一种血管化胰岛类器官及制备方法和应用

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种血管化胰岛类器官及制备方法和应用。


背景技术：

2.目前没有方法可以根治糖尿病，患者只能采用辅助手段来控制自身的血糖水平，胰腺(岛)移植是一个有效的替代疗法，其可以部分或完全恢复生理性胰岛素分泌。世界范围内利用埃德蒙顿方案移植胰岛取得良好效果。然而，移植胰岛分泌的胰岛素的功能并不是持久的；90％的患者5年后需要再次注射胰岛素来控制他们的血糖水平，据估计即使移植了多个供体的胰岛，移植后的胰岛素产量也只有健康人的20-40％。利用干细胞构建血管化胰岛类器官可解决这一问题。
3.使用生物材料包裹胰岛可以保护它们免受免疫系统的侵害，减少免疫抑制剂的使用，免疫保护包埋细胞仍然是目前包埋材料研究中的一个重要方向。同时材料本身的生物相容性对于防止非特异性异物反应是必要的，在这种反应中，蛋白质吸附在胶囊周围，可以观察到胶原纤维沿着胶囊过度生长，形成纤维囊，导致内部胰岛坏死。细胞封装可分为大封装和微封装。大封装可将大量细胞封装在装置内，其便于移植。大封装装置可分为两大类:血管内和血管外。血管内装置使得移植物非常接近血流，方便胰岛对血糖水平的变化迅速做出反应。但如果所选择的生物材料生物相容性较低，则有可能出现血栓形成甚至设备堵塞的情况，这对患者来说是一个严重的风险。血管大封装装置主要由含有大量胰岛的封装室组成，内部由大量水凝胶包裹胰岛。这类装置可以很容易地移植到高度血管化的移植部位，但容易出现胰岛素延迟释放的可能。与大封装的胰岛相比，微封装可以提供较大的表面积/体积比，从而导致更好的扩散特性。
4.胰岛发育和内分泌功能的发挥也离不开血管网络。体外诱导构建的胰岛类器官与体内环境自然分化胰岛的主要区别之一就是它们的血管网络，其在天然胰岛和移植的胰岛中特别丰富，但在体外诱导产生类器官中很少。因此要发挥类器官的最大作用，还需在类器官成功构建的基础上实现其血管网络化。一方面可以提高其保真度，另一方面又可增加其生存能力和分泌功能，发挥更为长久有效的作用。
5.现有的生物材料并不能完全解决胰岛类器官的血管化及移植后的血管化问题，比如缺乏促进血管生成的功能，最终导致胰岛移植的效果欠佳。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供一种血管化胰岛类器官及制备方法和应用。本发明的目的是运用col-gelma作为平台，通过提供环境促进胰岛类器官的血管化。将该血管化胰岛类器官移植给糖尿病受体，能解决宿主的免疫排斥反应和血管化生成的问题，延长移植物的存活时间，改善移植后血糖控制效果。
7.为解决上述技术问题，本发明第一方面，提供一种血管化胰岛类器官的制备方法，所述方法操作如下：
8.步骤(1)细胞混合：将胰岛类器官/胰岛细胞团、人脐静脉内皮细胞和间充质干细胞按比例混合，混合细胞于低吸附板中聚集成细胞球；
9.步骤(2)细胞球重悬于col-gelma水凝胶溶液中，在固化光源下固化；
10.步骤(3)固化结束后采用pbs清洗固化材料，清洗后加入血管化类器官培养基培养，培养时间为1天-10天；
11.所述col-gelma水凝胶溶液的制备过程如下：2-5mg/mlⅰ型胶原蛋白溶液中加入光交联剂lap，溶解完全后加入称量好的gelma，35-38℃水浴锅中溶解完全，过滤器过滤即得；所述col-gelma水凝胶的使用量为80-120万细胞/ml水凝胶。本技术提供的col-gelma水凝胶溶液通过提供环境促进胰岛类器官的血管化，而且不需像现有技术中低温配制，再恢复至37℃左右进行固化，缩短实验周期，而且本发明采用的水凝胶具有类细胞外基质特性，适于细胞生长和分化的三维结构，良好的温敏凝胶特性和可降解性以及血管化的优势。
