miR-299-3p在制备防治肿瘤药物中的应用

mir-299-3p在制备防治肿瘤药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及mir-299-3p在制备防治肿瘤药物中的应用。


背景技术：

2.乳腺癌(breast cancer,brca)是女性致死率最高的恶性肿瘤之一(ca cancer j clin 2018,68(6):394-424)。过去的几十年里，随着乳腺癌的早期诊断技术以及包括手术、放化疗在内的治疗技术的不断改进，其临床治疗的疗效取得了明显改善，但其复发、转移和获得性耐药仍然很常见。此外，这些治疗方式引起的多种不良副作用会导致继发性病理，并降低患者的生活质量。因此，亟待寻找新的治疗靶点或药物来治疗乳腺癌患
3.cd47又名整合素相关蛋白(integrin-related protein,iap)，是一种细胞表面跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员。cd47作为天然免疫检查点高表达于肿瘤细胞表面，是肿瘤免疫治疗中最有希望的研究靶点之一(immunol rev 2017,276(1):145-164；cancer sci 2018,109(8):2349-2357)。cd47能够与巨噬细胞或树突状细胞上的信号调节蛋白α(sirpα)相互作用，引起sirpα的胞质尾部区itim的酪氨酸磷酸化(immunol rev 2017,276(1):145-164；annu rev immunol2014,32:25-50)。随后，募集的蛋白酪氨酸磷酸酶-1/2(shp1/2)的src同源区2(src-homology domain 2,sh2)与sirpα的磷酸化位点结合，阻止磷酸化信号向下游传递，并抑制巨噬细胞突触肌球蛋白的积累，这将导致巨噬细胞的细胞骨架维持在相对平稳的状态，而无法发挥吞噬功能。虽有研究表明靶向cd47的抗体能够阻断cd47-sirpα的相互作用并在实体瘤和血液系统肿瘤的治疗中表现出显著疗效，但抗体较大的分子量和较强的免疫原性将导致有限的组织穿透性，患者易于获得抗药性和严重的副作用(cell 2009,138(2):286-299；j clin invest 2016,126(7):2610-2620)。因此，靶向cd47-sirpα信号系统的癌症治疗方法有待改进。
4.atp结合盒转运子e1(abce1)，又称为rnase l抑制剂，是atp结合盒转运蛋白超家族的成员之一，其功能是阻断核糖核酸酶l的活性，从而通过参与2-5a/rnase l信号通路激活蛋白质合成(j biol chem 1995,270(22):13308-13317；j biol chem 2007,282(19):14598-14607)，并调节多种生物功能，如病毒感染、肿瘤细胞增殖和抗凋亡(iubmb life 2012,64(10):795-800；tumor biol 2016,37(6):8375-8382)。大量文献表明abce1与多种癌症发展进程密切相关，包括结肠癌(oncol rep 2005,13(5):907-913)、神经母细胞瘤(cancer res 2020,80(17):3706-3718)和白血病(int j mol med 2020,46(4):1289-1300)。
5.微小rna(mirna)是长度为20～22个核苷酸的小型非编码rna，通过与靶mrna 3
′‑
utr完全配对或不完全配对，降解靶mrna或阻遏其转录后翻译(cell 2005,122(1):6-7)。mirnas来源于初级转录产物(pri-mirnas)，pri-mirnas在细胞核中经drosha酶修饰产生约70nt茎环结构的前体(pre-mirnas)。转运至胞质的pre-mirnas经dicer核糖核酸酶进一步加工生成22nt-5p和-3p成熟的mirnas(genes dev 2003,17(24):3011-3016；science 2004,303(5654):95-98)。
6.有研究表明，mirnas通过调控肿瘤细胞的多种生命活动，如增殖、迁移、细胞死亡和应激抵抗,在肿瘤发生、发展和预后中起着关键作用(nat commun2018,9(1):1845；nat rev cancer 2006,6(11):857-866)。此外，越来越多的研究发现，mirna在免疫调节中发挥重要作用(nat commun 2014,5:5241)，如mir-708(mol cancer 2018,17(1):12)和mir-340(j immunother cancer 2020,8(1):e000253)被报道通过负调控cd47可以促进巨噬细胞的吞噬作用。然而，mirna分子量小，在血液中的半衰期短，合成成本高等缺点一直阻碍mirna成药的发展。


