检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法的制作方法

检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法
1.本技术是针对中国发明申请号为202210282779.5，申请日为2022年03月22日，发明名称为“一种利用超滤法换算平衡透析下游离物质含量的测定方法”，所提交的分案申请。
技术领域
2.本发明属于游离物质检测技术领域，具体地，涉及检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法。


背景技术：

3.游离的激素在人体中更具有生物学活性，是实现该激素的生物效应的主要部分，目前实现测游离的分析物的分离得方法主要为平衡透析法和超滤法。其中，平衡透析法被认为是测游离分析物的金标准。
4.如中国专利申请公布号cn111498490a，发明名称为“质谱法检测游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素试剂盒”，公开的试剂盒包括：用于平衡透析分离结合态和游离态的三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂；又包括透析液；以及用于通过固相萃取从透析液中提取游离态的三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素的试剂；又包括内标溶液、平衡液、淋洗液和洗脱液。该方案的试剂盒检测时，利用平衡透析法将人血清中游离三碘甲状腺原氨酸和游离甲状腺素转移到透析液中，然后通过固相萃取方法将其从透析液中提取出来；通过超高效液相色谱进行分离后，进入质谱进行检测，利用与校准品的比较得到待测样品的浓度，保障了检测结果准确性。不同浓度的质控品保证了检测结果的可靠性。但平衡透析法所需的时间长，溶液体积会变化，且透析时间过长可能会发生蛋白渗漏现象，由此会造成游离药物比例的显著高估等缺点；存在药物与半渗透膜等试验装置的非特异性结合，可能造成游离药物浓度的低估，进而影响试验结果；存在donnan效应，带电粒子不通过半透膜而产生不均匀的电荷，使两侧粒子浓度不一致。尤其对于高离子化且低蛋白结合的化合物，该效应最为明显。
5.相较于平衡透析法，超滤法可以达到快速分析的要求，如中国专利申请公布号cn114490944a，发明名称为“一种同时测定唾液中游离甲状腺激素t4、rt4、t4和皮质醇的方法”，公开的方法通过超滤离心，并选取合适的截留分子量限制范围的滤膜，去除唾液中的蛋白和结合态的甲状腺激素、皮质醇，再以合适的比例加入甲醇等防吸附试剂，攻克了唾液中游离态t4、rt4、t4和皮质醇检测过程中存在的严重吸附问题。利用高效液相色谱串联质谱分析技术，一次同时精确检测唾液中的游离甲状腺激素t4、rt4、t4和皮质醇四种游离态激素。该方法具有高通量，操作简便，处理效率高，耗材成本低，准确度高和灵敏度高的优点。但超滤法在超滤过程中温度不容易受控制。由于游离的激素浓度随超滤或平衡透析的温度变化，而人体的体温为44℃，在44℃时游离的激素的浓度最能体现人的游离激素的水平及生理活性，而现有的超滤离心机无法快速稳定或无法达到或维持44℃。
6.如上所述，平衡透析法耗时时间长，如血液中游离的激素类物质，一般需要在44℃
恒温箱中孵育至少22h，无法满足临床生物样品快速分析出结果的要求。且传统的平衡透析法由于透析液体积较少，当有些待测物游离的含量较少时，即使富集也难以检出。而采用超滤法得出的超滤液体积更多，又由于超滤液浓度不受体积迁移的影响，在富集浓缩后使检测限得以较大程度的降低，但存在着超滤过程中温度不易控制的缺点。