12.进一步地，步骤(1)细胞混合的具体操作如下：
13.s1将胰岛类器官/胰岛细胞团悬于血管化类器官培养基后移入低吸附板，每孔接种3-5个细胞团；此时低吸附板中含有微量的培养基。
14.s2将人脐静脉内皮细胞和和间充质干细胞悬于血管化类器官培养基中，充分混合后离心去除上清，用血管化类器官培养基重悬细胞，将细胞悬液(每孔加入40-60ul)移入低吸附板，每1-2天换一次培养基；培养4-6天，细胞聚集成较为紧实的细胞球。
15.作为优选，所述胰岛类器官/胰岛细胞团、人脐静脉内皮细胞和间充质干细胞的细胞数量比为40-60：30-40：5-7。
16.作为优选，所述血管化类器官培养基为：胰岛类器官/胰岛细胞团培养基、huvec培养基和msc培养基按2-3：5-6：1-2的质量比进行配制；
17.胰岛类器官/胰岛细胞团培养基：dmem/f12培养基+bsa 2％-3％+its-x1.0％-1.5％+neaa 0.2％-0.3％+牛磺酸1/55-1/60+烟酰胺1/400-1/350+glp-11/3900-1/3800。混合细胞前胰岛类器官/胰岛细胞团采用该培养基进行培养；
18.huvec培养基为商业化ecm-2培养基；
19.msc培养基成分为：dmem/f12培养基+10-14％胎牛血清(fbs)+0.8-1.5％青霉素/链霉素双抗(p/s)。
20.作为优选，所述gelma的浓度为10％-15％，所述光交联剂lap的加入量为0.2-0.5％；
21.作为优选，培养皿中铺多个15-30μl的材料细胞球，使用蓝光交联15-30s使其固化，所述固化光源为efl-ls-1601；波长为400-410nm。
22.按每毫升计算，ⅰ型胶原蛋白溶液的配置如下：540-560μl溶有0.05-0.2％冰醋酸的7-8mg/ml的ⅰ型胶原蛋白溶液+1-2.5μl 5n(mol/l)naoh溶液+400-450μl的ecm内皮细胞培养基。
23.作为优选，所述胰岛类器官/胰岛细胞团由脐带间充质干细胞分化而来，这样能降低间充质干细胞对胰岛类器官/胰岛细胞团之间的破坏；所述整胰岛类器官/胰岛细胞团直径范围为100～220um；如果细胞团过过大内部细胞容易坏死。
24.本发明第二方面，还提供所述制备方法制备得到的血管化胰岛类器官。能解决宿主的免疫排斥反应和血管化生成的问题，延长移植物的存活时间，改善移植后血糖控制效
果。
25.本发明第三方面，还提供所述血管化胰岛类器官在制备胰岛移植物中的应用。
26.进一步地，所述胰岛移植物在移植到体内光交联固化，现有技术中低温配制，再恢复至37℃左右进行固化，在手术过程中宿主体温较低，需要较长时间来固化，一方面增加宿主安全风险，另一方面减弱胰岛移植物功效。
27.本发明的特点如下：本发明中胰岛类器官/胰岛细胞团、内皮细胞和间充质干细胞被封装在col-gelma中，col-gelma能够保护移植物，同时间充质干细胞能够发挥免疫调节作用使移植物局部炎症反应降低，构建免疫耐受微环境。间充质干细胞、ⅰ型胶原蛋白能够快速促进血管重建，内皮细胞有助于形成血管。当间充质干细胞、内皮细胞与胰岛类器官共移植的时候，既能够显著诱导treg分泌il-10减少移植物的炎症细胞浸润，减少炎性反应，还可促进血管化。胰岛类器官/胰岛细胞团、内皮细胞、间充质干细胞与col-gelma制备的胰岛类器官，具有较好的免疫耐受诱及血管化能力。
28.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明制备的血管化胰岛类器官能很好地解决类器官的体内外血管化问题及具有免疫保护作用，胰岛类器官移植物的功能和存活时间得以延长，提高临床胰岛移植的效果，为i型糖尿病的移植治疗提供了一条新路径，具有很强的临床转化前景。