技术实现要素：

7.发明目的：本发明的目的在于提供一种抑制cd47/abce1靶基因表达的mir-299-3p在制备防治肿瘤药物中的应用。
8.技术方案：本发明提供了mir-299-3p在制备防治肿瘤药物中的应用，所述mir-299-3p的序列为包含下述seq id no:1所示的核苷酸序列的核酸及变体或者其化学衍生物和生物活性功能片段：5
′‑
uaugugggaugguaaaccgcuu-3
′
。
9.优选的，所述mir-299-3p的前体在制备防治肿瘤药物中的应用，所述mir-299-3p的前体的序列seq id no:5为：5
′‑
aagaaaugguuuaccgucccacauacauuuugaauauguaugugggaugguaaaccgcuucuu-3
′
。
10.优选的，所述mir-299-3p序列，可由经化学合成方法制备，也可将其序列(seq id no:1)或其前体序列(seq id no:5)克隆到病毒或质粒表达载体进行表达，所述的mir-299-3p可与人cd47、abce1的mrna的3
′‑
utr(3
′
端非翻译区)结合从而抑制人cd47、abce1基因转录后翻译的表达，显著下调人cd47、abce1的蛋白表达水平。
11.优选的，所述mir-299-3p对序列中的磷酸二酯键、碱基或2
′‑
oh进行修饰。
12.优选的，所述修饰为：采用硫取代磷酸二酯键中的氧、对3
′
或5
′
进行生物素及荧光基团修饰、胆固醇修饰、甲氧修饰、硫代修饰、氨基修饰、或对所述核苷酸序列中的核糖的2
′‑
oh进行脱氧修饰、氟取代或者甲氧基取代。
13.优选的，所述修饰具体为：对所述核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰，如采用硫取代磷酸二酯键中的氧；或对所述核苷酸序列中的碱基的修饰，如对3
′
或5
′
的特殊修饰，包括生物素、荧光基团及其它特殊标记；胆固醇修饰、甲氧修饰、硫代修饰、氨基修饰；或对所述核苷酸序列中的核糖的2
′‑
oh的修饰，如脱氧修饰、氟取代或者甲氧基取代)。
14.优选的，所述肿瘤为乳腺肿瘤，所述防治肿瘤药物靶向cd47和abce1促进巨噬细胞吞噬作用，抑制乳腺癌细胞增殖、迁移并诱导细胞周期阻滞。
15.优选的，所述rna mir-299-3p或mir-299-3p前体的重组载体或病毒颗粒在制备抑制肿瘤生长、繁殖或迁移的药物中的应用。
16.优选的，所述rna mir-299-3p或mir-299-3p前体的重组载体或病毒颗粒在制备增强巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的药物中的应用。
17.优选的，所述rna mir-299-3p或mir-299-3p前体的重组载体或病毒颗粒在制备阻滞肿瘤细胞生长周期的药物中的应用。
18.发明原理：乳腺癌细胞中cd47和abce1的异常高水平表达不仅使得肿瘤细胞生长异常活跃，并且巨噬细胞通过cd47/sirpα信号通路将肿瘤细胞识别为机体正常细胞而不发
挥吞噬作用，进一步加速了乳腺肿瘤的恶化。本发明通过不同的生信工具及实验证明mir-299-3p可以作用于cd47和abce1 mrna的3'-utr，抑制cd47和abce1的表达。为了模拟内源性成熟体mir-299-3p序列且增加其稳定性，我们合成双链小rna分子，包括一条与mir-299-3p成熟体序列一致的序列，以及一条与mirna成熟体序列互补的序列并进行相应的修饰；或者合成mir-299前体的dna序列。利用脂质体法转入细胞，证明mir-299-3p能有效抑制乳腺癌细胞cd47、abce1蛋白的表达，进而促进巨噬细胞对乳腺肿瘤细胞的吞噬，抑制肿瘤细胞恶性增殖迁移并诱导细胞周期阻滞。
19.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：mir-299-3p有效抑制乳腺癌细胞cd47、abce1蛋白的表达，促进巨噬细胞对乳腺肿瘤细胞的吞噬，抑制肿瘤细胞恶性增殖迁移并诱导细胞周期阻滞，可高效应用于预防和治疗乳腺肿瘤以及与高表达人cd47、abce1蛋白相关的其他疾病。
附图说明