技术实现要素：

7.1、要解决的问题
8.针对现有高效液相色谱串联质谱技术检测游离睾酮前处理时，采用超滤法处理虽高效快速，但处理过程中温度不易控制，导致测定结果偏差较大，而采用平衡透析法虽测定结果更加精确，但耗时较长，无法满足临床生物样品快速分析结果的要求，本技术提供检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，能够兼顾检测准确度高且耗时短的要求。
9.2、技术方案
10.为达到上述目的，提供的技术方案为：
11.本发明的检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，包括以下步骤：
12.包括使用超滤法从样品中分离游离睾酮，并利用液相色谱串联质谱法测定其浓度的步骤，得第一浓度数据；
13.包括使用平衡透析法从所述样品中分离游离睾酮，并利用液相色谱串联质谱法测定其浓度的步骤，得第二浓度数据；
14.所述第一浓度数据和所述第二浓度数据在不同温度测得；所述第一浓度数据在4444℃测得；所述第二浓度数据在44℃测得；
15.包括利用所述第一浓度数据和第二浓度数据建立线性方程的步骤，通过线性方程计算所述游离睾酮实际浓度，所述样品为多个，其数量足以使得建立的所述线性方程的决定系数大于0.90。
16.进一步的，所述样品为血清或血浆。
17.进一步的，所述超滤法的具体步骤为：在所述样品中加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，所述样品和所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的体积比为1∶4，离心1h，得到超滤液；
18.在所述超滤液中加入内标，混匀后用hlb固相萃取柱萃取，先用10％甲醇水溶液清洗2次，再用90％甲醇水溶液洗脱2次，合并洗脱液，氮气吹干，用50％甲醇水溶液复溶；
19.所述超滤液、内标、10％甲醇水溶液、90％甲醇水溶液和50％甲醇水溶液的体积比为40∶1∶15∶15∶5。
20.进一步的，所述平衡透析法的具体步骤为：将所述样品放入平衡透析板的样品液侧，将4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液放入平衡透析板的缓冲液侧，透析22h，所述样品和所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的体积比为1∶1；
21.在所述透析液中加入内标，混匀后用hlb固相萃取柱萃取，先用10％甲醇水溶液清洗2次，再用90％甲醇水溶液洗脱2次，合并洗脱液，氮气吹干，用50％甲醇水溶液复溶；
22.所述超滤液、内标、10％甲醇水溶液、90％甲醇水溶液和50％甲醇水溶液的体积比为10∶1∶15∶15∶5。
23.进一步的，所述液相色谱串联质谱使用色谱柱为waters acquitybeh c18(2.1
×
50mm,1.4μm)。
24.进一步的，所述离心采用低速冷冻离心机；所述超滤离心管为40kda。
25.进一步的，包括将所述超滤离心管活化的步骤：取100μl 0.1m naoh活化溶液于所述超滤离心管中在2000g条件下离心10min，接着向所述超滤离心管中加入100μl纯水在相同条件下离心10min。
26.进一步的，所述色谱条件：40℃柱温；流动相a为含2mm乙酸铵的0.1％甲酸水溶液；流动相b为甲醇溶液；
27.时间，min流速，ml/min流动相a，体积分数流动相b，体积分数起始0.6009551.200.6005951.400.6005951.410.6009551.600.600955
28.质谱条件：
29.离子源：电喷雾离子源，正离子模式；喷雾电压：5500v；离子源温度：550℃；gs1：50psi；gs2：50psi；气帘气：40psi，采用多级反应监测：
30.分析物母离子，m/z子离子，m/z去簇电压，v碰撞电压，ev睾酮
*
289.4109.14015睾酮289.494.14015睾酮-d4292.2109.14015。
31.进一步的，在所述第一浓度数据为25℃下测得时，所述线性方程为：y＝0.8419x-0.2116。
32.3、有益效果
33.采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：
34.本发明的检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，通过超滤法从样品中分离游离睾酮，检测得第一浓度数据，使用平衡透析法从样品中分离游离睾酮，检测得第二浓度数据，利用所述第一浓度数据和第二浓度数据建立线性方程，进而对超滤法测得的数据进行换算，兼顾检测准确度高且耗时短的要求。利用在常规温度条件下超滤就可测出样品中游离的分析物的浓度，方法操作简单，不受样品稀释和体积迁移的影响。
35.本发明的检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，运用超滤法可以快速的分析血清或血浆中游离的激素的浓度，得到的超滤液也远比平衡透析液多，可降低分析浓度的检测限。
36.本发明的检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，可以用4444℃条件超滤检测44℃理论游离的激素浓度，使温度易于受控，不受体积迁移的影响，使检测结果更可靠。
37.本发明的检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，利用超滤法结合lc-ms/ms测量游离睾酮，传统的平衡透析方法由于透析液体积较少，当有些待测物游离的含量较少时，即使富集也无法检出，而采用超滤法得出的超滤液体积会更多，而且超滤液浓度不受体积迁移的影响，在富集浓缩后使得检测限得以较大程度的降低。
4、附图说明
38.图1是25℃超滤与44℃平衡透析条件下游离睾酮的线性结果。
5、具体实施方式
39.为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。