附图说明
29.图1为col-gelma固化前后的图；
30.图2为col-gelma体外安全性图
‑‑‑
活性检测；
31.图3为col-gelma体外安全性图
‑‑‑
增殖检测；
32.图4为col-gelma体内安全性图：
33.图5为血管化胰岛类器官普通白光图；
34.图6为血管化胰岛类器官荧光染色图；
35.图7为添加col-gelma的胰岛类器官和单纯胰岛类器官移植糖尿病的c57bl/6j小鼠体内动物模型中胰岛存活血糖及体重对比图；
36.图8为添加col-gelma的胰岛类器官回收图；
37.图9为添加col-gelma的胰岛类器官和单纯胰岛类器官移植糖尿病的c57bl/6j。
具体实施方式
38.下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。下文采用的实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。
39.以下实施例用到的间充质干细胞为脐带间充质干细胞；胰岛类器官/胰岛细胞团由间充质细胞分化而来；本技术所述百分比均为质量百分比。被定义的“约”和“左右”是在每个特定值的基础上下浮动10％，比如200um左右应理解为180-220um。
40.以下实施例中的人脐静脉内皮细胞采用huvec培养基(商业化ecm-2培养基)培养，培养方法属于常规技术。
41.msc采用msc培养基培养，msc培养基成分为dmem/f12培养基+12％胎牛血清(fbs)+1％青霉素/链霉素双抗(p/s)，培养方法属于常规技术。
42.以下实施例涉及到的英文简写的中文含义如表1所示。
43.表1
[0044][0045]
实施例1
[0046]
胰岛类器官/胰岛细胞团培养基：dmem/f12培养基+bsa 2％-3％+its-x1.0％-1.5％+neaa 0.2％-0.3％+牛磺酸1/55-1/60+烟酰胺1/400-1/350+glp-11/3900-1/3800。混合细胞前胰岛类器官/胰岛细胞团采用该培养基进行培养。
[0047]
血管化胰岛细胞类器官的培养基为：胰岛类器官/胰岛细胞团培养基、huvec培养基、msc培养基按2-3：5-6：1-2的比例进行配制。
[0048]
每个直径200um左右的血管化胰岛类器官(细胞数量约2000个)包括胰岛类器官/胰岛细胞团、人脐静脉内皮细胞和间充质干细胞的数量比50：35：6。
[0049]
4mg/mlⅰ型胶原蛋白溶液(1ml)：560μl溶于0.1％冰醋酸的7.1mg/ml的ⅰ型胶原蛋白溶液，1.5μl 5nnaoh溶液，438.5μl的ecm内皮细胞培养基。
[0050]
col-gelma材料的配制：将交联剂lap溶解于ⅰ型胶原蛋白溶液中，溶解完全后加入称量好的gelma，37℃水浴锅中溶解完全，0.22μm滤器过滤即得；gelma的浓度为12％，光交联剂lap的加入量为0.3％；
[0051]
所述血管化胰岛类器官的制备方法包括以下步骤(按照此方案所制作的具血管化胰岛类器官共2ml体积)：
[0052]
步骤1：将胰岛类器官/胰岛细胞团(含有微量培养基)移入低吸附板，每孔接种4-5个。
[0053]
步骤2：将约7万个内皮细胞和约1.2万个间充质干细胞的细胞悬液充分混合在一
起，离心，去除上清，用血管化胰岛细胞类器官培养基重悬细胞，此时体积为4.8ml。
[0054]