20.图1为人cd47在不同癌症中的表达及靶向cd47的mirnas的生物信息学预测，其中，图1a为肿瘤和相对正常组织中cd47的表达，条形高度：肿瘤或正常组织的cd47 mrna表达的中位数，与正常乳腺组织(n＝291)相比，cd47在乳腺癌组织中(n＝1085)的表达升高；图1b为分别采用单因素方差分析(one-way anova)和非配对student's t检验(unpaired student's t test)分析5个亚型和2个亚型间的cd47表达水平差异；图1c为通过线上软件(targetscan，diana-microt和starbase v2.0)预测靶向cd47的假定mirnas；注：*p《0.05，***p《0.001，****p《0.0001；(n＝3，means
±
sems)；
21.图2为双荧光素酶报告基因实验检测mir-299-3p和cd47 3'-utr互作，其中，图2a为人cd47 mrna的3'-utr中mir-299-3p三个假定结合位点示意图，图2b为mir-299-3p和人cd47 3'-utr互作的靶位点序列及overlap定点突变靶位点序列示意图，突变位点以红色突出显示；图2c-d为mda-mb-231细胞接种于24孔板培养至60％-70％后，将含有野生或突变型人cd47 3'-utr的荧光素酶报告质粒(600ng)与75nm对照模拟物(cm)或75nm mir-299-3p共转染细胞24小时，使用dual-lumi
tm
荧光素酶报告基因检测试剂盒检测相对荧光素酶活性，注：**p《0.01，***p《0.001；(n＝3，means
±
sems)；
22.图3为mir-299-3p抑制乳腺癌细胞cd47的mrna水平和蛋白水平，其中，图3a为starbase分析mir-299-3p在正常乳腺组织(n＝104)和乳腺癌组织(n＝1085)中的表达；图3b为对来源于metabric数据库的1262例乳腺癌患者中的mir-299-3p高表达组和低表达组乳腺癌患者进行kaplan-meier生存分析(p＝0.0015)；图3c为75nm control mimic(cm)和75nm mir-299-3p或50nm control inhibitor(ci)和50nm anti-mir-299-3p转染mda-mb-231细胞48h后，qrt-pcr分析mda-mb-231细胞中cd47的rna水平；图3d-e为不同浓度的cm和mir-299-3p或ci和anti-mir-299-3p转染细胞48h后，western blot分析mda-mb-231细胞中cd47蛋白水平；注：*p《0.05，**p《0.01，****p《0.0001；(n＝3，means
±
sems)；
23.图4为mir-299-3p促进了巨噬细胞对乳腺癌细胞的吞噬作用，其中，图4a为0-200nm pma处理3天后，western blot检测thp-1细胞中cd11b和cd86蛋白水平；图4b为转染mir-299-3p模拟物上调mir-299-3p后，通过流式细胞术分析thp-1来源的巨噬细胞对mda-mb-231细胞的吞噬作用；图4c为转染mir-299-3p抑制剂下调mir-299-3p后，通过流式细胞
a，luminal b，her2-enriched，basal-like)之间具有显著相关性(图1b)。
33.鉴于人cd47异常高表达在肿瘤发生发展中的重要生物学功能，预测负调控乳腺癌细胞中cd47表达水平的mirna，探究其对肿瘤的抑制作用。采用targetscan，diana-microt及starbase v2.0等在线软件，筛选靶向人cd47 mrna(refseq id:nm_001777)3
′‑
utr的mirnas，结果显示靶向人cd47 3
′‑
utr分值较高的mirnas：258mirnas来源于targetscan(context++score≥90)，79mirnas来源于diana-microt(mitg≥0.95)，84mirnas来源于starbase v2.0。如韦恩图展示，三种软件预测的mirnas有5个共有的mirnas(mir-200a-3p、mir-141-3p、mir-299-3p、mir-330-5p和mir-133b)(图1c)。已有证据表明mir-200a-3p和mir-141-3p负调控人cd47的表达。在此基础上，通过targetscan 7.2预估mirnas(mir-299-3p、mir-330-5p和mir-133b)与cd47mrna的假定结合位点并通过双荧光素酶报告基因实验进行细胞内靶向性分析。结果显示，targetscan 7.2预测出每个mirna(mir-299-3p、mir-330-5p和mir-133b)至少具有两个假定结合位点，且mir-299-3p有三个假定结合位点(图2a)；进一步，双荧光素酶报告基因实验进行体外乳腺癌细胞水平上的靶向性验证，发现人cd47 3
′‑
