一种制备pH响应性炔雌醇复合水凝胶的方法与流程

一种制备ph响应性炔雌醇复合水凝胶的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种制备ph响应性炔雌醇复合水凝胶的方法。


背景技术：

2.炔雌醇(ethinyloestradiol，ee)，化学名称为3-羟基-19-去甲-17α-孕甾-1,3,5(10)-三烯-20-炔-17-醇，是一种有机化合物，化学式为c
20h24
o2，炔雌醇对下丘脑和垂体有正、负反馈作用，小剂量可刺激促性腺激素分泌；大剂量则抑制其分泌，从而抑制卵巢的排卵，达到抗生育作用。该品能刺激垂体合成和释放促性腺激素(fsh和lh)，促性腺激素则刺激性腺释放性激素。下丘脑分泌促性腺激素释放素受多种因素的调控，其中包括循环中的性激素。单剂使用时能增加循环中的性激素；连续使用可致腺垂体中促性腺激素释放素受体下调，从而减少性激素的分泌。由于炔雌醇在水中的溶解度较低，仅为4.8mg/l，使得其在人体内的生物利用度较低。此外，炔雌醇在口服递送中存在多个障碍，如肝脏首过效应和消化道内的酶降解等，使得其在人体内的药效降低。因此，为提高炔雌醇的生物利用度，寻求适合的递送方式成为了研究的热点之一。


技术实现要素：

3.为了弥补现有技术的不足，本发明的目的是为了提供一种制备ph响应性炔雌醇复合水凝胶的方法。
4.本发明提供了一种炔雌醇药物组合物，所述药物组合物包括炔雌醇、二乙烯三胺、环糊精、醛基纤维素、水溶性高分子聚合物、水凝胶。
5.进一步，所述水凝胶包括海藻酸钠(sa)。
6.进一步，所述水凝胶为包裹物。
7.进一步，所述炔雌醇、二乙烯三胺、环糊精、醛基纤维素、水溶性高分子聚合物为被包裹物。
8.进一步，所述水溶性高分子聚合物包括羟丙甲纤维素、羟丙纤维素、羟乙纤维素、甲基纤维素、羧甲纤维素钠、聚维酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇中的一种或几种。
9.当在本文中使用时，术语“药物组合物”是指包含至少一种生物活性药剂的任何组合物。当在本文中使用时，术语“药物组合物”还是指包含待递送到对象以例如实现治疗、预防、诊断、阻止或预后效果的活性药物成分的组合物。
10.在某些实施方式中，所述药物组合物包含活性药物成分和可药用载体。当在本文中使用时，术语“可药用载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。可药用载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一者或多者及其组合。
11.本发明提供了一种炔雌醇药物组合物的制备方法，所述制备方法包括制备前面所述的药物组合物所需的试剂或粉剂。
12.进一步，所述制备方法包括以下步骤：
13.a、将重结晶的环糊精溶于氢氧化钠水溶液中，搅拌，得到碱性β-环糊精溶液；
14.b、将对甲苯磺酰氯溶于乙腈中，滴加到步骤a的碱性环糊精溶液中；
15.c、搅拌，调节溶液ph，冷冻过夜，完全沉淀；
16.d、过滤收集沉淀，洗涤，沉淀干燥，得到纯白色固体；
17.e、步骤d所得纯白色固体溶解，加热，加入碘化钾和二乙烯三胺，氮气保护下搅拌；
18.f、所得溶液冷却至室温，洗涤，用抽滤法将沉淀分离出来并收集，所得固体真空干燥，得到白色固体粉末；
19.g、将步骤f中得到的白色固体粉末溶解于水至饱和，加入炔雌醇和助溶剂后加热搅拌；
20.h、室温下继续搅拌，冷冻过夜；