步骤3：将离心后的细胞混合悬液移入低吸附板，每孔接种50μl，于37℃、5％co2条件下培养，每1-2天换一次血管化类器官培养基，4-7d后待细胞聚集成较为紧实的细胞球后，按照80-120万细胞/ml材料，用col-gelma材料重悬细胞球，在35mm培养皿中铺多个20μl的材料细胞球，使用蓝光灯(光源为efl-ls-1601；波长为405nm。)交联20s使其固化，固化前后如图1所示，col-gelma材料液体状态下经光照射，与蓝光交联剂共价交联后可快速凝胶化，呈无色或淡黄色。固化后用pbs清洗固化材料3次，缓缓加入血管化胰岛细胞类器官培养基于37℃、5％co2条件下培养得到血管化胰岛类器官，培养时间为1-7天，24h即可观察到血管出芽小分支。
[0055]
4.将培养得到的血管化胰岛类器官注射至糖尿病小鼠肾包膜下，使用蓝光灯交联20s使其固化，缝合手术伤口。
[0056]
实施例2体外安全评价
[0057]
col-gelma水凝胶表面细胞2d培养
[0058]
(1)取无菌col-gelma水凝胶溶液，在96孔板中加入40μl水凝胶溶液。
[0059]
(2)使用405nm便携式固化光源固化20s。
[0060]
(3)pbs清洗固化后材料3次。
[0061]
(4)取生长良好的msc/huvec细胞，用细胞培养液配制成浓度为2
×
104个/ml的单细胞悬液,接种于96孔板，每孔200μl，置于细胞培养箱中培养，每2天更换一次培养基。
[0062]
col-gelma水凝胶内部细胞3d培养
[0063]
(1)取生长良好的msc/huvec细胞，配制成浓度为3.5
×
105/ml的单细胞悬液。
[0064]
(2)于水凝胶下重悬细胞。
[0065]
(3)在96孔板中加入40μl水凝胶-细胞悬液。
[0066]
(4)使用405nm便携式固化光源固化20s。
[0067]
(5)用pbs清洗固化材料3次，缓缓加入培养基。放入细胞培养箱中培养，每2天更换一次培养基。
[0068]
细胞附着形态检测
[0069]
(1)取细胞，用倒置相差显微镜于白光下观察细胞与材料作用前后附着形态的变化，拍照记录，并依此判断材料对细胞的毒性影响。
[0070]
(2)用image j软件对显微镜观察记录的2d培养的细胞进行面积和长短轴比的分析统计，比较在材料作用下细胞附着形态和附着面积的变化。
[0071]
细胞存活检测
[0072]
(1)取细胞，去除培养液后pbs清洗3次。
[0073]
(2)取calcein am细胞活性检测试剂盒，按照1：1000的比例将pi和cal(calcein am)溶于稀释缓冲液中。
[0074]
(3)将配制好的缓冲液加入样孔中，37℃培养箱中避光孵育20分钟。
[0075]
(4)用移液器去除缓冲液液后pbs清洗3次。共聚焦显微镜观察。
[0076]
细胞增殖检测
[0077]
(1)取细胞，去除培养液后pbs清洗3次，每次5min。
[0078]
(2)4％pfa室温固定细胞15min。
[0079]
(3)于摇床上用pbst清洗固定后细胞3次，每次5min，摇床转速设为最低。
[0080]
(4)室温下使用溶于pbst的10％的山羊血清透膜2h。
[0081]
(5)于摇床上用pbst清洗固定后细胞3次，每次5min，摇床转速设为最低。
[0082]
(6)按1：200的比例将ki67抗体溶于pbst中，4℃过夜。
[0083]
(7)于摇床上用pbst清洗固定后细胞3次，每次5min，摇床转速设为最低。
[0084]
(8)按1：200的比例将coralite488-conjugated goat anti-rabbit igg溶于pbst中，室温避光孵育2h.，同时在1.5h时按照1：1000的比例将dapi加入孵育孔中。
[0085]
(9)pbst清洗细胞3次，每次5min。共聚焦显微镜观察。
[0086]