utr存在mir-299-3p的两个直接作用靶位点：site2和site3(图2c)，并采用overlap定点突变进行反向验证，发现靶位点突变后，mir-299-3p对荧光素酶活性无调控作用(图2d)。该mir-299-3p序列为：5
′‑
uaugugggaugguaaaccgcuu-3
′
(seq id no:1)。
34.由上海吉玛制药技术有限公司(genepharma)提供以下化学合成的mirna模拟物、抑制剂及其相对应无效对照物：
35.(1)mir-299-3p mimics(mir-299-3p)，序列为：5
′‑
uaugugggaugguaaaccgcuu-3
′
(seq id no:1)；
36.(2)mirna mimics阴性对照(cm)，序列为：5
′‑
uucuccgaacgugucacgutt-3
′
(seq id no:2)；
37.(3)mir-299-3p inhibitor(anti-mir-299-3p)，序列为：5
′‑
aagcgguuuaccaucccacaua-3
′
(seq id no:3)；
38.(4)mirna inhibitor阴性对照(control inhibitor，ci)，序列为：5
′‑
caguacuuuuguguaguacaa-3
′
(seq id no:4)。
39.具体操作如下：
40.材料：
41.细胞和质粒来源：所用mda-mb-231购自中国科学院细胞库，双荧光素酶表达载体pmirglo为美国promega公司产品。
42.主要试剂：opti-mem(cat
#
31985070)培养基、dmem(cat
#
2200905)培养基购于thermo(waltham，ma，usa)；lipofectamine 3000
tm
(cat
#
l3000015)转染试剂购于invitrogen(california，carlsbad，usa)；胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)(cat
#
f2442)购于milliporesigma(burlington，ma，usa)；pfu高保真dna聚合酶(cat
#
d7217)、双荧光素酶报告基因实验试剂盒(dual-lumi
tm
luciferase reporter gene assay kit)(cat
#
rg088s)购于中国上海碧云天(beyotime)；xbai(cat
#
1093s)和xhoi(cat
#
1094s)购于takara(dalian，china)。
43.主要仪器：pcr仪，eppendorf公司产品；化学发光微孔板读数仪(luminoskan ascent)，美国thermo产品。
44.方法：
45.细胞培养：mda-mb-231细胞培养于含10％ fbs的dmem培养基，于37℃、5％co2培养箱培养。
46.细胞转染：将4
×
104个处于对数生长期的mda-mb-231细胞接种于24孔板中，于37℃、5％ co2培养箱中培养，待汇合率达60-70％。按照说明书指示，使用opti-mem培养基分别稀释lipofectamine 3000及转染物，轻轻混匀，室温孵育5min；将稀释的lipofectamine 3000及转染物轻轻混合，再室温孵育15-20min以形成转染复合物。将转染复合物逐渐滴入待转染细胞中，培养4h后将无血清培养基换成完全培养基继续培养。
47.mir-299-3p与人cd47 3
′‑
utr靶位点直接作用的实验确证
48.(1)pmirglo-cd47 3
′‑
utr重组质粒的构建
49.targetscan预测发现人cd47 3
′‑
utr片段有3个mir-299-3p的靶位点(图2a)。采用pcr技术扩增目的片段克隆到双荧光素酶报告基因表达载体pmirglo的xhoi和xbai位点，构建包含野生型人cd47 3
′‑
utr序列的双荧光素酶表达重组质粒pmirglo-cd47 3
′
utr-wt。在此基础上，采用overlap基因定点突变技术构建包含突变人cd47 3
′‑
utr序列的双荧光素酶表达重组质粒pmirglo-cd473
′
utr-mut(突变位点见图2b所示)。转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，菌落pcr筛选阳性克隆，于生工生物工程(上海)股份有限公司进行sanger基因测序鉴定，使用snapgene软件进行基因序列比对。
50.(2)双荧光素酶报告基因实验分析
51.将4
×
104个处于对数生长期的mda-mb-231细胞接种于24孔板中，于37℃、5％co2培养箱中培养，待汇合率达60-70％时，使用lipofectamine 3000
