一种枯草芽孢杆菌发酵分级产物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及枯草芽孢杆菌发酵领域。更具体地说，本发明涉及一种枯草芽孢杆菌发酵分级产物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.我国心血管疾病现状异常严峻，患病人数超过4.5亿人，其中血栓性疾病、高血压、高血脂等都是严重的心血管疾病，严重影响人民的生命健康和生活质量。但是，目前临床用药都已小分子化学药物为主，长期服用会有各种毒副作用，缺乏安全有效的功能食品和药物。


技术实现要素：

3.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，一方面，本发明的一优选实施方案提供了一种枯草芽孢杆菌发酵分级产物的制备方法，包括以下步骤：
4.步骤1)制备发酵培养基；
5.步骤2)制备种子液
6.将枯草芽孢杆菌菌种接入步骤1)的发酵培养基中，并于35-40℃，100-500r/min摇床振荡培养15-20h，得到种子液；
7.步骤3)接种发酵
8.将步骤2)得到的种子液按照1％-5％的接种量接种到发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；
9.步骤4)菌液分离
10.待发酵结束，将步骤3)得到的发酵液进行分离得到菌体和发酵液；
11.步骤5)发酵液分级收集
12.对步骤4)得到的发酵液进行分级分离，收集得到不同分子量范围的多种发酵产物，分别为分子量大于10000da的发酵产物a、分子量6000da-10000da的发酵产物b、分子量为2000da-6000da的发酵产物c以及分子量为100da-2000da的发酵产物d。
13.优选地，所述步骤3)中的发酵条件为：发酵时长18-22h，发酵温度36-38℃，发酵环境中溶氧量为20-40％。
14.优选地，所述步骤1)中，所述发酵培养基中包含质量分数1％-5％的氮源、质量分数2％-4％的葡萄糖以及质量分数0.01％-0.1％的硫酸钙。
15.优选地，所述氮源采用大豆成分，包括但不限于大豆粉、大豆粕粉、大豆蛋白粉、大豆蛋白胨、大豆肽粉。
16.优选地，所述步骤2)中，所述枯草芽孢杆菌菌种在使用前，用新鲜的斜面活化18-24h，再从斜面上挑取一环枯草芽孢杆菌菌体用于接种。
17.优选地，所述步骤5)中，所述将步骤4)得到的发酵液通过分离工艺分离收集得到不同分子量范围的多种发酵产物，具体包括：
18.将发酵液通过10000da分离膜超滤设备进行浓缩得到浓缩液a，浓缩液a通过真空冷冻干燥或喷雾干燥得到分子量大于10000da的发酵产物a；
19.将上一步10000da分离膜超滤得到的透过液通过6000da分离膜超滤设备进行浓缩得到浓缩液b，浓缩液b通过真空冷冻干燥或喷雾干燥得到分子量6000da-10000da的发酵产物b；
20.将上一步6000da分离膜超滤得到透过液通过2000da分离膜超滤设备进行浓缩得到浓缩液c，浓缩液c通过真空冷冻干燥或喷雾干燥得到分子量2000da-6000da的发酵产物c；
21.将上一步2000da分离膜超滤的透过液通过100da分离膜超滤设备进行浓缩得到浓缩液d，并将浓缩液d通过真空冷冻干燥或喷雾干燥得到分子量100da-2000da的发酵产物d。
22.优选地，所述步骤5)中，经由100da分离膜超滤设备浓缩后的透过液可用于配置发酵培养基。
23.另一方面，本发明的一优选实施方案提供了一种枯草芽孢杆菌发酵分级产物的制备方法制备得到的枯草芽孢杆菌发酵分级产物，其包括分子量大于10000da的发酵产物a、分子量6000da-10000da发酵产物b、分子量2000da-6000da发酵产物c以及分子量100da-2000da发酵产物d。
24.另一方面，本发明的一优选实施方案提供了一种枯草芽孢杆菌发酵分级产物的应用，其中，发酵产物a在制备辅助溶栓的保健食品或治疗溶栓的药品上的应用，发酵产物b在制备提高免疫力的保健食品或药品上的应用，发酵产物c在制备辅助降血压的保健食品或治疗降血压的药品上的应用，发酵产物d在制备辅助降血脂和治疗脂肪肝的保健食品或治疗高血脂和治疗脂肪肝的药品上的应用。
25.本发明至少包括以下有益效果：