参见图2和图3，图2为msc细胞和huvec细胞(人脐静脉血管内皮细胞)的活性检测结果，图2中钙黄绿素能够穿透活细胞膜，并滞留在细胞内发出绿色荧光，典化丙啶仅对死细胞染色。通过计算钙黄绿素阳性细胞和典化丙啶阳性细胞比例，可看到，与空白对照相比，在材料上进行2d培养的单层的间充质干细胞其存活并不会受到材料的影响(图2j，p》0.05)，同样培养条件下内皮细胞的存活也不会受到影响(图k，p》0.05)。3d培养环境下的两种细胞均不具有2d培养条件下的贴壁状形态，即表现出图2c、f、i图中点状形态，其细胞活率均受到影响(图2j，p《0.001图j，k《0.0001)。但两种细胞共培养时，细胞的增殖能力与单独3d培养相比，有部分恢复(图2l，p《0.001)。
[0087]
图3为增殖检测结果，图3中ki67蛋白是与细胞周期密切相关的一种核蛋白，表达于细胞增殖分裂的各个时期，可表征细胞分裂情况。通过计算ki67阳性细胞在总细胞中的比例，可看到，与空白对照相比，在材料上进行2d培养的单层的间充质干细胞，其增殖并不会受到材料的影响(图3j，p》0.05)，同样培养条件下内皮细胞的增殖略微受到影响，但没有显著性差异(图3k，p》0.05)。而在3d单独培养环境下的两种细胞，其增殖都会受到影响(图3j、k，p《0.0001)，但两种细胞共培养时，细胞增殖能力与单独3d培养相比，有部分恢复(图l，p《0.001)。
[0088]
由图2和图3可以看到材料并不会对细胞有毒副作用。
[0089]
实施例3体内安全评价
[0090]
col-gelma的组织相容性及降解性评价
[0091]
(1)从笼中取出c57bl/6小鼠，称量体重。
[0092]
(2)将其放在鼠笼盖上，按200ul/10g体重的量吸取即用型1.25％阿佛丁溶液麻醉小鼠。
[0093]
(3)用碘伏擦拭备皮部位消毒后，在小鼠脊柱右侧0.5公分处沿着与脊柱平行的方向剪一条0.5公分的切口，切口的上端距小鼠背部末根肋骨0.1公分，用镊子小心挤出右侧肾脏。
[0094]
(4)用沾了生理盐水的棉签湿润肾包膜，用注射器针头在肾脏的下极上做了一个小划痕，小心剪开切口，用显微镊抬起肾包膜的切口边缘，用微量注射器将材料注入肾包膜下，然后封闭切口。
[0095]
(5)采取间断缝合的方法用持针器及4-0缝合线分别将肌肉层及皮肤层缝合。
[0096]
(6)在术后3d、7d、15d、30d处死小鼠，观察材料在肾包膜内的组织炎症反应和降解情况，在取材肾脏后固定于4％pfa，制作染色组织切片进行病理(he、masson)组织学观察。
[0097]
参见图4，此图为col-gelma体内安全性图，图4中he染色结果显示小鼠组织完好，
无免疫细胞浸润，未见到小鼠移植部位发生急性毒性反应(图4)。同时，随之时间推移，材料被逐渐降解，取出的组织未观察到材料存在(图4a、c、e、g、i)。可以看到材料并不会对细胞有毒副作用，且随时间逐渐被降解。
[0098]
实施例4降糖效果评价
[0099]
(1)正常对照组(control组)：小鼠不给予药物诱导及类器官移植。
[0100]
(2)stz诱导i型糖尿病模型组：采用stz腹腔注射诱导i型糖尿病小鼠模型。
[0101]
(3)sham组(假手术组)：对采用stz诱导i型糖尿病模型造模成功的小鼠进行假手术操作。每天对其进行血糖及体重的测量。
[0102]
(4)血管化类器官移植组(添加材料组)：对采用stz诱导i型糖尿病模型造模成功的小鼠进行对其血管化胰岛类器官移植。每天对其进行血糖及体重的测量。
[0103]
(5)类器官移植组(未添加材料组)：对采用stz诱导i型糖尿病模型造模成功的小鼠进行对其胰岛类器官移植。每天对其进行血糖及体重的测量。
[0104]
具体操作
[0105]
(1)收集类器官。
[0106]
(2)称量小鼠体重。吸取即用型1.25％阿佛丁麻醉小鼠。
[0107]