tm
转染试剂将600ng pmirglo cd47 3
′
utr-wt质粒或pmirglo-cd47 3
′
utr-mut质粒分别和75nm cm或75nm mir-299-3p mimics或50nm anti-mir-299-3p或50nm control inhibitor(ci)共转染入mda-mb-231细胞。转染24h后，按照双荧光素酶报告基因试剂盒说明书进行操作检测。
52.结果表明：当人cd47 3
′‑
utr序列中存在天然mir-299-3p直接作用靶位点时，mir-299-3p能显著降低萤火虫荧光素酶报告基因表达活性(图2c)；当人cd473
′‑
utr序列中mir-299-3p作用靶位点突变后(突变位点如图2b所示)，mir-299-3p失去降低萤火虫荧光素酶报告基因表达活性的功能(图2d)。由此实验证明，mir-299-3p直接靶向人cd47 3
′‑
utr。
53.实施例2
54.mir-299-3p抑制人cd47的表达
55.western blot检测mda-mb-231细胞中人cd47蛋白表达水平：
56.将2
×
105个处于对数生长期的mda-mb-231细胞接种于6孔板中，于37℃、5％co2无菌培养箱中培养，待汇合率达60-70％时，用lipofectamine 3000
tm
转染试剂将不同浓度mir-299-3p mimics(anti-mir-299-3p)或50nm cm(ci)转染入mda-mb-231。转染48h后，采用western blot检测人cd47蛋白表达情况。
57.具体操作如下：
58.(1)细胞总蛋白提取：移除细胞培养基，使用预冷pbs润洗细胞三次，每孔加入100μl含1mm pmsf的ripa细胞裂解液(beyotime)，于冰上充分裂解后收集细胞裂解液，将裂解后的样品于4℃，12000g离心10min，以收集上清。bca(beyotime)法测定各样品总蛋白浓度，以便调整样品的上样体积。取适量loading buffer与相应的蛋白样品混匀，并于水浴锅中煮
沸5min，以确保各蛋白样品充分变性，用于进行后续实验。
59.(2)sds-page电泳：制备sds-page胶(10％分离胶和5％浓缩胶)，对样品进行电泳分离，电泳条件为：80v电泳约30min，120v电泳1h。
60.(3)转膜：电泳结束，恒压100v低温转膜120min，将凝胶上的分离蛋白转移至0.22μm pvdf膜(milliporesigma burlington，ma，usa)。
61.(4)封闭：转膜结束后，取出pvdf膜，并于封闭液中(含0.1％(v/v)tween20(tbst)和5％(w/v)脱脂奶粉)室温封闭1h。
62.(5)洗膜：封闭结束，tbst清洗pvdf膜15min，以除尽残留封闭液。
63.(6)抗体孵育：采用购于abcam(cambridge，uk)的兔抗anti-cd47单克隆抗体(cat
#
ab175388)(用封闭液按1:1000稀释)、gapdh(上海生工)(用封闭液按1:2000稀释)为内参，将pvdf膜置于相应的一抗中，4℃孵育过夜。用tbst洗涤pvdf膜15min，用适量的hrp偶联的山羊抗兔igg二抗(cat
#
d110058，1:4000)室温孵育2小时。
64.(7)洗膜：tbst洗涤pvdf膜15min。
65.(8)显色成像：采用ecl显色液(thermo scientific，massachusetts，usa)，避光孵育适当时间，调整凝胶成像仪的曝光参数，采集图片数据，并用image j软件进行实验结果的数据分析。
66.qrt-pcr测定mda-mb-231细胞中cd47 mrna表达水平
67.将1
×
105个处于对数生长期的mda-mb-231细胞接种于12孔板中，于37℃、5％co2无菌培养箱中培养，待汇合率达80％时，按照实施例1的转染方法用lipofectamine 3000
tm
转染试剂将75nm mir-299-3p或75nm cm或50nm anti-mir-299-3p或50nm ci转染入mda-mb-231。转染48h后，采用qrt-pcr检测cd47 mrna表达情况。使用rnaiso plus试剂(takara)抽提总rna。beyort
tm
ii cdna synthesis kit(beyotime)生成cdna，qrt-pcr使用beyofast
tm
sybr green试剂盒(beyotime)在mx3000ptm实时定量pcr仪上进行cd47 mrna定量。采用δδct法分析实验结果(gapdh为内参)，引物由生工生物技术公司合成(表1)。
