用于检测鳜鱼弹状病毒的引物对及其应用、检测方法

1.本发明涉及生物病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于检测鳜鱼弹状病毒的引物对及其应用、检测方法。


背景技术：

2.鳜鱼(siniperca chuatsi)是鲈形目鳜鱼属的一种淡水鱼类，是东亚和东南亚最重要的淡水养殖品种之一。然而，各种病害的频发爆发严重制约了鳜鱼养殖业的健康发展，特别是各种病毒性疾病，由于没有有效的防治办法，一旦发生就造成巨大的经济损失。其中由鳜鱼弹状病毒(siniperca chuatsi rhabdovirus，scrv)引起的鳜鱼弹状病毒病是制约鳜鱼养殖业发展的主要因素之一。scrv于1999年首次在受感染的鳜鱼组织中通过电子显微镜观察到。之后，该病毒被鉴定为scrv。scrv被发现后不久被认为是多种鱼类中具有高死亡率的流行病原体，如大口黑鲈、鲑鲷、笋壳鱼等，这种病毒已经在多种经济鱼类中引起流行病，严重阻碍了水产养殖业的持续发展。
3.目前尚无针对该scrv的有效治疗方法。因此，该病的早期监测和诊断显得尤为重要。目前scrv的检测和鉴定主要采用各种核酸扩增方法，包括常规的pcr、荧光定量pcr等。pcr是scrv的最常用检测方法，大多数pcr检测的目的是扩增保守的scrv主要糖蛋白(g)基因。国内外学者建立了多种scrv的pcr扩增技术。梁红茹等人基于鳜鱼弹状病毒n基因建立了可同时检测传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙病毒和鳜弹状病毒三重pcr检测方法以及taqman荧光定量pcr检测方法。核酸检测技术是目前最常用的检测弹状病毒的方法，但一些核酸检测方法难以使用，需要昂贵的设备和专业技术人员。因此，建立一种便捷、高效、经济的检测方法十分重要。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于，提供一种用于检测鳜鱼弹状病毒的引物对和荧光探针，其检测快速、灵敏、操作简便、设备要求低，且检测结果准确，能有效地区分其他常见病毒。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于检测鳜鱼弹状病毒的引物对和荧光探针，上游引物的核苷酸序列如seq id no：1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no：2所示，荧光探针的核苷酸序列如seq id no：3所示；
6.相应的，本发明还公开了上述的用于检测鳜鱼弹状病毒的引物对和荧光探针在(1)或(2)中的应用：
7.(1)检测鳜鱼弹状病毒；
8.(2)检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒。
9.相应的，本发明还公开了一种试剂盒，用于检测鳜鱼弹状病毒，其包括上述的引物对和荧光探针。
10.作为上述技术方案的改进，还包括标准阳性对照品、标准阴性对照品、缓冲液、重
组酶、聚合酶、单链dna结合蛋白和水；
11.所述标准阴性对照品为水，所述标准阳性对照品为含有鳜鱼弹状病毒序列的核酸。
12.其中，缓冲液可为tris-hcl、peg水溶液(peg可选用peg2000，但不限于此)、二价阳离子溶液(如mg
2+
、zn
2+
等)、一价水离子溶液(如na
+
、k
+
、nh
4+
)等，但不限于此。
13.其中，重组酶可为：
14.其中，聚合酶可为本领域常见的taq或pfu，但不限于此。
15.需要说明的是，上述缓冲液、重组酶、聚合酶、单链dna结合蛋白可单独提供，也可以预混液的方式提供，例如杭州众测生物科技有限公司生产的型号为荧光rt-rpa的预混液，或安普未来(常州)生物科技有限公司生产的型号为rna恒温扩增试剂盒的预混液，但不限于此。
16.作为上述技术方案的改进，所述上游引物、所述下游引物的浓度为0.4μm，所述荧光探针的浓度为0.12μm；
17.所述缓冲液选用质量浓度为10％的peg溶液和280mm乙酸镁水溶液。
18.相应的，本发明还公开了一种鳜鱼弹状病毒的检测方法，其包括以下步骤：
19.提取待检测样品，制备rna模板；