21.i、过滤步骤h中溶液，将滤液冷冻干燥，得到白色固体粉末；
22.j、将步骤i中的白色固体粉末溶于水；
23.k、醛基纤维素溶解氢氧化钠溶液中，加入一定量步骤j中的溶液，搅拌，加入水溶性高分子聚合物粉末搅拌，成为分散均匀的糊状膏体；
24.l、将步骤k中膏体放入胶囊模板中，压成实状，定型；
25.m、将步骤l中胶囊表面包裹海藻酸钠黏液，浸泡在cacl2溶液中，交联；
26.n、将步骤m中的胶囊进行冲洗n次，得到成品药物组合物。
27.在某些具体的实施例中，所述步骤a中氢氧化钠水溶液具备一定的浓度，其浓度为8.4mol/l。在某些具体的实施例中，所述步骤k中醛基纤维素的溶剂氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/l。
28.进一步，所述步骤a的搅拌时间包括30min。
29.进一步，所述步骤c中搅拌时间包括2h。
30.进一步，所述步骤c中搅拌温度为室温。
31.进一步，所述步骤c中调节ph的范围为5-7。
32.进一步，所述步骤c中冷冻过夜的条件包括4℃。
33.进一步，所述步骤d中洗涤所使用的溶液为乙醇溶液。
34.进一步，所述步骤d中干燥的条件为50℃干燥12h。
35.进一步，所述步骤e中溶解所使用的溶剂为n-甲基吡咯烷酮。
36.进一步，所述步骤e中加热的温度为70℃。
37.进一步，所述步骤e中氮气保护下搅拌的时间为7h。
38.进一步，所述步骤e中氮气保护下搅拌的温度为70℃。
39.进一步，所述步骤f中洗涤所使用的溶液为乙醇。
40.进一步，所述步骤f中固体真空干燥的时间为12h。
41.进一步，所述步骤f中固体真空干燥的温度为50℃。
42.进一步，所述步骤g中助溶剂包括乙醇。
43.进一步，所述步骤g中加热搅拌的时间为1h。
44.进一步，所述步骤g中加热搅拌的温度为40℃。
45.进一步，所述步骤h中室温搅拌的时间为3h。
46.进一步，所述步骤h中冷冻过夜的时间为12h。
47.进一步，所述步骤h中冷冻过夜的温度为4℃。
48.进一步，所述步骤i中冷冻干燥的时间为12h。
49.进一步，所述步骤n中冲洗次数n的值为2-3。
50.进一步，所述海藻酸钠的浓度范围为1wt％-3wt％。
51.进一步，所述海藻酸钠的浓度为3wt％。
52.进一步，所述cacl2浓度的浓度范围为2wt％-6wt％。
53.进一步，所述cacl2浓度的浓度范围为6wt％。
54.进一步，所述药物组合物的直径范围为1mm-10mm。
55.进一步，所述药物组合物的直径为4mm。
56.本发明提供了二乙烯三胺、环糊精、醛基纤维素在药物组合物的缓释中的应用，所述药物组合物包括炔雌醇。
57.本发明提供了一种炔雌醇药物组合物的制备装置，所述制备装置自动执行前面所述的制备方法中描述的步骤。
附图说明
58.图1是水凝胶胶囊的扫描电镜图，其中，a为水凝胶胶囊的表面结构图(
×
200)，b为水凝胶胶囊的横截面结构图(
×
200)；
59.图2是水凝胶胶囊的溶胀过程图，其中，a为sa浓度图，b为cacl2浓度图，c为水凝胶胶囊的直径对水凝胶胶囊的溶胀性能的影响图；
60.图3是氯化钙浓度或海藻酸钠浓度对水凝胶胶囊力学性能影响图，其中，a为氯化钙浓度对水凝胶胶囊力学性能影响图，b为海藻酸钠浓度对水凝胶胶囊力学性能影响图；
61.图4是炔雌醇的标准曲线图；
62.图5是水凝胶胶囊在模拟胃液和模拟肠液的释放过程图，其中，图中a为模拟胃液，b为模拟肠液；