68.表1 qrt-pcr引物
[0069][0070]
结果表明：从starbase分析，相比于正常乳腺组织，mir-299-3p在乳腺癌组织中下调(图3a)。kaplan-meier生存曲线显示，来源于metabric数据库的1262例乳腺癌患者中mir-299-3p的低表达与不良预后相关，p＝0.0015(图3b)。qrt-pcr分析结果发现，mir-299-3p的过表达降低了cd47的mrna水平，而anti-mir-299-3p显著上调了cd47的mrna水平(图3c)。此外，我们通过western blot检测转染不同浓度的mir-299-3p(或anti-mir-299-3p)对mda-mb-231细胞中cd47的蛋白水平的影响。如图3d所示，mir-299-3p呈剂量依赖性降低cd47的蛋白表达，而anti-mir-299-3p上调了cd47的蛋白表达(图3e)。
[0071]
实施例3
[0072]
mir-299-3p通过抑制乳腺癌细胞cd47表达增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用
[0073]
首先用pma诱导thp-1细胞获得巨噬细胞。如图4a所示，pma处理3天后，巨噬细胞表面抗原cd11b和cd86明显升高，说明thp-1细胞成功诱导为巨噬细胞。转染mir-299-3p或anti-mir-299-3p 48小时后，将efluor
tm 670(ebioscience)标记thp-1来源的巨噬样细胞与cfse(aat bioquest)标记的mda-mb-231细胞共培养3小时，进行吞噬实验，并用流式细胞术进行实验数据的采集。结果表明，巨噬细胞对mir-299-3p转染组的mda-mb-231的吞噬作用明显增强(图4b)。相反，与ci转染组相比，巨噬细胞对anti-mir-299-3p转染组细胞的吞噬能力下降(图4c)。
[0074]
实施例4
[0075]
mir-299-3p抑制乳腺癌细胞增殖和迁移
[0076]
进一步探索mir-299-3p对乳腺癌细胞生物学功能的影响。将mir-299-3p和anti-mir-299-3p瞬转入mda-mb-231细胞，在此基础上，采用mtt和划痕实验进行乳腺癌细胞增殖迁移能力检测。
[0077]
细胞增殖检测：mtt法检测mda-mb-231细胞的体外增殖能力。将3000个/孔mda-mb-231细胞接种于96孔板，并于37℃、5％ co2培养过夜，次日转染75nm mir-299-3p(cm)或50nm anti-mir-299-3p，并于转染后0、24、48、72小时进行检测：每孔加入10μl mtt(sigma，usa)，37℃避光孵育4小时；弃去培养上清，每孔加入100ul dmso，于570nm波长处检测每孔样品吸光度。
[0078]
细胞迁移检测：划痕实验检测mda-mb-231细胞的迁移能力。将mda-mb-231细胞接种于6孔板形成细胞单层，于37℃、5％ co2无菌培养箱中培养至90％细胞汇合率，转染75nm mir-299-3p(cm)或50nm anti-mir-299-3p(ci)；用200μl无菌枪头尖垂直划细胞单层，并用pbs清洗两次；换无血清dmem培养基继续培养24小时；使用倒置显微镜(zeiss，oberkochen，germany)记录0小时和培养24小时后的划痕间隙宽度；采用image j软件测量划痕间隙宽度，并按以下公式计算间隙闭合率：(0h间隙宽度-24h间隙宽度)/0h创面宽度
×
100％。
[0079]
结果表明：过表达mir-299-3p会显著抑制mda-mb-231细胞增殖(图5a)，而anti-mir-299-3p对乳腺癌细胞的增殖没有明显的调节作用(图5b)；过表达mir-299-3p会显著抑制mda-mb-231细胞的迁移能力，而anti-mir-299-3p会促进细胞迁移能力(图5c-d)。
[0080]
实施例5
[0081]
mir-299-3p诱导乳腺癌细胞周期g0/g1期阻滞
[0082]
使用流式细胞术检测细胞周期。将2
×
105个处于对数生长期的mda-mb-231细胞接种于6孔板，培养至50％的密度时转染mir-299-3p或anti-mir-299-3p，48h后收集单细胞悬液，于70％预冷乙醇中4℃固定过夜；除去乙醇后，用pbs洗2次，在含50μg/ml pi(beyotime)，100μg/ml rnase a(beyotime)的500μl pbs中重悬，37℃避光孵育30min。采用guava easycyte
tm
