平滑肌细胞CD38作为靶点在筛选用于防治血管钙化药物中的应用

平滑肌细胞cd38作为靶点在筛选用于防治血管钙化药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及平滑肌细胞cd38作为靶点在筛选用于防治血管钙化药物中的应用。


背景技术：

2.血管钙化是指磷酸钙和羟基磷灰石在血管中的异位沉积，导致病理性血管硬化的过程。血管钙化类似于骨形成过程，通常可以描述为一种进行性动脉硬化的形式，导致血管弹性降低，顺应性增加，最终增加心血管事件的风险。血管钙化是晚期动脉粥样硬化、糖尿病血管病变和慢性肾脏疾病的常见病理表现，也是导致这些慢性疾病死亡率发生的主要原因，血管钙化的程度可以预测心血管事件风险，几乎所有心血管疾病患者都存在一定程度的钙化。
3.动脉粥样硬化是一种血管慢性炎症性疾病，是冠心病发生的重要病理基础之一。由动脉粥样硬化引发的心血管疾病死亡率仍居中国居民首位，是人类健康的头号杀手之一。动脉粥样硬化斑块若不稳定，其破裂形成的血栓可能导致心血管恶性事件(如心肌梗塞等)。影响斑块稳定性的因素包括坏死核心的大小、纤维帽的组成与厚度等，其中斑块处出现微钙化现象将严重降低斑块稳定性，但是目前并没有有效的药物治疗血管钙化。目前对调控血管钙化的潜在分子和细胞机制也尚不完全清楚。一般认为，血管平滑肌细胞(smc)向成骨样细胞分化导致钙盐沉积是血管钙化的根本原因。
4.因此，阐明钙化的发生发展机制，将为临床上防治恶性心血管事件以及探索新的治疗靶点提供理论和实验基础。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供平滑肌细胞cd38在防治血管钙化药物干预靶点的应用。
6.本发明通过以下技术方案予以实现：
7.本发明以平滑肌细胞cd38作为靶点在筛选用于防治血管钙化药物中的应用。
8.具体地，所述药物作用于平滑肌细胞cd38，通过抑制wnt/β-catenin信号通路、抑制bmp2-(p-smad1/5/8)信号通路减少平滑肌细胞成骨分化从而实现防治血管钙化。
9.本发明还提供过表达cd38的试剂在制备用于防治血管钙化药物中的应用。
10.具体地，所述试剂降低平滑肌细胞成骨分化。
11.与现有技术相比，本发明有益效果包括：
12.1、本发明首次利用平滑肌细胞特异性敲除cd38的动脉粥样硬化内膜钙化模型探究平滑肌细胞cd38在血管钙化中的作用；
13.2、本发明首次提出平滑肌细胞cd38缺失通过激活bmp2-(p-smad1/5/8)和wnt/β-catenin信号通路从而促进血管钙化的分子机制；
14.3、本发明首次提出平滑肌细胞cd38有望成防治血管钙化的有效靶点，为血管钙化相关药物的开发提供了理论依据。
附图说明
15.图1为本发明平滑肌细胞cd38作为靶点在防治血管钙化的作用和机制示意图；
16.图2为本发明平滑肌细胞特异性敲除cd38促进钙化模型小鼠的主动脉钙化的示意图；
17.图3为本发明中平滑肌细胞特异性敲除cd38降低斑块稳定性的示意图；
18.图4为本发明中平滑肌细胞特异性敲除cd38促进主动脉环钙化的示意图；
19.图5为本发明中平滑肌细胞特异性敲除cd38促进细胞钙化的示意图；
20.图6为本发明中78-c抑制cd38促进平滑肌细胞钙化的示意图；
21.图7为本发明中cd38过表达降低平滑肌细胞钙化的示意图；
22.图8为本发明中平滑肌细胞cd38抑制wnt/β-catenin信号通路的示意图；
23.图9为本发明中平滑肌细胞cd38抑制bmp2-(p-smad1/5/8)信号通路的示意图。
具体实施方式
24.下面结合附图，对本发明作进一步地说明。