26.本发明通过分离工艺技术分步骤、分阶段收集不同分子量范围的组分，分别为分子量大于10000da的发酵产物a、分子量6000da-10000da发酵产物b、分子量2000da-6000da发酵产物c以及分子量100da-2000da发酵产物d，四种发酵产物分别具有不同的功效，其中，发酵产物a分子量大于10000，含有枯草杆菌纤溶酶，分子量在28000左右，具有纤溶和溶栓功效。发酵产物b分子量6000-10000，有助于提高免疫力，表现在此范围含有完整的分子蛋白和蛋白片段，小分子蛋白具有提高免疫力的效果。发酵产物c分子量在2000-6000范围，含有的小分子完整蛋白就很少了，大部分为多肽，而文献报导具有降血压效果的多肽多集中在此分子量范围之内。发酵产物d分子量在100-2000范围，是本发明首次发现具有降血脂功能短肽的主要分布范围，降脂效果和脂肪肝治疗效果显著，并且进行了氨基酸测序鉴定。
27.而且本发明通过分离工艺技术，最终实现透过液经检测水质达到发酵用水标准，可回收用于下批次菌种发酵培养基的配置。从而达到污水零排放和发酵产物绿色制造。
28.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
29.图1为本发明中试验一中灌胃给药发酵产物a14天sd大鼠下腔静he染色切片结果。
30.图2为本发明中试验四中小鼠血清tg含量示意图。
31.图3为本发明中试验四中小鼠肝脏油红o染色病理组织切片。
具体实施方式
32.下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
33.以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变形。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
34.可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。
35.制备方案一
36.一种枯草芽孢杆菌发酵分级产物的制备方法，包括以下步骤：
37.步骤1)制备发酵培养基；
38.所述发酵培养基中包含质量分数2％的豆粕粉、质量分数3％的葡萄糖以及质量分数0.02％的硫酸钙；所述氮源采用大豆；
39.步骤2)制备种子液
40.枯草芽孢杆菌菌种在使用前，用新鲜的斜面活化18-24h，再从斜面上挑取一环枯草芽孢杆菌菌体用于接种。接种环取1-5环种子枯草芽孢杆菌菌种接入600ml步骤1)的发酵培养基中，并于37℃，200r/min摇床振荡培养18h，得到种子液，110-115℃灭菌20min；
41.所述枯草芽孢杆菌bacillus subtilis zf01，保藏编号为cctcc no：m2022132，其保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为bacillus subtilis，保藏日期为2022年2月18日，保藏地点为中国武汉大学。
42.步骤3)接种发酵
43.将600ml的种子液取接种于装有30l培养基的发酵罐中，接种量为2％。控制温度37℃，转速与溶氧联动，溶氧设置为30％，发酵20-21h，发酵结束后得发酵液。
44.步骤4)菌液分离
45.待发酵结束，将步骤3)得到的发酵液经过管式离心机进行分离，收集菌泥，与水按照重量比1:20比例混匀，添加麦芽糊精10％，进行喷雾干燥的菌体。干燥工艺为进风温度155℃，出风温度82℃，进料速度25r/min。干燥后枯草杆菌的菌粉可开发为食用菌或益生菌；发酵液去除菌体后获得发酵清液25l左右。
46.步骤5)发酵液分级收集
47.将步骤4)得到的发酵液通过分离工艺分离收集得到不同分子量范围的多种发酵产物，具体包括：
48.将发酵液通过10000da分离膜超滤设备进行超滤浓缩得到浓缩液a，大约2.5l左右，透过液大约22l左右，浓缩液a通过真空冷冻干燥或喷雾干燥得到分子量大于10000da的发酵产物a；
49.将上一步22l透过液通过6000da分离膜超滤设备进行浓缩得到浓缩液b，大约2.2l
左右，透过液20l左右，将浓缩液b通过真空冷冻干燥或喷雾干燥得到分子量6000da-10000da的发酵产物b；
50.将上一步20l透过液通过2000da分离膜超滤设备进行浓缩得到浓缩液c，大约2l左右，透过液18l左右。浓缩液c通过真空冷冻干燥或喷雾干燥得到分子量2000da-6000da的发酵产物c；
51.将上一步18l透过液通过100da分离膜超滤设备进行浓缩得到浓缩液d，大约1.8l左右，透过液大约16l左右。浓缩液d通过真空冷冻干燥或喷雾干燥得到分子量100da-2000da的发酵产物d。且经由100da分离膜超滤设备浓缩后的透过液可用于配置发酵培养基。
52.试验一发酵产物a的纤溶活性与溶栓功效测试
53.1.1、发酵产物a的纤溶活性检测
54.(1)试剂配制
55.a液：称量tris 121.1g加水使溶解，并用约42ml浓盐酸调节ph至8.0，最后1l定容为母液。取母液10ml，加水稀释至500ml为a液。
56.b液：称量nacl 9g加水使溶解，并定容到1l。