流式细胞仪(merck millipore，germany)测定dna含量，并用modfit lt分析软件(verity software house，topsham，me)评估细胞周期结果。
[0083]
结果表明：转染75nm cm和75nm mir-299-3p后，与cm相比，转染mir-299-3p的mda-mb-231细胞分布在g0/g1期的细胞比例显著增加，g2/m期的细胞比例显著降低(图6a)。相反，转染50nm ci和50nm anti-mir-299-3p后，与ci相比，转染mir-299-3p的mda-mb-231细胞分布在g0/g1期的细胞比例明显降低，g2/m期的细胞比例明显增加(图6b)。这些结果表
明，mir-299-3p的过表达抑制乳腺癌细胞从g0/g1期向s期的转化，阻碍细胞分裂。
[0084]
实施例6
[0085]
mir-299-3p通过靶向abce1抑制细胞增殖、迁移并诱导细胞周期阻滞
[0086]
mir-299-3p靶基因的生信预测：探索mir-299-3p调控乳腺癌细胞增殖、迁移能力和细胞周期的潜在机制。使用线上软件(targetscan,pictar,diana-microt和mirdb)筛选出mir-299-3p的潜在靶基因(图7a)。在6个候选靶位点中，仅abce1的表达与乳腺癌的生存率密切相关(表2)。starbase数据分析显示，abce1在乳腺癌组织中的表达明显高于正常乳腺组织(图7b)。此外，kaplan-meier生存曲线分析显示，将来自metabric数据库的4934例乳腺癌患者根据mrna表达的中位数分为“abce1高表达”组和“abce1低表达”组，结果显示abce1高表达与乳腺癌患者总生存概率降低相关(图7c)，表明预后不良。
[0087]
表2mir-299-3p潜在靶基因的生物信息学预测
[0088][0089]
sirna介导的abce1降低抑制乳腺癌细胞增殖迁移并诱导细胞周期阻滞
[0090]
探究abce1对乳腺癌细胞增殖、迁移和细胞周期的调控作用，设计出靶向abce1的两对abce1特异性sirnas(abce1-sirna1和abce1-sirna2)及对照sirna并购于genepharma(中国上海)，序列如下：
[0091]
abce1-sirna1：
[0092]
正义链5
′‑
gcagacaaguuaacgagaatt-3
′
[0093]
反义链3
′‑
cgtctgttcaattgctcttaa-5
′
[0094]
abce1-sirna2：
[0095]
正义链5
′‑
caaagacacaggcaauugutt-3
′
[0096]
反义链3
′‑
gtttctgtgtccgttaacaaa-5
′
[0097]
control sirna：
[0098]
正义链5
′‑
uucuccgaacgugucacgutt-3
′
[0099]
反义链3
′‑
aagaggcttgcacagtgcaaa-5
′
[0100]
按照上述的转染方法，将abce1-sirna1和abce1-sirna2瞬转入mda-mb-231细胞，并用western blot检测abce1蛋白的表达水平，结果发现abce1-sirna1和abce1-sirna2都显著降低了abce1的蛋白水平，且abce1-sirna2的效果更甚(图7d)；而后用不同浓度的abce1-sirna2转染mda-mb-231，发现50nm sirna2就能显著降低abce1蛋白表达。进一步，选用50nm abce1-sirna2转染mda-mb-231，并用mtt、划痕实验及细胞周期实验检测abce1对乳腺癌细胞增殖、迁移和细胞周期的影响。当用50nm abce1-sirna2沉默abce1表达时，能显著
降低mda-mb-231细胞的增殖能(图7e)和迁移(图7f)，并诱导细胞周期g0/g1期的阻滞(图7g)。该实验证明，sirna介导的abce1降低抑制乳腺癌细胞增殖迁移并诱导细胞周期阻滞。
[0101]
mir-299-3p抑制abce1表达的调控机制
[0102]
mir-299-3p负调控abce1蛋白表达：将mir-299-3p和anti-mir-299-3p及其对照转染入mda-mb-231细胞48小时后，采用qrt-pcr、western blot检测abce1mrna和蛋白表达水平，操作方法同实施例2。结果表明，mir-299-3p显著抑制abce1 mrna和蛋白表达水平，而anti-mir-299-3p显著上调abce1 mrna和蛋白表达水平(图8a-b)。
[0103]
mir-299-3p与人abce1 3
′‑
utr靶位点直接作用的实验确证。
[0104]