(3)备皮及挤出右侧肾脏。
[0108]
(4)用沾了生理盐水的棉签湿润肾包膜，用注射器针头在肾脏的下极上做了一个小划痕，小心剪开切口，用显微镊抬起肾包膜的切口边缘，并使用自制的火抛光玻璃巴斯德移液器小心地移动到肾包膜内部上方，轻轻打开一个小的肾包膜口袋。将吸取有类器官的pe50管插入肾包膜口袋中，注意不要损伤肾脏实质，将类器官全部注射之后，用烧红的铁棒灼烫以封闭切口。
[0109]
(5)缝合伤口及标记。
[0110]
小鼠空腹血糖测量
[0111]
(1)提前12h对小鼠进行禁食，但不禁水。
[0112]
(2)用采血针小心刺破小鼠尾尖，用纸巾擦去第一滴血，利用虹吸作用将第二滴及之后的血吸附到血糖试纸上，静候5s等待血糖示数。
[0113]
(3)出现血糖读数后，用脱脂棉给小鼠止血后放回笼中。
[0114]
(4)测量结束后，更换血糖试纸进行下一只小鼠的测量。
[0115]
小鼠腹腔葡萄糖耐量实验(ipgtt)
[0116]
(1)提前12h对小鼠进行禁食，但不禁水。
[0117]
(2)测出血糖水平，作为ipgtt第0分钟的血糖水平。
[0118]
(3)给要测的小鼠腹腔注射葡萄糖溶液。每只小鼠注射的葡萄糖量为2g/kg。(葡萄糖溶液的配制：配制0.2g/ml的葡萄糖溶液，使用精确天平称取葡萄糖2g，再加入10mlpbs，涡旋仪震荡混匀过滤备用。配制25mm的葡萄糖溶液，使用精确天平称取葡萄糖0.025g，再加入10mlpbs，涡旋仪震荡混匀过滤备用。配制5mm的葡萄糖溶液，取1ml配制好的25mm葡萄糖溶液，再加入9mlpbs)。
[0119]
(4)在腹腔注射葡萄糖溶液后的0、5、15、30、60、90、120分钟测小鼠的血糖水平。
[0120]
(5)测出各个时间节点的小鼠血糖水平。
[0121]
胰岛类器官移植物清除
[0122]
(1)吸取即用型1.25％阿佛丁麻醉。
[0123]
(2)备皮及挤出右侧肾脏。
[0124]
(3)用沾了生理盐水的棉签湿润肾包膜，用注射器针头将肾包膜小心划开，用显微镊抬起肾包膜的切口边缘，并使用自制的火抛光玻璃巴斯德移液器小心地将移植物从肾包膜口袋中挑出，注意不要损伤肾脏实质，将挑出的移植物立刻放入生理盐水中。
[0125]
(4)缝合伤口及标记。
[0126]
胰岛类器官移植物检验
[0127]
(1)采用脱颈法处死小鼠。
[0128]
(2)用眼科镊及眼科剪小心将肾脏取出。
[0129]
(3)用生理盐水清洗肾脏后放入4％pfa中。
[0130]
胰岛类器官移植物的免疫荧光和病理检测
[0131]
参见图5，此图为血管化胰岛类器官普通白光图，从图5发现，加入材料之后，有分支状结构从类器官表面发散出(图5c、d)，未加入材料，并不会有出芽小分支(图5a、b)。可以看到类器官周围有分枝状出芽。
[0132]
将出芽的胰岛类器官进行胰岛及内皮marker的免疫荧光检测，参见图6，对其出芽的类器官进行鉴定，确定为出芽的血管小分支(图6a)。对类器官球体直接(图6b)或间接(冰冻切片，图6c)免疫荧光鉴定，可观察到类器官表面及内部有血管状结构的存在，内部有胰岛相关marker的表达。证实col-gelma能够促进血管新生，在体外形成血管化类器官。
[0133]