40.1.实施例中用到的实验材料如下：
41.1.1.对照品及试剂
42.甲醇(hplc级，merck)、乙腈(hplc级，merck)、甲酸(hplc级，aladdin)、乙酸铵(hplc级，aladdin)、氯化钠(ar级，沪试)、磷酸二氢钾(ar级，沪试)、七水硫酸镁(ar级，沪试)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(ar级，沃凯)、尿素(ar级，沪试)、二水氯化钙(ar级，沪试)、氢氧化钠(ar级，沪试)。
43.1.2.实施例中用到的主要仪器设备和耗材如下：
44.色谱柱，acquitybeh c18(2.1
×
50mm,1.4μm)(waters)；
45.漩涡混合器(美国si vortex genie 2)；低速冷冻离心机(中科中佳)；超滤离心管；96孔一次性平衡透析板；十万分之一分析天平(瑞士mettler toledo)；电热恒温培养箱(尚诚仪器)。
46.2.溶液及试剂的配制
47.2.1.4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液的配制
48.精确称取5.26g氯化钠，224mg磷酸二氢钾，245mg七水硫酸镁，12.54g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，400mg尿素，245mg二水氯化钙，900mg氢氧化钠于烧杯中，加入1l的纯水，搅拌均匀，静置后得到4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液。
49.2.2.活化试剂的配制
50.称取400mg氢氧化钠溶于100ml水中配制成0.1m naoh活化溶液。
51.4.装置前处理
52.4.1.超滤管活化
53.取100μl 0.1m naoh活化溶液于超滤管中在2000g条件下离心10min，接着向超滤管中加入100μl纯水在相同条件下离心10min。
54.4.2.固相萃取柱活化
55.分别用1ml甲醇和1ml纯水活化固相萃取柱。
56.实施例
57.本实施例的检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，所述样品为游离睾酮。
58.本实施例的方法，首先选取20℃、25℃、40℃和44℃下4个温度值，分别进行超滤法和平衡透析法分离游离睾酮，实际中可以采用其他的温度值。然后采用高效液相色谱串联质谱检测，结果如表1所示。其中，
59.超滤法采用的具体方案为：
60.超滤：取400μl血清样本，加入900μl 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，用移液枪吹打混匀，然后转移到活化后的超滤管，分别于20℃、25℃、40℃和44℃，2000g离心1h；
61.固相萃取：取600μl超滤液加入20μl内标溶液，涡旋混匀，加到已活化的hlb固相萃取柱，用400μl 10％甲醇水溶液清洗2次，再用400μl 90％甲醇水溶液洗脱2次，合并洗脱
液，氮气吹干，最后用100μl 50％甲醇水溶液复溶。
62.平衡透析法采用的具体方案为：
63.平衡透析：取200μl 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液到平衡透析板的缓冲液侧，取200μl血清样本到样本侧，分别置于20℃、25℃、40℃和44℃条件，透析22h；
64.固相萃取：取200μl超滤液加入20μl内标溶液，涡旋混匀，加到已活化的hlb固相萃取柱，用400μl 10％甲醇水溶液清洗2次，再用400μl 90％甲醇水溶液洗脱2次，合并洗脱液，氮气吹干，最后用100μl 50％甲醇水溶液复溶。
65.所述超滤法和平衡透析法分离出游离睾酮后，均采用以下高效液相色谱串联质谱参数来检测：
66.色谱条件：
67.色谱柱：acquity uplc beh c18(2.1
×
50mm,1.4μm)；柱温：40℃；流动相：体积分数0.1％甲酸2mm乙酸铵水溶液(a)4甲醇(b)，梯度洗脱：
68.时间，min流速，ml/min流动相a，体积分数流动相b，体积分数起始0.6009551.200.6005951.400.6005951.410.6009551.600.600955
69.质谱条件：
70.离子源：电喷雾离子源，正离子模式；喷雾电压：5500v；离子源温度：550℃；gs1：50psi；gs2：50psi；气帘气：40psi，采用多级反应监测：
71.分析物母离子，m/z子离子，m/z去簇电压，v碰撞电压，ev睾酮
*
289.4109.14015睾酮289.494.14015睾酮-d4292.2109.14015
72.在上述lc-ms/ms条件下，游离睾酮测定结果如表1所示：
73.表1同一样品在不同温度下的超滤和平衡透析的游离睾酮检测结果
74.75.表1显示，在多个不同温度条件，游离睾酮采用超滤法和平衡透析法测定结果十分一致，即在相同的温度下，超滤法和平衡透析法的结果一致，则可以通过换算，以44℃平衡透析法为标准，获得不同温度(如于20℃、25℃、40℃等)下超滤法和44℃平衡透析法的换算公式，可实现不同温度(如于20℃、25℃、40℃等)下超滤法换算得到44℃平衡透析或44℃超滤法得到的游离睾酮的浓度。
76.为了便于进一步理解，本实施例仅以25℃超滤法对44℃平衡透析法比对为例(其他温度可以进行类似的比较)，对60个样品(40名女性和40名男性)在25℃超滤法和44℃平衡透析法分别测定游离睾酮的浓度，结果如表2所示，得到的计算公式如图1所示。
77.表2 60个不同血清样品在25℃超滤和44℃平衡透析的游离睾酮的检测结果
[0078][0079]
结果表明采用了60例血清样本，分别在25℃超滤1h和44℃平衡透析22h，得到超滤液(第一浓度)和平衡透析液(第二浓度)测定游离睾酮的浓度，最后得到相关的线性方程，对于游离睾酮，在25℃超滤的结果与44℃平衡透析的结果，最后计算出该条件下游离睾酮的相关线性方程为y＝0.8419x