57.50mg/ml纤维蛋白原溶液：称量1g纤维蛋白原粉溶于20mla液，使其充分溶解。
58.100u/ml的凝血酶溶液：将1000u凝血酶溶于10mla液，使其充分溶解。
59.尿激酶溶液标准品：先取2ml无菌的生理盐水(0.9％ w/v)溶解尿激酶标准品(1240iu/支)，制成620iu/ml的溶液。再从上述溶液中取1ml到另一含1ml生理盐水的小管中，制成310iu/ml的溶液，依次稀释成155iu/ml、77.5i u/ml、38.75i u/ml、19.375iu/ml的标准尿激酶溶液，备用。
60.(2)实验方法
61.纤维蛋白平板的制备：称量0.15g的琼脂(0.75％)、0.1755g nacl(0.15m)，加到50ml小锥形瓶中；量取20ml的a液，溶解琼脂；锥形瓶加塞置于微波炉中加热溶解；待锥形瓶冷却至50℃时向瓶中加入1ml 50mg/ml的纤维蛋白原溶液及100μl 100u/ml的凝血酶，混合均匀后迅速倾入灭菌平皿中；室温放置30min，以形成纤维蛋白凝块。
62.待测样品溶液的制备：取待测样品适量，加b液使溶解，并稀释成标准曲线范围内的浓度。绘制尿激酶标准曲线：用打孔器在纤维蛋白平板上打7个孔，并做好标识；取10μl各浓度的标准尿激酶溶液到对应的孔中，放置10min后转至37℃恒温培养箱中反应，18h后取出测定各溶解圈的垂直两直径；上述操作设定三个平行组，测量后取其平均值；再用垂直直径的乘积(s)的常用对数为横坐标，标准尿激酶浓度的常用对数为纵坐标，制作尿激酶酶活标准曲线。待测样品溶栓活性的测定：取待测样品10ul按上述操作上样于同一平皿，37℃恒温培养箱中反应，18h后测量溶解圈的垂直两直径，根据标准曲线方法及稀释浓度求出样品的酶活力大小。
63.实验结果。最终测得分子量大于10000da的发酵产物a的纤溶活性为41.8万iu/g。
64.1.2、发酵产物a的溶栓功效测试
65.方法：sd大鼠46只雄性大鼠，随机分组，分为5组，分别为假手术组(6只)、血栓模型对照组(0iu/kg)(10只)、纤溶酶低剂量组(4000iu/kg)(10只)、中剂量组(8000iu/kg)(10只)及高剂量组(16000iu/kg)(10只)，经口服灌胃给药每天2次，给药容积10ml/kg，血栓模
型对照组给予相同容积氯化钠注射液；在给药7天后解剖一半数量的大鼠，剩下的在给药14天后解剖，取结扎下方的下腔静脉1.5cm置于生理盐水中，并快速用吸水纸吸干称重记为血栓湿重(血管+管腔内血栓)，后放置4％多聚甲醛固定过夜，进行组织学分析。
66.观察指标：血栓形状大小及重量、血管he染色。
67.结果：本试验期间，各组动物均未见濒死或死亡情况发生；临床观察结果显示，各剂量组与模型组动物均未见明显异常。
68.血栓重量结果显示，假手术组没有血栓，与模型组比较，口服给药7天组，低剂量组(4000iu/kg)血栓的重量中剂量组(8000iu/kg)和高剂量组(16000iu/kg)血栓的重量显著降低，分别减少了17.45mg、53.1mg和64.47mg；口服给药14天组，低剂量组(4000iu/kg)、中剂量组(8000iu/kg)和高剂量组(16000iu/kg)血栓的重量显著降低，分别减少了21.26mg、31.2mg和40.16mg，均有统计学差异(p《0.05)，且存在剂量相关性。
69.图1结果显示，口服给药14天组血管he染色结果显示，假手术组血管各层结构清晰，腔内干净，未见明显异常；模型组血管主体基本坏死钙化，血管损伤严重；低剂量组(4000iu/kg)血管外周基本坏死钙化，周围形成狭窄的再通血管，与模型组相比有少许改善；中剂量组(8000iu/kg)血管内血栓再通，血栓部分溶解出现裂缝，周围新生的内皮细胞长入并被覆于裂隙表面形成新的血管，与模型组相比有极显著改善；高剂量组(16000iu/kg)血管壁结构完整，各层结构清晰，腔内仅见小团溶解的血栓，主要由红细胞，纤维蛋白以及少量的白细胞组织，与模型组相比有极显著改善。
70.结论：在本试验条件下，大鼠经口灌胃分子量大于10000da的发酵产物a(4000、8000和16000iu/kg)7天和14天，有效溶栓剂量为4000iu/kg，且随着剂量的增加溶栓效果更好。
71.试验二、发酵产物b的提高免疫力功效试验
72.小鼠免疫低下模型实验：50只小鼠(雄性，spf级)随机分为5组，每组10只动物。正常对照组、免疫低下模型组、6000da-10000da发酵产物低、中、高剂量组(50mg
·
kg-1、100mg
·
kg-1、200mg
·
kg-1)；免疫低下模型组采用隔日腹腔注射地塞米松方法，给药剂量为20mg
·
kg-1
·