20.采用上述的引物对和荧光探针对所述rna模板进行扩增，并读取荧光值；
21.根据所得荧光值对所述待测样品进行特异性鉴别。
22.需要说明的是：本发明中的引物对、荧光探针不仅可适用于采用实时荧光进行检测，还可采用电泳检测、测流试纸检测，但不限于此。
23.其中，待检测样品为鳃粘液、肝脏、脾脏、肾脏、鳃等内脏组织，但不限于此。具体的，当待检测样品为肝脏、脾脏、肾脏、鳃等内脏组织时，将组织剪碎后，用研磨钵进一步处理，通过使用rna提取试剂盒进行核酸抽提。
24.作为上述技术方案的改进，根据所得荧光值对所述待测样品进行特异性鉴别的步骤包括：
25.如果在扩增20分钟后的有效时间范围内，扩增曲线与背景的偏差≥三个半标准差(3.5sd)，则待测样品为含有鳜鱼弹状病毒；
26.如果在扩增20分钟后的有效时间范围内，扩增曲线与背景的偏差＜三个半标准差(3.5sd)，则待测样品不含有鳜鱼弹状病毒或包含其他感染源。
27.作为上述技术方案的改进，所述其他感染源包括鲤疱疹病毒ⅱ型、锦鲤疱疹病毒、鲤春病毒血症病毒、罗湖病毒、传染性脾肾坏死病毒、大鲵虹彩病毒中的一种或多种。
28.作为上述技术方案的改进，扩增的反应体系包括：10％ peg 25μl，ddh2o12.9μl，上游引物2μl，下游引物2μl，荧光探针0.6μl，rna模板5μl，280mm乙酸镁水溶液2.5μl；
29.扩增的反应程序包括：在37～45℃下反应5～20min。
30.作为上述技术方案的改进，扩增的反应程序为：在42℃反应25min。
31.实施本发明，具有如下有益效果：
32.与现有技术相比，本发明提供了一种实时荧光rt-rpa方法检测鳜鱼弹状病毒的引物对、荧光探针、试剂盒和相应的检测方法。本发明的检测方法检测快速、灵敏、操作简便。具体的，本发明只需在37～45℃下反应5～20min便可分析结果，不需要复杂的反应程序；且
可用于便携式基因扩增设备，适用于野外、现场检测和大规模筛选。此外，本发明提供的引物对和荧光探针的特异性强，灵敏度高，能准确地检测到鳜鱼弹状病毒，且检测结果稳定，重复性好；可实现单管现场快速检测鳜鱼弹状病毒，全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性。
附图说明
33.图1为实施例1中引物的筛选结果图，其中，m为dl500的dna分子量标准，1～10分别为b1f/r-b10f/r10对引物对的扩增结果；
34.图2为实施例2特异性试验结果图；
35.图3为实施例2中敏感性试验结果图；其中，1～6分别为rna模板浓度为10.4
×
106fg/μl～10.4
×
101fg/μl；
36.图4为实施例2中敏感性试验半对数回归分析结果图；
37.图5是实施例2中敏感性试验中核酸浓度对数与tt值回归分析结果图。
具体实施方式
38.为了克服现有技术检测鳜鱼弹状病毒的缺陷，突破现有技术对人员、场所的限制，缩短检测用时，同时提升检测设备的便携式和便捷化程度，实现对患病鱼的快速诊断和疑似scrv携带鱼的现场快速筛查，本发明提供了一种鳜鱼弹状病毒的重组酶聚合酶恒温扩增快速检测方法及试剂盒。
39.重组酶恒温扩增技术作为在恒定温度条件下反应的新型核酸体外扩增技术，其具有冻干粉形式易于运输、灵敏度高、特异性强、反应时间快、操作简单等优点。这种重组酶恒温扩增技术填补了传统培养和依赖温变设备技术外的空缺，能在养殖场现场和非实验室环境实现即时检测。rpa技术能在恒定或较宽温度范围内，通过30min左右自动循环的动态环境，可实现微量核酸在体外高效快速扩增，再由端点检测法对扩增产物进行检测，即可得到理想检测结果。
40.为能清楚说明本方案的技术特点，下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中的所用技术手段是本领域技术人员所熟知的常规技术手段。
41.本发明中所采用的主要实验材料、仪器、试剂等如下：
42.1主要仪器及耗材
43.恒温荧光检测仪购自广州双螺旋基因技术有限公司；实时荧光定量pcr仪quantstudiotm5购自美国applied biosystems公司；电泳仪和凝胶成像分析系统购自美国bio-rad公司；台式高速冷冻型微量离心机、台式冷冻高速离心机购自biobase公司；各种规格的移液枪购自大龙兴创实验仪器(北京)股份公司，无菌0.2ml、0.5ml、1ml以及1.5ml离心管购自上海科进生物技术有限公司。