63.图6是水凝胶胶囊的ee释放过程图，图中a代表炔雌醇、二乙烯三胺、β-环糊精、羟乙基纤维素、醛基纤维素、海藻酸钠水凝胶构成的核壳结构水凝胶胶囊，b代表炔雌醇、羟乙基纤维素、醛基纤维素构成的核壳结构海藻酸钠水凝胶胶囊，c代表非核壳结构的炔雌醇、二乙烯三胺、β-环糊精、羟乙基纤维素、醛基纤维素、海藻酸钠水凝胶胶囊；
64.图7是添加不同浓度的水凝胶胶囊提取物后24h和48h的细胞存活率图。
具体实施方式
65.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例和实验例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例和试验例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
66.实施例1
67.1、实验材料
68.β-环糊精购自淄博千汇生物科技有限公司。二乙烯三胺和对甲苯磺酰氯(99％)购自阿拉丁公司(中国上海)。n-甲基吡咯烷酮和乙腈由中国天津科密欧化学试剂有限公司提
供。碘化钾购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司。氢氧化钠购自天津化学试剂上海有限公司。盐酸(hcl)购自阿拉丁试剂上海有限公司。海藻酸钠购自天津科密欧化学试剂有限公司。羟乙基纤维素购自阿拉丁试剂上海有限公司。氯化钙(cacl2)购自天津科密欧化学试剂有限公司。(4,5-二甲基噻唑-2-酰基)-2,5-二苯基四唑溴化铵(mtt)购自西格玛化工有限公司。人皮肤成纤维细胞(l929)购自伊朗巴斯德研究所。
69.2、实验方法
70.a、将0.054mol重结晶后的β-环糊精溶于8.4mol/l的氢氧化钠水溶液中，搅拌大约30分钟，得到碱性β-环糊精溶液；
71.b、将0.058mol对甲苯磺酰氯溶于30ml乙腈中，滴加到上述的β-环糊精溶液中；
72.c、室温搅拌2.0h后，用盐酸调节溶液ph至5～7，所得悬浮液在4℃下冷冻过夜，使沉淀物完全沉淀；
73.d、过滤收集沉淀，用大量乙醇溶液洗涤，得到的所有沉淀50℃下干燥12h，得到9.2g纯白色固体；
74.e、将1.59
×
10-3
mol的步骤d中纯白色固体溶解于5ml n-甲基吡咯烷酮中，加热至70℃，然后加入0.025g碘化钾和0.73g的二乙烯三胺，将混合物在氮气保护下70℃搅拌7h；
75.f、所得到溶液在冷却至室温后用100ml乙醇洗涤，用抽滤法将白色沉淀分离出来并收集，所得固体在50℃下真空干燥12h，得到白色固体粉末；
76.g、将步骤f中白色固体粉末溶解于10ml 40℃的去离子水中，加入0.085g炔雌醇和1ml乙醇助溶剂后在40℃下搅拌1h；
77.h、停止加热，在室温下继续搅拌3h后放入4℃冰箱中过夜；
78.i、12h后过滤步骤h溶液，将滤液冷冻干燥12小时，得到白色固体粉末；
79.j、将步骤i中白色固体粉末溶于水；
80.k、将醛基纤维素溶解在0.1mol/l的氢氧化钠溶液中，加入一定量的步骤j水溶液，充分搅拌，加入羟乙基纤维素粉末搅拌均匀，直至成为分散均匀的糊状膏体；
81.l、将糊状膏体放入胶囊模板中加工并成压成实状，经过挤压定型后，去除掉多余的纤维素和不合格产品，确保胶囊的精度；
82.m、将步骤l中胶囊的表面均匀地包裹上一层海藻酸钠黏液，然后将其快速浸泡在一定浓度的cacl2溶液中进行交联；
83.n、将步骤m中胶囊用蒸馏水冲洗两到三次，去除水凝胶胶囊表面多余的cacl2，得到成品胶囊。