d-1，连续10次，建立小鼠免疫低下模型，正常对照组注射等量生理盐水。第一次注射地塞米松次日，开始灌胃发酵产物，连续灌胃4周，正常组、模型组灌胃等量生理盐水。
73.结束后称小鼠体重，取胸腺及脾称重，计算胸腺及脾脏指数。结果如表所示，低中高三个剂量组胸腺指数和脾脏指数与模型组相比，都有显著提高，证明6000da-10000da发酵产物具有提高免疫力功效。
74.表1发酵产物b对小鼠免疫低下模型小鼠的影响
75.组别胸腺指数脾脏指数正常组0.1223
±
0.0410.3145
±
0.0444模型组0.0098
±
0.00600.1380
±
0.0113低剂量组0.0187
±
0.0098*0.1512
±
0.0134*中剂量组0.0375
±
0.0122**0.1759
±
0.0237*高剂量组0.0571
±
0.0241**0.2007
±
0.0311*
76.*：p＜0.05为差异显著，**：p＜0.01为差异极显著
77.试验三、发酵产物c的降血压功效试验
78.实验方法：自发性高血压大鼠(shr)，雄性，清洁级，周龄10-12，体重200-220g。试验开始前1周，大鼠先进行无创血压测定1周，使其适应测量环境。自发性高血压大鼠50只，分成5组，每组10只，为模型对照组灌胃生理盐水。阳性药物卡托普利组，根据人日用剂量转换得大鼠给药剂量0.25mg。发酵产物c给药剂量分别为50mg、100mg、200mg的低、中、高三个剂量组。wistar大鼠10只，200-220g，spf级为普通对照组，灌胃生理盐水。
79.按中剂量0.5g/kg.d给药，以纯化水为溶剂配制所需浓度，每只大鼠按1.0ml/100g.bw灌胃，模型对照组灌胃纯化水，普通对照组按实施例1高剂量1g/kg.d给药，以纯化水为溶剂配至所需浓度，每只大鼠按1.0ml/100g.bw灌胃，连续给药4周。
80.采用智能无创血压计，测量大鼠动脉收缩压。在大鼠安静清醒状态下，将其固定在专用固定器上，在40℃下恒温预热10min左右，促进尾动脉有效扩张，血流通畅；然后将大鼠加压感应器套入鼠尾根部。试验期间、用药前及用药后每周测量血压、心率和体重各1次。
81.使用spss统计软件进行数据处理，t检验进行各组间显著性差异分析，p＜0.05为差异显著，p＜0.01为差异极显著。所有检测指标的数据均以均数
±
标准差表示。
82.表2发酵产物c对试验大鼠收缩压的影响
[0083] 给药前/mmhg给药4周后/mmhg普通动物组136.6
±
2.3137.1
±
1.8模型对照组174.4
±
5.6178.3
±
6.2卡托普利组176.2
±
5.1141.2
±
6.7
**
低剂量组174.1
±
5.5163.9
±
4.2
*
中剂量组172.8
±
5.7159.5
±
5.6
**
高剂量组174.7
±
6.3146.2
±
5.2
**
[0084]
*：p＜0.05为差异显著，**：p＜0.01为差异极显著
[0085]
测试结果见表2，与给药前相比，低中高三个剂量组均显著降低大鼠收缩压，而高剂量组降压效果与阳性药物卡托普利基本一致，证明2000da-6000da肽粉具有非常好的降血压效果。
[0086]
试验四、发酵产物d的降血脂与脂肪肝治疗试验
[0087]
方法：60只昆明小鼠，雄性，体重20
±
2g，随机分为6组，每组10只。发酵产物d灌胃剂量10mg/只、50mg/只和100mg/只低、中、高三个剂量组，他汀阳性药组0.1mg/只，脂肪肝模型组和正常对照组。
[0088]
除正常对照组喂服同等普通饲料外，其他组喂高脂性饲料，温度20～25℃，饲养4周，期间每天进行灌胃给药。脂肪肝模型组和正常对照组灌服等体积生理盐水。
[0089]
观察指标：血脂四项高密度脂蛋白(hdl)、低密度脂蛋白(ldl)、甘油三酯(tg)和总胆固醇(cho)含量。小鼠肝脏病理检查(he染色)。
[0090]
图2中，小鼠血清tg含量；b.小鼠血清cho含量；c.小鼠血清hdl含量；d.各组小鼠血清ldl含量。
#
p《0.01，
#
p《0.05与空白对照组小鼠相比，*p《0.05与模型组小鼠相比。
[0091]
血脂四项结果显示，与普通饲料喂养的对照组小鼠相比，高脂饲料组血清中tg、cho、ldl含量分别增加了169％(p＜0.01)、26.1％(p＜0.05)、22.8％；hdl含量减少了0.2％，差异不显著。与模型组相比，100da-2000da发酵产物低、中、高剂量组和他汀组小鼠