–
0.2116，r2＝0.9894，n＝60。从决定系数r2大于0.95，说明其有良好的相关性，可用25℃超滤的结果来计算出44℃游离的睾酮浓度，且计算公式如下：
[0080]
25℃超滤第一浓度＝44℃平衡透析第二浓度
×
0.8419
–
0.2116
[0081]
样品浓度＝(第一浓度+0.2116)/0.8419
[0082]
以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，其特征在于：包括以下步骤：包括使用超滤法从样品中分离游离睾酮，并利用液相色谱串联质谱法测定其浓度的步骤，得第一浓度数据；包括使用平衡透析法从所述样品中分离游离睾酮，并利用液相色谱串联质谱法测定其浓度的步骤，得第二浓度数据；所述第一浓度数据和所述第二浓度数据在不同温度测得；所述第一浓度数据在4～37℃测得；所述第二浓度数据在37℃测得；包括利用所述第一浓度数据和第二浓度数据建立线性方程的步骤，通过线性方程计算所述游离睾酮实际浓度，所述样品为多个，其数量足以使得建立的所述线性方程的决定系数大于0.90。2.根据权利要求1所述的检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，其特征在于：所述样品为血清或血浆。3.根据权利要求2所述的检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，其特征在于：所述超滤法的具体步骤为：在所述样品中加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，所述样品和所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的体积比为1∶2，离心1h，得到超滤液；在所述超滤液中加入内标，混匀后用hlb固相萃取柱萃取，先用10％甲醇水溶液清洗2次，再用90％甲醇水溶液洗脱2次，合并洗脱液，氮气吹干，用50％甲醇水溶液复溶；所述超滤液、内标、10％甲醇水溶液、90％甲醇水溶液和50％甲醇水溶液的体积比为30∶1∶15∶15∶5。4.根据权利要求2所述的检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，其特征在于：所述平衡透析法的具体步骤为：将所述样品放入平衡透析板的样品液侧，将4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液放入平衡透析板的缓冲液侧，透析22h，所述样品和所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的体积比为1∶1；在所述透析液中加入内标，混匀后用hlb固相萃取柱萃取，先用10％甲醇水溶液清洗2次，再用90％甲醇水溶液洗脱2次，合并洗脱液，氮气吹干，用50％甲醇水溶液复溶；所述超滤液、内标、10％甲醇水溶液、90％甲醇水溶液和50％甲醇水溶液的体积比为10∶1∶15∶15∶5。5.根据权利要求1-4任一项所述的检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，其特征在于：所述色谱柱为waters acquitybeh c18(2.1
×
50mm,1.7μm)。6.根据权利要求5所述的检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，其特征在于：所述离心采用低速冷冻离心机；所述超滤离心管为30kda。7.根据权利要求6所述的检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，其特征在于：包括将所述超滤离心管活化的步骤：取100μl 0.1m naoh活化溶液于所述超滤离心管中2000g条件下离心10min，接着向所述超滤离心管中加入100μl纯水在相同条件下离心10min。8.根据权利要求7所述的检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，其特征在于：所述色谱条件：40℃柱温；流动相a为含2mm乙酸铵的0.1％甲酸水溶液；流动相b为甲醇溶液；时间，min流速，ml/min流动相a，体积分数流动相b，体积分数起始0.6009551.200.600595
1.400.6005951.410.6009551.600.600955质谱条件：离子源：电喷雾离子源，正离子模式；喷雾电压：5500v；离子源温度：550℃；gs1：50psi；gs2：50psi；气帘气：30psi，采用多级反应监测：分析物母离子，m/z子离子，m/z去簇电压，v碰撞电压，ev睾酮
*
289.3109.14015睾酮289.397.14015睾酮-d3292.2109.14015。9.根据权利要求8所述的检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，其特征在于：在所述第一浓度数据为25℃下测得时，所述线性方程为：y＝0.8719x-0.2116。

技术总结
本发明属于游离物质检测技术领域，涉及检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法。针对现有高效液相色谱串联质谱技术检测游离睾酮，采用超滤法处理虽高效快速，但处理过程中温度不易控制，导致测定结果偏差大，而采用平衡透析法虽温度易控、测定结果更加精确，但耗时长，无法满足临床生物样品要求准确、快速分析结果的技术问题，本申请提供检测游离睾酮的超滤-液相色谱串联质谱法，通过超滤法从样品中分离游离睾酮，检测得第一浓度数据，使用平衡透析法从样品中分离游离睾酮，检测得第二浓度数据，进而利用第一浓度数据和第二浓度计算所述游离睾酮实际浓度，能够兼顾检测准确度高且耗时短的要求。时短的要求。时短的要求。


技术研发人员：江振作 彭军
受保护的技术使用者：合肥歆智医疗器械有限公司
技术研发日：2022.03.22
技术公布日：2023/8/23