采用线上软件targetscan预测出abce1 mrna(refseq id:nm_002940)3'-utr序列中存在两个mir-299-3p的假定结合位点，而后使用双荧光素酶报告基因实验鉴定mir-299-3p与靶标基因abce1 mrna 3'-utr之间的互作，并采用overlap pcr定点突变进行反向验证(突变方案及位点和方案如图8c-d所示)。
[0105]
具体操作：同实施例2。
[0106]
结果表明：mir-299-3p显著抑制了30％-40％的荧光素酶活性，而位点1和位点2分别约占20％和10％。如图8所示，当这两个位点都发生突变时，mir-299-3p对mda-mb-231细胞中荧光素酶活性不产生调节作用。由此实验证明，mir-299-3p直接作用于abce1 mrna的3
′‑
utr。
[0107]
如图9所示，高水平的cd47受体被巨噬细胞表面的配体sirpα识别，导致shp-1和shp-2激活并招募到sirpα的免疫受体酪氨酸基抑制基元，传递“不要吃我”的信号，进而抑制巨噬细胞吞噬肿瘤细胞；并且高水平的abce1可以促进肿瘤细胞的增殖和迁移。相反，乳腺癌细胞中mir-299-3p的恢复可以同时抑制cd47和abce1的表达，从而促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞并且抑制乳腺癌细胞增殖和迁移，进而达到肿瘤消退的目的。

技术特征：
1.mir-299-3p在制备防治肿瘤药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述mir-299-3p的序列为包含下述seq id no:1所示的核苷酸序列的核酸及变体或者其化学衍生物和生物活性功能片段：5
′‑
uaugugggaugguaaaccgcuu-3
′
。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述mir-299-3p的前体在制备防治肿瘤药物中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述mir-299-3p的前体的序列seq id no:5为：5
′‑
aagaaaugguuuaccgucccacauacauuuugaauauguaugugggaugguaaaccgcuucuu-3
′
。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述mir-299-3p对序列中的磷酸二酯键、碱基或2
′‑
oh进行修饰。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述修饰，具体为：采用硫取代磷酸二酯键中的氧、对3
′
或5
′
进行生物素及荧光基团修饰、胆固醇修饰、甲氧修饰、硫代修饰、氨基修饰、或对所述核苷酸序列中的核糖的2
′‑
oh进行脱氧修饰、氟取代或者甲氧基取代。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺肿瘤，所述防治肿瘤药物靶向cd47和abce1促进巨噬细胞吞噬作用，抑制乳腺癌细胞增殖、迁移并诱导细胞周期阻滞。8.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述rna mir-299-3p或mir-299-3p前体的重组载体或病毒颗粒在制备抑制肿瘤生长、繁殖或迁移的药物中的应用。9.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述rna mir-299-3p或mir-299-3p前体的重组载体或病毒颗粒在制备增强巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的药物中的应用。10.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述rna mir-299-3p或mir-299-3p前体的重组载体或病毒颗粒在制备阻滞肿瘤细胞生长周期的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种miR-299-3p在制备防治肿瘤药物中的应用，miR-299-3p的序列为包含下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的核酸及变体或者其化学衍生物和生物活性功能片段：5


技术研发人员：谭树华 冷叶情 童守芳 武运领
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/8/23