的tg含量分别减少了9.9％、13.5％、29.6％(p＜0.05)、8.2％；小分子短肽低、中、高剂量组和他汀组小鼠的cho含量分别减少了2.4％、2.8％、9.8％、2.5％，但差异均不显著。小分子短肽低、中、高剂量组和他汀组小鼠的hdl含量增加了17.4％(p＜0.05)、18.6％(p＜0.05)、29.9％(p＜0.05)、14.7％；小分子短肽低、中、高剂量组和他汀组小鼠的ldl含量分别减少了4.6％、10.9％、17.9％、14.8％，但差异均不显著。证明100da-2000da发酵产物可有效降低血清中总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的含量，并且可提高血清高密度脂蛋白的含量。
[0092]
小鼠肝脏病理切片结果显示，正常对照组小鼠肝组织结构和细胞形态正常，细胞排列规律，没有脂肪空泡的发生。模型组小鼠肝脏细胞肿胀，不同程度的弥漫性肝细胞脂肪变性，可见多处空泡样和炎性细胞浸润。与模型组相比，他汀组及100da-2000da发酵产物低中高三个剂量组肝脏脂肪变性程度均有不同程度的改善，其中高剂量组效果与他汀组效果基本一致。综上，100da-2000da发酵产物具有非常好的降血脂和脂肪肝治疗效果，且可以达到他汀的效果。但是本发明的发酵产物没有毒副作用，应用前景更加广阔。
[0093]
试验五、发酵产物a、发酵产物b、发酵产物c、发酵产物d的降血脂治疗试验
[0094]
方法：60只昆明小鼠，雄性，体重20
±
2g，随机分为6组，每组10只。发酵产物a实验组、发酵产物b实验组、发酵产物c实验组以及发酵产物d实验组，分别灌胃发酵产物50mg/只。他汀阳性药组0.1mg/只，脂肪肝模型组和正常对照组。除正常对照组喂服同等普通饲料外，其他组喂高脂性饲料，温度20～25℃，饲养4周，期间每天进行灌胃给药1次。脂肪肝模型组和正常对照组灌服等体积生理盐水。前期试验证明，发酵产物对甘油三酯(tg)指标调节下降最明显，因此选择tg为观察指标，具体结果如表3所示。
[0095]
表3不同组别小鼠血脂指标实验前后变化情况
[0096] tg(mmol/l)正常组0.48
±
0.11模型组1.63
±
0.24他汀组1.27
±
0.16
**
发酵产物a组1.68
±
0.21发酵产物b组1.51
±
0.14发酵产物c组1.43
±
0.12
**
发酵产物d租1.02
±
0.09
*
[0097]
与模型组相比**：p＜0.01为差异极显著
[0098]
表3结果显示，与模型组相比，发酵产物a和发酵产物b组、发酵产物c租，tg含量下降不显著，而发酵产物d组tg含量下降显著，甚至超过了他汀组，而他汀是降血脂的标准用药。
[0099]
试验六、对分子量为100da-2000da的发酵产物d进行进一步降血脂治疗试验
[0100]
上述100da-2000da发酵产物经过1500da、1000da和100da的不分离膜和喷雾干燥获得分子量为100da-1000da、1000da-1500da、1500da-2000da的三种发酵产物。且分别进行小鼠高血脂模型试验同试验五，并增加油红o染色肝脏病理切片观察。
[0101]
表4不同组别小鼠血脂指标实验前后变化情况
[0102][0103][0104]
与模型组相比**：p＜0.01为差异极显著
[0105]
表4结果显示，与模型组相比，100da-1000da发酵产物组、1000da-1500da发酵产物组、1500da-2000da发酵产物组下降都显著，均超过了他汀组，其中，100da-1000da发酵产物组tg含量下降最显著。
[0106]
小鼠肝脏病理切片结果显示，模型对照组小鼠肝组织细胞染成红色，脂肪颗粒已经充满整个肝脏组织。与模型组相比，100da-1000da发酵产物组小鼠的肝脏细胞组织几乎没有红色区域，证明没有脂肪颗粒的积累。证明100da-1000da发酵产物的降血脂效果与脂肪肝治疗效果最显著。
[0107]
试验七、对分子量为100da-2000da的发酵产物d进行氨基酸序列鉴定
[0108]
鉴于分子量200da-1000da发酵产物组分显著的降血脂与脂肪肝治疗效果，取喷雾干燥后的发酵产物进行氨基酸序列质谱鉴定。鉴定服务机构为生工生物工程(上海)股份有限公司。试验步骤如下：
[0109]
(1)样品处理：取分子量100da-1000da发酵产物溶于washing buffer(0.1％ fa,2％acn)；将样品溶液转移至10kd超滤离心管中，12000g，离心10min；将超滤后的溶液使用c18除盐柱进行脱盐处理；用elution buffer(0.1％fa,60％ acn)洗脱样品，洗脱溶液转至新ep管；将洗脱后的样品进行离心浓缩干燥，待做质谱分析；重新溶解于100ul nano-lc流动相a(0.1％甲酸/水)中，然后直接装瓶上机检测。
[0110]