84.3、实验结果
85.1)水凝胶胶囊的形貌分析
86.利用扫描电镜观察水凝胶胶囊核壳结构的微观形貌。如图1所示，水凝胶胶囊壳的微观结构与水凝胶核的微观结构有着明显的区别，胶囊壳呈现较为致密的壳状结构。水凝胶胶囊核的结构则呈现为稀疏多孔的网状结构，这是由于核壳结构是由不同材料以及不同方法合成导致的。正是利用水凝胶胶囊核和水凝胶胶囊壳的不同结构和不同性质，制作了具有这种控制释放作用的药物水凝胶胶囊载体，用于携带药物分子炔雌醇，通过胶囊外壳的保护作用将炔雌醇运送到人体指定器官然后进行释放，以达到缓控释药物分子炔雌醇释放的目的。
87.2)水凝胶胶囊的溶胀性能分析
88.溶胀性能是决定水凝胶胶囊释放药物分子的关键标准。水凝胶胶囊在模拟胃液(ph＝1.5)、模拟肠液(ph＝7.5)中的溶胀行为如图2所示。实验表明，水凝胶胶囊的破裂过程与海藻酸钠溶液的浓度、cacl2的浓度和水凝胶胶囊的大小有关。
89.图2a显示了海藻酸钠浓度对水凝胶胶囊破裂过程的影响。当海藻酸钠浓度为1wt％时，通过交联作用制备的胶囊外壳机械强度弱，容易变形和破裂。将水凝胶胶囊浸泡模拟胃液中，4h内开始破裂。随着海藻酸钠浓度的增加，由于高浓度海藻酸钠溶液形成了高机械强度的壳层，水凝胶胶囊不易破裂。如图2b所示，当cacl2浓度为2wt％时，水凝胶胶囊在模拟胃液中开始发生破裂，且随着cacl2浓度的增加，水凝胶囊开始破裂的时间逐渐延长。但是延长的效果逐渐减弱，原因是海藻酸钠中的羧基逐渐与溶液中ca
2+
的配体达到饱和状态，继续增加cacl2的浓度并没有提高和海藻酸钠交联制得的水凝胶的强度。因此，选择cacl2和海藻酸钠溶液的中位浓度(6wt％和3wt％)作为水凝胶胶囊后续研究的制备参数。
90.水凝胶胶囊的大小也是影响胶囊破裂时间的另一个重要因素。如图2c所示，当cacl2和海藻酸钠溶液的浓度分别为6wt％和3wt％时，水凝胶胶囊的直径越大，水凝胶胶囊破裂的速度越快。当水凝胶胶囊直径为10mm时，胶囊在模拟胃液条件下4h内开始破裂，随着水凝胶胶囊直径的减小，胶囊开始破裂的时间逐渐增长。这是由于直径更大的水凝胶胶囊其内核含有更多的可溶胀性纤维素，它可以吸收更多的水，膨胀得更快，从而快速释放包合的药物。同时直径过大的水凝胶胶囊不易于吞咽和口服，因此选择直径4mm作为水凝胶胶囊后续研究的制备参数。
91.3)水凝胶胶囊的力学性能分析
92.通过edelberg推拉力计测试了水凝胶胶囊的力学性能，并探讨了不同海藻酸钠和氯化钙浓度对水凝胶胶囊力学性能的影响。用于药物递送应用的水凝胶必须具有一定的机械强度，以避免被快速侵蚀从而不能达到定点释放的效果。从图3可以看出，由低浓度的海藻酸钠和氯化钙制备的水凝胶胶囊外壳只能承受1.9kpa的压强，随着浓度的增加，水凝胶的力学性能逐渐提高。原因是海藻酸钠和氯化钙得到了更高程度的交联，形成更紧密的外壳，从而延迟了水凝胶胶囊的破裂时间，从而增强了水凝胶胶囊的力学性能，但由于水凝胶胶囊需要在模拟肠液条件下破裂从而释放药物，所以不宜制备机械强度过高的凝胶外壳以免不易破裂。
93.4)水凝胶胶囊的缓释性能分析
94.为了定量测定水凝胶胶囊的炔雌醇释放量，绘制了炔雌醇的紫外标准曲线如图4所示。
95.研究了水凝胶胶囊在模拟人体胃肠环境的释放性能。如图5的a曲线所示，ee水凝胶胶囊在模拟胃液(ph＝1.5)中12h内累计释放率达到50％，ee的释放量有限。如图5的b曲线所示，ee在模拟肠液中4h累计释放率达到60％，9h累计释放率达到90％，ee在模拟肠液中的释放速度远高于在模拟肠液中的释放速度。说明海藻酸钠和钙离子交联制得的水凝胶胶囊外壳在酸性条件下具有一定的保护作用，能够减缓药物分子ee的释放。