将含有200个胰岛当量的胰岛类器官和单纯胰岛通过注射的方式移植入糖尿病c57bl/6j小鼠的肾包膜内。每日尾尖取血，血糖仪检测空腹血糖、体重，参见图7，model组和sham组在实验的整个过程中状况持续恶化，表现出血糖的整体升高(图7b)。未添加col-gelma的类器官组和加了col-gelma材料的类器官组在2天内血糖下降，4-9d内在14mmol/l左右波动，8d后两组出现差异，未添加col-gelma的类器官组开始急剧恶化，添加col-gelma材料的类器官组也逐渐开始恶化(图7c、d)。同时，在第9d时移去类器官的小鼠，其血糖在第10d开始急剧上升，未移去类器官的同组小鼠，血糖波动程度较小(图c、d)。移植类器官后，小鼠体重略有回升，但从第9天开始体重均下降，但添加col-gelma材料的移植组体重比未添加col-gelma材料的移植组大，model组和sham组体重一直在下降(图7a)。在第三天时，可看到肾包膜下移植类器官后，在2小时内糖尿病小鼠的葡萄糖清除能力未完全恢复到正常水平(p《0.01)，但也有了恢复(图7d、e)，移植组小鼠清除葡萄糖能力与糖尿病小鼠有显著性差异(图7e，p《0.01)。说明移植物发挥了作用。其中，添加材料的移植组小鼠血糖清除能力略优于未添加材料组，但两者无显著性差异(图7e，p》0.05)。
[0134]
图8中回收移植9d后的胰岛类器官，对其进行免疫荧光鉴定，发现移植物中有些部位生成了血管状结构，有些仍是分散状的内皮细胞(图8a)。同时，可看到有少许insulin表达(图8b)。
[0135]
将取下的组织进行鉴定，图9免疫荧光结果表明添加col-gelma的胰岛类器官有血管生成(图9d)。
[0136]
综上图7证实胰岛类器官能够降低血糖。在第三天进行葡萄糖耐量试验，证实胰岛类器官可改善小鼠葡萄糖清除能力，添加材料后类器官的清除作用略优于未添加材料组。体重下降情况显示材料组也优于未添加材料组。第九天回收移植物，图8证实添加材料后，
胰岛类器官在体内有形成血管趋势。而未添加材料的移植物未有血管趋势。回收移植物后小鼠血糖上升说明确实发挥降血糖作用。将肾脏及移植物回收后；图9证实胰岛类器官在体内可形成血管网络。
[0137]
上述制备方法中胰岛类器官、内皮细胞和间充质干细胞被封装在col-gelma中，col-gelma能够保护移植物，同时间充质干细胞能够发挥免疫调节作用使移植物局部炎症反应降低，构建免疫耐受微环境。间充质干细胞、ⅰ型胶原蛋白能够快速促进血管重建。间充质干细胞可影响机体的两大免疫细胞，其对t细胞的增殖分化起着重要作用。一方面，间充质干细胞可通过直接接触或分泌抑制因子，如ido、hgf和no等，抑制辅助性t细胞亚群(th1和th17)的分化，另一方面，其又可分泌tgf-β和il-10等因子，促进调节性t细胞(treg细胞)的增殖从而对炎症性心肌炎发挥心脏保护作用。其同时还能作用于b淋巴细胞发挥免疫调节作用。msc在体内对炎症信号可发挥远程反应，并且具有很高的迁移潜能，在归巢迁移至机体炎症部位后，间充质干细胞一方面招募巨噬细胞和淋巴细胞发生免疫反应，另一方面在经过微环境中的炎性因子刺激后，可分泌包括tgf-β、no、ido、tsg6、前列腺素e2、il-1受体拮抗剂、il-10和趋化因子ccl2的拮抗型在内的多种因子来发挥免疫调节功能，且这一调节功能的强弱取决于微环境中因子的种类和浓度。内皮细胞有助于形成血管。因此，当间充质干细胞、内皮细胞与胰岛类器官共移植的时候，既能够显著诱导treg分泌il-10减少移植物的炎症细胞浸润，减少炎性反应，还可促进血管化。胰岛类器官、内皮细胞、间充质干细胞与col-gelma制备的胰岛类器官，具有较好的免疫耐受诱及血管化能力。
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应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

技术特征：