(2)lc-ms/ms分析：除盐后样品经离心干燥后，重新溶解于100ul nano-lc流动相a(0.1％甲酸/水)中装瓶上样，进行在线lcms分析。溶解后的样品以2μl的体积上样到nanoviper c18预柱上(3μm，)，然后20ul体积冲洗脱盐。液相为easy nlc 1200纳升液相系统(thermofisher,usa)，样品在预柱上脱盐保留后再经分析柱分离，分析柱规格是c18反相色谱柱(acclaim pepmap rslc，75μm
×
25cm c18-2μm)，实验所用梯度为60min内流动相b(80％乙腈，0.1％甲酸)由5％升高至38％。质谱采用thermofisher q exactive系统(thermofisher,usa)结合纳升喷雾nano flex离子源(thermofisher,usa)，喷雾电压为1.9kv，离子传输管加热温度为275℃。质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下(dda，data dependent analysis)，一级质谱扫描分辨率为70000，扫描范围100-1500m/z，最大注入时间100ms。每次dda循环下最多采集20个电荷为1+到3+的二级图谱，二级质谱离子最大注入时间为50ms。碰撞室能量(高能碰撞诱导解离，hcd)设定为28ev，适用于所有前体离子，动态排除设置为6秒
[0111]
(3)数据库检索分析与结果：质谱采集到的原始raw图谱文件，采用peaks studio8.5(bioinformatics solutions inc.waterloo,canada)软件进行数据加工处理和检索分析，数据库为uniprot下载的目的物种蛋白数据库，检索参数设置如下：一级质谱质量容差为10ppm，二级质谱为0.05da。可变修饰为oxidation(m)、acetylation(protein n-term)、deamidation(nq)、pyro-glu from e、pyro-glu from q。
[0112]
经质谱鉴定，共鉴定氨基酸序列180条。具有降血脂功效的存在于这180条氨基酸序列之中，可能是多条氨基酸序列共同起作用，也可能是某一条起作用。
[0113]
附：180条氨基酸序列
[0114]
1.e.qderqfpfprpp.h
[0115]
2.e.qderqfpfprpph.q
[0116]
3.e.deqprpipfprpqpr.q
[0117]
4.e.qderqfpfprpp.h
[0118]
5.d.eqprpipfprpqpr.q
[0119]
6.q.derqfpfprpph.q
[0120]
7.r.qfpfprpphq.k
[0121]
8.e.qderqfpfprpph.q
[0122]
9.e.qprpipfprpqpr.q
[0123]
10.d.edeqprpipfprpqpr.q
[0124]
11.d.edeqprpipfprpqpr.q
[0125]
12.e.iprprprp.q
[0126]
13.e.qprpipfprp.q
[0127]
14.e.dedeqprpipfprpqpr.q
[0128]
15.p.rpipfprpqpr.q
[0129]
16.p.rpipfprpqp.r
[0130]
17.r.qfpfprpph.q
[0131]
18.k.eededeqprpipfprpqpr.q
[0132]
19.d.eqprpipfprp.q
[0133]
20.e.rqfpfprpp.h
[0134]
21.e.egeiprprp.r
[0135]
22.e.ededeqprpipfprpqpr.q
[0136]
23.p.rpipfprpq.p
[0137]
24.d.edeqprpipfprpq.p
[0138]
25.q.fpfprpphq.k
[0139]
26.e.deqprpipf.p
[0140]
27.f.pfprpphq.k
[0141]
28.p.ipfprpqpr.q
[0142]
29.q.fpfprpph.q
[0143]
30.r.pipfprpqpr.q
[0144]
31.e.geiprprp.r
[0145]
32.e.egeiprprprpq.h
[0146]
33.e.egeiprprpr.p
[0147]
34.f.pfprpph.q
[0148]
35.r.qfpfprpph.q
[0149]
36.e.egeiprprp.r
[0150]
37.e.qprpipfprpq.p
[0151]
38.e.geiprprprp.q
[0152]
39.e.deqprpipfprpq.p
[0153]
40.r.qfpfprpphq.k
[0154]
41.p.fprpphq.k
[0155]
42.q.fpfprpp.h
[0156]