96.为了使水凝胶胶囊的释放过程更加接近于人体真实的胃肠道环境，对其进行了连续释放过程的模拟研究。如图6所示，将炔雌醇、二乙烯三胺、β-环糊精、羟乙基纤维素、醛基纤维素、海藻酸钠水凝胶构成的核壳结构水凝胶胶囊(a)，炔雌醇、羟乙基纤维素、醛基纤维
素构成的核壳结构海藻酸钠水凝胶胶囊(b)，和非核壳结构的炔雌醇、二乙烯三胺、β-环糊精、羟乙基纤维素、醛基纤维素、海藻酸钠水凝胶胶囊(c)放置于在模拟胃液(ph＝1.5)4h，然后将溶液的ph值调节至7.5(模拟肠液ph)来监测ee的释放。a胶囊进入模拟肠液前，水凝胶胶囊中ee的释放量有限，在模拟胃液中ee释放量仅有20％。水凝胶胶囊进入模拟肠液1h后，溶液中ee浓度迅速升高，说明海藻酸钠和氯化钙形成的外壳具有ph敏感特性。
97.c胶囊在5h内累积释放率达到90％，说明胶囊外壳对减缓ee的释放具有一定的保护作用。由于ee的水溶性较低，b水凝胶胶囊在12h内的累计释放率不超过5％，而a胶囊在9h内的累计释放率达到90％，说明二乙烯三胺、β-环糊精确实提高了ee的水溶性。a水凝胶胶囊的制备可使ee在模拟胃肠液中连续释放，有助于ee在医学上的应用。
98.5)水凝胶胶囊的细胞毒性分析
99.采用mtt法检测水凝胶胶囊的生物相容性。mtt实验通常与活细胞数量以及细胞增殖高度相关。图7显示了5种不同浓度的水凝胶胶囊提取物对培养24h和48h后l929细胞存活率的影响，随着提取物浓度的增加，l929细胞相对活力会受到影响部分下降但仍处于较高水平。细胞存活率超过85％。根据gb/t16886.5-2003(iso 10993-5:1999)标准，细胞活力大于75％的样品为无细胞毒性。证明所制备的水凝胶胶囊对人体的健康无影响。
100.上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.一种炔雌醇药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括炔雌醇、二乙烯三胺、环糊精、醛基纤维素、水溶性高分子聚合物、水凝胶；优选地，所述水凝胶包括海藻酸钠。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述水凝胶为包裹物；优选地，所述炔雌醇、二乙烯三胺、环糊精、醛基纤维素、水溶性高分子聚合物为被包裹物；优选地，所述水溶性高分子聚合物包括羟丙甲纤维素、羟丙纤维素、羟乙纤维素、甲基纤维素、羧甲纤维素钠、聚维酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇中的一种或几种。3.一种炔雌醇药物组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括制备权利要求1、2任一项所述的药物组合物所需的试剂或粉剂。