1.一种血管化胰岛类器官的制备方法，其特征在于，所述方法操作如下：步骤(1)细胞混合：将胰岛类器官/胰岛细胞团、人脐静脉内皮细胞和间充质干细胞按比例混合，混合细胞于低吸附板中聚集成细胞球；步骤(2)细胞球重悬于col-gelma水凝胶溶液中，在固化光源下固化；步骤(3)固化结束后采用pbs清洗固化材料，清洗后加入血管化类器官培养基培养，培养时间为1天-10天；所述col-gelma水凝胶溶液的制备过程如下：2-5mg/mlⅰ型胶原蛋白溶液中加入光交联剂lap，溶解完全后加入称量好的gelma，35-38℃水浴锅中溶解完全，过滤器过滤即得。2.根据权利要求1所述的血管化胰岛类器官的制备方法，其特征在于，步骤(1)细胞混合的具体操作如下：s1将胰岛类器官/胰岛细胞团悬于血管化类器官培养基后移入低吸附板，每孔接种3-5个细胞团；s2将人脐静脉内皮细胞和和间充质干细胞悬于血管化类器官培养基中，充分混合后离心去除上清，用血管化类器官培养基重悬细胞，将细胞悬液移入低吸附板，每1-2天换一次培养基；培养4-6天，细胞聚集成较为紧实的细胞球。3.根据权利要求2所述的血管化胰岛类器官的制备方法，其特征在于，所述胰岛类器官/胰岛细胞团、人脐静脉内皮细胞和间充质干细胞的细胞数量比为40-60：30-40：5-7。4.根据权利要求2所述的血管化胰岛类器官的制备方法，其特征在于，所述血管化类器官培养基为：胰岛类器官/胰岛细胞团培养基、huvec培养基和msc培养基按2-3：5-6：1-2的质量比进行配制；胰岛类器官/胰岛细胞团培养基：dmem/f12培养基+bsa2％-3％+its-x1.0％-1.5％+neaa0.2％-0.3％+牛磺酸1/55-1/60+烟酰胺1/400-1/350+glp-11/3900-1/3800；混合细胞前胰岛类器官/胰岛细胞团采用该培养基进行培养；huvec培养基为商业化ecm-2培养基；msc培养基成分为：dmem/f12培养基+10-14％胎牛血清+0.8-1.5％青霉素/链霉素双抗。5.根据权利要求1所述的血管化胰岛类器官的制备方法，其特征在于，所述gelma的浓度为10％-15％，所述光交联剂lap的加入量为0.2-0.5％；所述固化光源为efl-ls-1601；波长为400-410nm。6.根据权利要求5所述的血管化胰岛类器官的制备方法，其特征在于，按每毫升计算ⅰ型胶原蛋白溶液的配置如下：540-560μl溶有0.05-0.2％冰醋酸的7-8mg/ml的ⅰ型胶原蛋白溶液+1-2.5μl5nnaoh溶液+400-450μl的ecm内皮细胞培养基。7.根据权利要求1所述的血管化胰岛类器官的制备方法，其特征在于，所述胰岛类器官/胰岛细胞团由脐带间充质干细胞分化而来；所述整胰岛类器官/胰岛细胞团直径范围为100～220um。8.根据权利要求1-7任一所述制备方法制备得到的血管化胰岛类器官。9.权利要求8所述血管化胰岛类器官在制备胰岛移植物中的应用。10.根据权利要求9所述血管化胰岛类器官在制备胰岛移植物中的应用，其特征在于，所述胰岛移植物在移植到体内光交联固化。

技术总结
本发明公开了一种血管化胰岛类器官及制备方法和应用。所述方法操作如下：步骤(1)细胞混合：将胰岛类器官/胰岛细胞团、人脐静脉内皮细胞和间充质干细胞按比例混合，混合细胞于低吸附板中聚集成细胞球；步骤(2)细胞球重悬于Col-Gelma水凝胶溶液中，在固化光源下固化；步骤(3)固化结束后采用PBS清洗固化材料，清洗后加入血管化胰岛细胞类器官培养基培养。本发明制备的血管化胰岛类器官能很好地解决类器官的体内外血管化问题及具有免疫保护作用，胰岛类器官移植物的功能和存活时间得以延长，提高临床胰岛移植的效果，为I型糖尿病的移植治疗提供了一条新路径，具有很强的临床转化前景。具有很强的临床转化前景。具有很强的临床转化前景。


技术研发人员：司维 马祥 李汶联 董为鑫
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/8/23