44.2主要试剂
45.rt-rpa核酸扩增试剂(荧光型)试剂盒购自杭州众测生物科技有限公司，总rna提取试剂(omega)盒购自广州飞扬生物工程有限公司；病毒dna/rna提取试剂盒及pcr产物纯
化试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；其它所需试剂由本实验室提供。
46.3主要菌毒株
47.鳜鱼弹状病毒(scrv)、鲤疱疹病毒ⅱ型(cyhv-2)、锦鲤疱疹病毒(khv)、鲤春病毒血症病毒(svcv)、罗湖病毒(tilv)、传染性脾肾坏死病毒(isknv)、大鲵虹彩病毒(gsiv)的dna或rna均由本实验室制备并保存。
48.实施例1引物对、探针的设计
49.根据genebank中登录的scrv的g基因序列(nc_008514.1)，参照rpa指导说明，进行重组酶特有引物和探针设计。rpa核酸扩增技术对于引物设计与常规pcr引物设计有一定的区别，有两条寡核苷酸组成一对引物，分别特异性识别一个核酸目标物的上下游核苷酸序列；长度在30～35核苷酸(nt)之间，序列中无回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构区；引物tm值不作为设计时主要考虑因素；最佳引物对需通过试验优化筛选出。探针设计序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46～52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续地重复碱基；共有四个修饰位点，距离5’端的≥35nt的中部位置标记一个四氢呋喃(thf)，作为核酸外切酶的识别位点；thf位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个淬灭基团，两个基团的间距为2～4nt；thf距离3’末端≥l5nt，并且3’末端标记一个修饰基团。
50.参照rpa引物探针的设计原则，设计并合成rpa引物及rpa-exo探针，所有引物和探针由上海生物工程技术服务有限公司合成。本次研究经分析筛选出10对引物和1条探针，参见表1；然后对10对引物的扩增效率进行比较，从而筛选出最佳引物对b6f/r，参见图1。
51.表1rt-rpa引物和探针序列
52.[0053][0054]
实施例2检测方法的建立
[0055]
一、待测样品的准备及rna模板提取
[0056]
(1)待检测样品的采集与预处理：待检测样品为鳃粘液、肝脏、脾脏、肾脏、鳃等内脏组织。当待检测样品为肝脏、脾脏、肾脏、鳃等内脏组织时，将组织剪碎后，用研钵进一步处理，通过使用rna提取试剂盒进行核酸抽提。
[0057]
(2)rna模板的提取：取预处理后的待检测组织样品，用rna提取试剂盒(omega)提取病毒核酸备用。
[0058]
二、检测
[0059]
(1)序列对及荧光探针
[0060]
所采用的上游引入如表1的b6f，下游引物如表b6r，荧光探针如表1的probe。
[0061]
(2)标准阳性对照品的构建
[0062]
通过对scrv病毒液提取rna，测浓度以确定标准品浓度，初始浓度为10.4
×
106fg/ul。
[0063]
(3)荧光rt-rpa扩增
[0064]
具体的反应体系如下表所示：
[0065]
表2荧光rt-rpa扩增体系
[0066][0067]
将反应体系混合均匀，然后在恒温荧光检测仪上进行扩增。具体扩增程序如下：反应温度42℃，反应时间25min。
[0068]
(4)分析判断：
[0069]
根据扩增产物的荧光值(ct值)进行判断，具体如下：
[0070]
如果在扩增20分钟后的有效时间范围内，扩增曲线与背景的偏差≥三个半标准差，则待测样品为含有鳜鱼弹状病毒；
[0071]
如果在扩增20分钟后的有效时间范围内，扩增曲线与背景的偏差＜三个半标准差，则待测样品不含有鳜鱼弹状病毒或包含其他感染源。
[0072]
实施例2方法学验证
[0073]
1、特异性
[0074]