43.g.ekeededeqprpipfprpqpr.q
[0157]
44.i.pfprpqpr.q
[0158]
45.q.fpfprpphqk.e
[0159]
46.r.qfpfprpp.h
[0160]
47.e.deqprpipfp.r
[0161]
48.e.geiprprpr.p
[0162]
49.g.eiprprp.r
[0163]
50.p.rpipfpr.p
[0164]
51.r.qfpfprpph.q
[0165]
52.d.eqprpipfprpq.p
[0166]
53.q.derqfpf.p
[0167]
54.f.pfprpp.h
[0168]
55.p.rpipfp.r
[0169]
56.r.pipfprp.q
[0170]
57.s.vikpptde.q
[0171]
58.s.vikpptdeq.q
[0172]
59.e.twnpnnkpf.q
[0173]
60.s.vikpptdeqq.q
[0174]
61.t.wnpnnkpf.q
[0175]
62.l.ietwnpnnkpf.q
[0176]
63.t.wnpnnkpf.q
[0177]
64.e.geqprpfpfprp.r
[0178]
65.e.egqiprprpq.h
[0179]
66.e.egqiprprp.q
[0180]
67.e.egqiprprpq.h
[0181]
68.e.egqiprprpq.h
[0182]
69.f.pfprpr.q
[0183]
70.e.gqiprprpq.h
[0184]
71.e.qipshppr.r
[0185]
82.e.deqipshppr.r
[0186]
73.l.nalepdhrv.e
[0187]
74.e.qipshpprrps.h
[0188]
75.k.thinivvighvdsgk.s
[0189]
76.r.afvhwyvgegmeegefsear.e
[0190]
77.r.afvhwyvgegmeegefsear.e
[0191]
78.r.aavpsgastgiyealelr.d
[0192]
79.p.aaapkap.a
[0193]
80.s.llllap.v
[0194]
81.k.pprgfk.p
[0195]
82.k.lpnpmgqs.s
[0196]
83.m.lppiaf.d
[0197]
84.l.fvfmmi.s
[0198]
85.y.kkihvyli.d
[0199]
86.a.mqhnslsgvst.a
[0200]
87.r.llsttptp.y
[0201]
88.l.pppmlky.h
[0202]
89.k.fppphv.i
[0203]
90.p.kkppvvk.p
[0204]
91.h.iqapvvpp.s
[0205]
92.c.vlllppt.m
[0206]
93.l.kpaappp.r
[0207]
94.p.etflvf.k
[0208]
95.s.tlefnsplp.r
[0209]
96.a.idsraqpr.p
[0210]
97.p.lvlnkppt.l
[0211]
98.f.advyknsehyr.r
[0212]
99.t.pqspffp.l
[0213]
100.d.iskrkkpl.l
[0214]
101.k.leapapidrn.i
[0215]
102.g.gkalnmfl.d
[0216]
103.e.ipsdl.e
[0217]
104.v.lgiet.s
[0218]
105.i.snihyggvn.v
[0219]
106.r.ilei.e
[0220]
107.g.sndgw.g
[0221]
108.l.tdryetne.i
[0222]
109.p.ldfv.l
[0223]
110.r.fdsf.l
[0224]
111.v.tgpf.m
[0225]
112.k.pfppr.p
[0226]
113.t.alspf.d
[0227]
114.p.lvpq.t
[0228]
115.v.lfet.e
[0229]
116.s.slgypa.r
[0230]
117.a.ldallt.y
[0231]
118.g.vfp.k
[0232]
119.t.pgpw.l
[0233]
120.r.pfdl.n
[0234]
121.f.pfp.a
[0235]
122.a.afp.f
[0236]
123.x.avplm.q
[0237]
124.t.vivpt.a
[0238]
125.g.igsi.e
[0239]
126.i.plnhipf.a
[0240]
127.f.adipqkih.v
[0241]
128.f.ivpvinde.e
[0242]
129.e.ydgvpktpt.d
[0243]
130.f.afgl.v