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：a、将重结晶的环糊精溶于氢氧化钠水溶液中，搅拌，得到碱性环糊精溶液；b、将对甲苯磺酰氯溶于乙腈中，滴加到步骤a的碱性环糊精溶液中；c、搅拌，调节溶液ph，冷冻过夜，完全沉淀；d、过滤收集沉淀，洗涤，沉淀干燥，得到纯白色固体；e、步骤d所得纯白色固体溶解，加热，加入碘化钾和二乙烯三胺，氮气保护下搅拌；f、所得溶液冷却至室温，洗涤，用抽滤法将沉淀分离出来并收集，所得固体真空干燥，得到白色固体粉末；g、将步骤f中得到的白色固体粉末溶解于水至饱和，加入炔雌醇和助溶剂后加热搅拌；h、室温下继续搅拌，冷冻过夜；i、过滤步骤h中溶液，将滤液冷冻干燥，得到白色固体粉末；j、将步骤i中的白色固体粉末溶于水；k、醛基纤维素溶解氢氧化钠溶液中，加入一定量步骤j中的溶液，搅拌，加入水溶性高分子聚合物粉末搅拌，成为分散均匀的糊状膏体；l、将步骤k中膏体放入胶囊模板中，压成实状，定型；m、将步骤l中胶囊表面包裹海藻酸钠黏液，浸泡在cacl2溶液中，交联；n、将步骤m中的胶囊进行冲洗n次，得到成品药物组合物。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a的搅拌时间包括30min；优选地，所述步骤c中搅拌时间包括2h；优选地，所述步骤c中搅拌温度为室温；优选地，所述步骤c中调节ph的范围为5-7；优选地，所述步骤c中冷冻过夜的条件包括4℃；优选地，所述步骤d中洗涤所使用的溶液为乙醇溶液；优选地，所述步骤d中干燥的条件为50℃干燥12h；优选地，所述步骤e中溶解所使用的溶剂为n-甲基吡咯烷酮；优选地，所述步骤e中加热的温度为70℃；优选地，所述步骤e中氮气保护下搅拌的时间为7h；优选地，所述步骤e中氮气保护下搅拌的温度为70℃；优选地，所述步骤f中洗涤所使用的溶液为乙醇；
优选地，所述步骤f中固体真空干燥的时间为12h；优选地，所述步骤f中固体真空干燥的温度为50℃；优选地，所述步骤g中助溶剂包括乙醇；优选地，所述步骤g中加热搅拌的时间为1h；优选地，所述步骤g中加热搅拌的温度为40℃；优选地，所述步骤h中室温搅拌的时间为3h；优选地，所述步骤h中冷冻过夜的时间为12h；优选地，所述步骤h中冷冻过夜的温度为4℃；优选地，所述步骤i中冷冻干燥的时间为12h；优选地，所述步骤n中冲洗次数n的值为2-3。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠的浓度范围为1wt％-3wt％；优选地，所述海藻酸钠的浓度为3wt％。7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述cacl2浓度的浓度范围为2wt％-6wt％；优选地，所述cacl2浓度的浓度范围为6wt％。8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述药物组合物的直径范围为1mm-10mm；优选地，所述药物组合物的直径为4mm。9.二乙烯三胺、环糊精、醛基纤维素在药物组合物的缓释中的应用，其特征在于，所述药物组合物包括炔雌醇。10.一种炔雌醇药物组合物的制备装置，其特征在于，所述制备装置自动执行权利要求3-8任一项所述的制备方法中描述的步骤。

技术总结
本发明公开了一种制备pH响应性炔雌醇复合水凝胶的方法，本发明还涉及炔雌醇的药物组合物，含有组成成分炔雌醇、环糊精、醛基纤维素、水溶性高分子聚合物、二乙烯三胺。本发明所提供的药物组合物相比较于单独的炔雌醇，其水中溶解度显著增强，具备缓释的作用。且本发明的制备方法操作简单、可控性强、重现性好，制备出的药物组合物质量稳定，具有广阔的市场应用前景。前景。前景。


技术研发人员：徐娟 宁丽峰
受保护的技术使用者：国家卫生健康委科学技术研究所
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/8/23