25.如图1所示，本发明以小鼠为对象建立模型研究平滑肌细胞cd38作为靶点在防治血管钙化的作用和机制。采用平滑肌细胞特异性敲除cd38小鼠制备动脉粥样硬化钙化模型，从动物水平上评价平滑肌细胞cd38对高脂饮食诱导的动脉粥样硬化钙化的影响并阐明其分子机制；其次在离体水平上采用主动脉环和平滑肌细胞钙化模型，进一步阐明钙化发生发展过程中cd38发挥的作用及其分子机制，从而揭示cd38在血管钙化领域的新功能，为钙化疾病的防治提供理论基础和实验依据。
26.1、平滑肌细胞特异性敲除cd38小鼠动脉粥样硬化钙化模型的制备及其表型分析：
27.为了探讨平滑肌细胞cd38对动脉粥样硬化内膜钙化的影响，我们首先利用课题组拥有的cd38
flox/flox
小鼠和sm22α
cre
小鼠进行交配，获得了平滑肌细胞特异性敲除cd38小鼠(cd38
f/f
sm22α
cre
)；又将apoe-/-小鼠与cd38
f/f
sm22α
cre
小鼠交配，最终获得同窝出生的apoe-/-cd38
f/f
和apoe-/-cd38
f/f
sm22α
cre
小鼠，高脂饮食喂养16周，16周后收集小鼠主动脉脉通过茜素红染色、天狼星红染色、evg染色等，检测其血管钙化程度。
28.由图2a的茜素红染色可以看出，平滑肌细胞cd38敲除明显加重主动脉根部钙化发展；图2b对主动脉中的钙含量进行测定，发现与apoe-/-cd38
f/f
小鼠相比，apoe-/-cd38
f/f
sm22α
cre
小鼠全主动脉钙含量也明显升高。该结果表明平滑肌细胞特异性缺失cd38能够促进小鼠体内动脉粥样硬化内膜钙化。
29.血管钙化是影响斑块稳定性的重要因素之一，因此我们进一步探究了平滑肌细胞特异性敲除cd38对斑块稳定性的影响。由图3的天狼星红染色(a)和胶原定量图(c)以及vvg(b)染色，发现与apoe-/-cd38
f/f
小鼠相比，apoe-/-cd38
f/f
sm22α
cre
小鼠主动脉根部斑块坏死核心变大、胶原纤维含量明显降低。这表明平滑肌细胞特异性敲除cd38能够降低斑块稳定性。
30.2.离体水平上主动脉环和平滑肌细胞钙化模型的制备及cd38对钙化影响的分析
31.首先，我们分离apoe-/-cd38
f/f
和apoe-/-cd38
f/f
sm22α
cre
小鼠的主动脉建立主动脉环钙化模型探究平滑肌细胞cd38对血管钙化的影响。图4的主动脉环茜素红染色结果可以看出，经钙化培养基培养的主动脉环钙化程度明显高于普通dmem培养基培养的主动脉环，并且与apoe-/-cd38
f/f
小鼠相比，apoe-/-cd38
f/f
sm22α
cre
小鼠的主动脉环钙化程度明显加重，表明平滑肌细胞特异性敲除cd38促进小鼠主动脉环钙化。
32.其次，我们又进一步分离apoe-/-cd38
f/f
和apoe-/-cd38
f/f
sm22α
cre
小鼠的主动脉平滑肌细胞建立平滑肌细胞钙化模型，检测cd38对钙化的影响。图5a的茜素红染色可以看出，钙化培养基明显诱导平滑肌细胞成骨分化(钙化)，而cd38敲除后进一步加重了平滑肌细胞的成骨分化情况；图5b的钙含量测定结果也显示，cd38敲除后平滑肌细胞中钙含量明显上升。
33.然后，我们利用小鼠和人原代平滑肌细胞建立钙化模型并同时使用cd38抑制剂78c处理，检测平滑肌细胞钙化情况。图6a-c可以看出在小鼠原代平滑肌细胞(masmc)中，78c处理后细胞的的钙化情况更为严重；图6d-e可以看出，与masmc相似，在hasmc中，78c也明显增加了细胞的钙化。
34.最后，我们利用慢病毒感染技术制备了cd38过表达的稳定平滑肌细胞系hasmcs(图7a)，然后提取rna和蛋白通过qrt-pcr和western blot技术明确了cd38在hasmc中的高表达(图7b-c)。然后我们利用构建的过表达cd38和对照的平滑肌细胞建立钙化模型，由图7d-e可以看出，与对照组相比，cd38过表达的平滑肌细胞钙化情况明显减轻。