[0244]
131.m.kdnpf.v
[0245]
132.l.ivvpt.c
[0246]
133.k.lvppg.a
[0247]
134.r.tqtnqetgqtiisgmgelhldi ivdr.m
[0248]
135.v.vaditnpf.s
[0249]
136.f.amqr.a
[0250]
137.h.tefi.n
[0251]
138.a.aypf.p
[0252]
139.a.vfpg.g
[0253]
140.t.pripf.v
[0254]
141.e.ptpkdiani.q
[0255]
142.p.ivvrhted.e
[0256]
143.p.vmpg.v
[0257]
144.v.vlpa.m
[0258]
145.l.tlnit.i
[0259]
146.e.pagy.a
[0260]
147.t.igl.c
[0261]
148.i.alipqivne.q
[0262]
149.a.vvi.v
[0263]
150.a.psflrdamlk.i
[0264]
151.h.slikeaavitrldeqg.q
[0265]
152.l.eggastninkllltieviekdlee.n
[0266]
153.q.lapv.p
[0267]
154.m.ttpfk.a
[0268]
155.a.apsflrdamlk.i
[0269]
156.s.lippa.l
[0270]
157.q.vhpw.e
[0271]
158.l.pfyhrk.n
[0272]
159.n.mgfpq.e
[0273]
160.i.tangpl.h
[0274]
161.l.iripa.s
[0275]
162.k.taslq.a
[0276]
163.y.yiv.m
[0277]
164.s.vf.v
[0278]
165.n.imipnkpdh.a
[0279]
166.y.vsgiw.n
[0280]
167.s.iydl.g
[0281]
168.a.ldpsi.l
[0282]
169.r.lyp.t
[0283]
170.l.vlf.g
[0284]
171.y.agappkvkksvydealk.d
[0285]
172.x.al.l
[0286]
173.t.vli.p
[0287]
174.e.tagsfa.a
[0288]
175.i.alipqivneq.g
[0289]
176.e.dvpgealaiara.r
[0290]
177.h.tpig.k
[0291]
178.d.psplkyv.i
[0292]
179.g.lvl.k
[0293]
180.t.lmilaiivvgiivlavfftfvpvmlw.i
[0294]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

技术特征：
10000da发酵产物b、分子量2000da-6000da发酵产物c以及分子量100da-2000da发酵产物d。9.一种根据权利要求8所述的枯草芽孢杆菌发酵分级产物的应用，其中，发酵产物a在制备辅助溶栓的保健食品或治疗溶栓的药品上的应用，发酵产物b在制备提高免疫力的保健食品或药品上的应用，发酵产物c在制备辅助降血压的保健食品或治疗降血压的药品上的应用，发酵产物d在制备辅助降血脂和治疗脂肪肝的保健食品或治疗高血脂和治疗脂肪肝的药品上的应用。

技术总结
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌发酵分级产物的制备方法，包括以下步骤，步骤1)制备发酵培养基；步骤2)将枯草芽孢杆菌菌种接入步骤1)的发酵培养基中；步骤3)将种子液接种到发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；步骤4)菌液分离；步骤5)对发酵液进行分级分离，收集得到不同分子量范围的多种发酵产物，分别为分子量大于10000Da的发酵产物A、分子量6000Da-10000Da的发酵产物B、分子量为2000Da-6000Da的发酵产物C以及分子量为100Da-2000Da的发酵产物D，本发明通过分离工艺技术分步骤、分阶段收集不同分子量范围的组分，得到具有不同功效的四种发酵产物。而且本发明通过分离工艺技术，最终实现透过液经检测水质达到发酵用水标准，可回收用于下批次菌种发酵培养基的配置。用于下批次菌种发酵培养基的配置。用于下批次菌种发酵培养基的配置。


技术研发人员：董艳山 范宇鹏 何瑜林 高雅 廖园园 高丽 王业富
受保护的技术使用者：武汉真福创新生物制药有限公司
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/8/23