一步式蛋白体外泛素化反应盒，其特征在于，所述缓冲液b配方为20mm atp超纯水溶解，单次反应所用体积为3μl。10.根据权利要求1所述的一种一步式蛋白体外泛素化反应盒，其特征在于，所述可移动加热制冷板包括金属导热板、半导体加热制冷片、温度传感器、控制板、电源、基座；控制板、电源位于基座内；金属导热板置于基座上；半导体加热制冷片、温度传感器嵌于金属导热板内；金属导热板设置放置腔，用于放置反应管；控制板上设置开关、4℃、30℃三个按钮；控制板内预设两种温度：用于融化冷冻液体防止其失效的4℃和进行体外泛素化反应的30℃。

技术总结
本发明提供一种一步式蛋白体外泛素化反应盒，应用于人源蛋白体外泛素化修饰验证的一步式蛋白体外泛素化反应盒。本发明包括泛素化E1酶PET-21a-Ube1，E2酶PGEX-5X-1-UbcH5c和泛素分子PET-21a-HA-Ubiquitin混合蛋白，泛素化E3，缓冲液A，缓冲液B，底物蛋白，反应管和可移动加热制冷板。在本发明所包含的缓冲液、时间、温度和蛋白浓度配比下，可以验证泛素化E3酶的体外泛素化能力。该反应盒可以方便、准确、高效地鉴定泛素E3连接酶是否具有泛素化底物蛋白的能力，能被广范围应用于泛素化验证实验。能被广范围应用于泛素化验证实验。能被广范围应用于泛素化验证实验。


技术研发人员：董磊 夏琴 李杨
受保护的技术使用者：北京理工大学
技术研发日：2023.01.04
技术公布日：2023/8/23