35.上述结果进一步表明，平滑肌细胞cd38能够在体外抑制主动脉环和细胞钙化的发展。
36.3.平滑肌细胞cd38抑制平滑肌细胞成骨分化或钙化的机制分析
37.wnt/β-catenin信号通路在调控平滑肌细胞成骨分化中发挥重要作用。因此，我们首先通过western blot和免疫荧光等技术，检测钙化血管及细胞中成骨标志物runx2、alp和opn以及wnt/β-catenin信号通路相关信号分子lrp6、dkk1和β-catenin等的蛋白表达情况，进行血管钙化的机制探究。如图8所示，平滑肌细胞过表达cd38明显抑制了钙化标志物runx2、alp和opn的表达以及wnt/β-catenin信号通路的激活。
38.bmp2-(p-smad1/5/8)信号通路在调控平滑肌细胞成骨分化中也发挥重要作用。因此，我们进一步通过western blot和免疫荧光等技术，检测钙化血管及细胞中bmp2和p-smad1/5/8的蛋白水平变化情况，进行血管钙化的机制探究。如图9所示，平滑肌细胞过表达cd38明显抑制bmp2-(p-smad1/5/8)信号通路的激活。
39.上述结果表明，cd38通过抑制wnt/β-catenin和bmp2-(p-smad1/5/8)信号通路减少平滑肌细胞成骨分化，从而最终抑制血管钙化。
40.以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.平滑肌细胞cd38作为靶点在筛选用于防治血管钙化药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物作用于平滑肌细胞cd38，通过抑制平滑肌细胞成骨分化防治血管钙化。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述药物作用于平滑肌细胞cd38通过抑制wnt/β-catenin信号通路实现减少平滑肌细胞成骨分化。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述药物作用于平滑肌细胞cd38通过抑制bmp2-(p-smad1/5/8)信号通路实现减少平滑肌细胞成骨分化。5.过表达cd38的试剂在制备用于防治血管钙化药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述试剂降低平滑肌细胞成骨分化。

技术总结
本发明公开了平滑肌细胞CD38作为靶点在筛选用于防治血管钙化药物中的应用。本发明以平滑肌细胞CD38作为靶点在筛选用于防治血管钙化药物中的应用，所述药物通过抑制Wnt/β-catenin信号通路、抑制BMP2-(p-Smad1/5/8)信号通路从而实现防治血管钙化；本发明还提供过表达CD38的试剂在制备用于防治血管钙化药物中的应用，所述试剂降低平滑肌细胞钙化。本发明用平滑肌细胞特异性敲除CD38的动脉粥样硬化内膜钙化模型探究平滑肌细胞CD38在血管钙化中的作用；首次提出平滑肌细胞CD38缺失通过激活BMP2和Wnt/β-catenin信号通路从而促进血管钙化的分子机制；首次提出平滑肌细胞CD38有望成防治血管钙化的有效靶点，为血管钙化相关药物的开发提供了理论依据。关药物的开发提供了理论依据。关药物的开发提供了理论依据。


技术研发人员：姜玫秀 辛洪波 邓欣欣 姜玫玲 陈茵妮 王丹 毕洪峰
受保护的技术使用者：南昌大学
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/8/23