为了确定该方法的特异性，选取cyhv-2、khv、svcv、tilv、isknv和gsiv共6种鱼类常见病原的rna或者的dna为模板与scrv同时进行扩增反应，用量为5μl，进行实时荧光rt-rpa检测，评价该方法的特异性，同时设立ddh2o为阴性对照，试验结果见图2。通过图2可见，随着反应时间推移，反应10min后，scrv阳性荧光强度明显升高，相比之下，其他病毒阳性rna或dna测得的荧光强度无明显升高变化，说明本方法可以特异性扩增scrv核酸，可用于scrv的特异性检测。
[0075]
2、敏感性试验
[0076]
为了确定实时荧光恒温扩增方法的最小检出量，以scrv病毒液提取的rna为模板，初始浓度为10.4ng/μl，分别按照10倍倍比稀释至6个浓度，即10.4
×
106fg/μl～10.4
×
101fg/μl共六个浓度梯度的模板，利用最佳反应条件进行检测，并用于评价scrv实时rt-rpa荧光试验的检测限。每份稀释液重复评价8次。使用prism 5.0软件(graphpad，usa)，通过绘制阈值时间与log10标准对数的曲线，进行半对数回归。为了确定rt-rpa技术的分析灵敏度，使用prism5.0软件(graphpad，usa)进行概率单位回归。
[0077]
结果如图3所示，实时荧光rt-rpa方法可在20min内检测出scrv，使用八次运行的结果进行概率回归分析，以确定准确的检测限，结果表明荧光rt-rpa可以以95％的概率检测87.7fg/μl，检测限为87.7fg/μl，如图4所示，使用灵敏度测试结果中的数据进行半对数回归分析。在核酸浓度对数与scrv-g的tt值之间存在显著的线性关系，其中r2＝0.9787，如图5所示。
[0078]
3.重复性试验
[0079]
为验证荧光定量rt-rpa检测结果的可重复性，选取10.4
×
105fg/μl、10.4
×
103fg/μl的核酸样本、以及三个临床阳性样本，以50μl体系重复扩增5次，试验结果如表3所示，两个标准稀释液和三个临床样品的c.v.值均小于5％，这表明rt-rpa分析是可重复和精确的。
[0080]
表3五个重复实验的tt值的平均值、sd、c.v.
[0081][0082]
实施例3荧光rt-rpa和实时pcr对临床样品的检测比较
[0083]
本实验于2022年在广东佛山鳜鱼养殖场收集了32份鳜鱼临床组织样品进行盲检。采用实时荧光rt-rpa、文献中报道的qpcr方法(梁红茹等，鳜弹状病毒taqman荧光定量pcr检测方法的建立及应用，中国预防兽医学报，2019年)对这32份样品同时进行鉴定，比较两种方法的检测效果。由表4可以看出，32份临床样品中，实时荧光rt-rpa检出scrv阳性的样品为8份，阳性率为25％，这8份临床样品的检测结果与荧光定量pcr结果一致；而荧光定量pcr的scrv阳性样品为9份，阳性率为28.12％，其中有一临床样品实时荧光rt-raa方法漏检了，通过荧光定量pcr结果表明，该份样品为阳性。实时荧光raa与荧光定量pcr和病毒分离相比，诊断敏感性分别为88.9％，诊断特异性均为100％。由此可见，本发明的实时荧光rt-rpa方法检测结果可靠、用时最短，操作最简单。
[0084]
表4 2种方法对临床样品检测结果
[0085][0086]
实施例4检测试剂盒的制备
[0087]
该试剂盒的制作和操作流程是基于rpa检测技术。试剂盒含有特异性扩增引物和探针，其中引物序列为seq id no：1和seq id no：2，探针序列为seq id no：3。引物的终浓度分别为0.4μm，探针的终浓度为0.12μm，试剂盒还有相应的rt-rpa基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液，如10％peg，乙酸镁溶液，重组酶、聚合酶和单链dna结合蛋白的冻干酶制剂，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的。另外还可以有阳性对照品和阴性对照，阳性对照品应当在扩增过程中能够完全扩增出引物对应的靶向基因片段；阴性对照品为ddh2o。此试剂盒的价值在于样本包括鱼的鳃粘液、肝脏、脾脏、肾脏、鳃等内脏组织，通过最精简和特异的引物及探针检测，采用重组酶扩增技术对鳜鱼弹状病毒特异性核酸进行快速准确的扩增和识别，不仅稳定，检测方便、精确，大大提高病毒诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂
盒投入生产实践，可以简化操作步骤，缩短检测时间，减少检测人员的操作时间，提高检测效率，适用于大规模的筛选。相关引物及探针信息见本说明书中的表1部分中的bf6/r6和probe。
[0088]
以上所述的仅为本发明一种较佳实施例而已，不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

技术特征：
1.一种用于检测鳜鱼弹状病毒的引物对和荧光探针，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如seq id no：1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no：2所示，荧光探针的核苷酸序列如seq id no：3所示。2.如权利要求1所述的用于检测鳜鱼弹状病毒的引物对和荧光探针在(1)或(2)中的应用：(1)检测鳜鱼弹状病毒；(2)检测鳜鱼弹状病毒的试剂盒。3.一种试剂盒，用于检测鳜鱼弹状病毒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物对和荧光探针。所述试剂盒还包括a buffer，b buffer，重组酶、聚合酶和单链dna结合蛋白的冻干粉制剂。其中a buffer为10％peg溶液，bbuffer为280mm的乙酸镁溶液。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括标准阳性对照品、标准阴性对照品、缓冲液、重组酶、dna聚合酶、单链dna结合蛋白和水；所述标准阴性对照品为水，所述标准阳性对照品为含有鳜鱼弹状病毒序列的核酸。5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物、所述下游引物的浓度为0.4μm，所述荧光探针的浓度为0.12μm；所述缓冲液选用质量浓度为10％的聚乙二醇溶液和280mm的乙酸镁水溶液。6.一种鳜鱼弹状病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待检测样品，制备rna模板；采用如权利要求1所述的引物对和荧光探针对所述rna模板进行扩增，并读取荧光值；根据所得荧光值对所述待测样品进行特异性鉴别。7.如权利要求6所述的鳜鱼弹状病毒的检测方法，其特征在于，根据所得荧光值对所述待测样品进行特异性鉴别的步骤包括：如果在扩增20分钟后的有效时间范围内，扩增曲线与背景的偏差≥三个半标准差，则待测样品为含有鳜鱼弹状病毒；如果在扩增20分钟后的有效时间范围内，扩增曲线与背景的偏差＜三个半标准差，则待测样品不含有鳜鱼弹状病毒或包含其他感染源。8.如权利要求7所述的鳜鱼弹状病毒的检测方法，其特征在于，所述其他感染源包括鲤疱疹病毒ⅱ型、锦鲤疱疹病毒、鲤春病毒血症病毒、罗湖病毒、传染性脾肾坏死病毒、大鲵虹彩病毒中的一种或多种。9.如权利要求7所述的鳜鱼弹状病毒的检测方法，其特征在于，扩增的反应体系包括：10％peg 25μl，ddh2o 12.9μl，上游引物2μl，下游引物2μl，荧光探针0.6μl，rna模板5μl，乙酸镁水溶液2.5μl；扩增的反应程序包括：在37～45℃下反应5～20min。10.如权利要求6所述的鳜鱼弹状病毒的检测方法，其特征在于，扩增的反应程序为：在42℃反应25min。

技术总结
本发明公开了用于检测鳜鱼弹状病毒的引物对和荧光探针及其应用、检测方法，涉及生物病毒检测技术领域。其中，引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明的检测方法检测快速、操作简便，特异性好，敏感度高，适用于养殖场现场快速检测。于养殖场现场快速检测。于养殖场现场快速检测。


技术研发人员：王耀达 曾伟伟 胡天美 王宇辉 崔泓烨 靳育琦 孙冬丽 麦倩仪 刘伟强
受保护的技术使用者：佛山科学技术学院
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/8/23