一株医院不动杆菌及其培养方法和应用

1.本发明属于生物工程领域，涉及一株菌株，特别是指一株医院不动杆菌及其培养方法和应用。


背景技术：

2.烟草工业企业目前普遍存在库存大量低等级烟叶，低等级烟叶除了香气质差、杂气较重、刺激性较大之外，普遍存在的品质缺陷为香味淡弱和风格特征不强，无法进入卷烟中高档产品生产，有效利用低等级烟叶已经成为行业亟需解决的重大问题。烟草是一种叶用非食性的特殊经济作物，其吸食品质基本上决定了它的利用价值或可用性，而发酵是烟叶吸食品质形成过程中的重要环节，微生物影响着烟叶的香味品质，烟叶表面存在大量微生物，烟草源微生物处理烟叶可以起到改善烟叶品质的作用，利用这些微生物处理烟叶进行发酵产香，从而达到降低低等级烟叶杂气、提高香气和甜感，提高烟叶可用性的目的。专利cn113755384a、专利cn101818123a和专利cn108741208a等均公开了不同种的不动杆菌，但是其降解烟草产生的香料物质品种多样，可知不同种的不动杆菌在发酵烟草中所起的作用并不能一概而论，本技术在意外发现了一株医院不动杆菌，并对其功能进行了深入研究。


技术实现要素：

3.本发明提出一株医院不动杆菌及其培养方法和应用，解决了低等级烟叶发酵中烟草杂气多、香气和甜感差的技术问题。
4.本发明的技术方案是这样实现的：一种医院不动杆菌，其分类名为acinetobacter nosocomialis，于2023年5月22日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏的编号为cgmcc no.27403，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，电话：010-64806086。
5.上述医院不动杆菌的菌株在lb固体培养基平板上表现为中心凸起，直径约2 mm的奶白色圆状，菌体湿润粘稠有光泽、不透明且无菌丝。
6.医院不动杆菌的培养方法，步骤如下：将医院不动杆菌菌液按1%的接种量，接种至lb液体培养基中，该菌在培养条件温度30℃，转速120 rpm，培养12 h即可。
7.所述lb液体培养基配方为：蛋白胨10 g/l，氯化钠10 g/l，酵母粉5 g/l，lb固体培养基配方为：蛋白胨10 g/l，氯化钠10 g/l，酵母粉5 g/l，琼脂20 g/l。
8.一种菌制剂，所述菌制剂为医院不动杆菌的悬浮液，制备方法为：1）将医院不动杆菌活化培养，得到医院不动杆菌活化液；菌株活化条件为：30℃、150 r/min条件下震荡培养12 h；2）将步骤1)中所得的活化液稀释涂布到lb固体培养基，于30℃恒温培养箱中培养2-3 d，得到菌株单菌落；3）挑取步骤2)所得的单菌落，接种到lb液体培养基，于30℃、150 r/min条件下震荡培养至od600nm值为0.8~1.0，得到种子液；
4）将步骤3)中所得的种子液在4℃、10000 rpm/min条件下进行高速离心8 min，弃上清液，等量无菌水复溶，重复离心，双倍无菌水复溶，得到菌制剂；上述悬浮液中医院不动杆菌的浓度为1.87
×
108~2.82
×
108cfu/g。
9.上述的菌制剂在发酵复烤后的烟叶的的应用。
10.上述的菌制剂在提高烟叶中中性香味成分含量中的应用，其中中性香味成分为茄酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮a、巨豆三烯酮b和巨豆三烯酮c中的一种或多种。
11.上述的菌制剂作为发酵菌株在复烤后烟叶发酵中发挥作用。
12.待发酵烟叶为低等级烟叶时发酵效果更明显。
13.步骤为：
①
将菌制剂按处理菌量为1.87
×
108~2.82
×
108cfu/g将悬浮液均匀喷洒至烟叶上，保持喷洒后烟叶水分为26~29%，于30~37℃、60%~80%相对湿度的恒温恒湿箱中发酵12~30 h。
14.②
将步骤
①
中发酵好的烟叶于175℃灭菌烘干至12%水分，卷制成烟支后于22
±
2℃、60%
±
2%相对湿度的恒温恒湿箱中平衡48 h，采用对比评吸法进行感官评吸；
③
将步骤
②
中发酵好的烟叶于40℃烘箱烘干2 h，粉碎成粉末，过40目分样筛，采取涡旋冷萃提取香味成分。
15.本发明具有以下有益效果：1、本技术的医院不动杆菌可作为发酵菌株在复烤后烟叶发酵中发挥作用，降低烟叶杂气、提高香气和甜感，能明显改善卷烟的吸食品质。
16.2、利用本技术的医院不动杆菌通过微生物代谢作用，降低烟叶杂气、提高香气和甜感，感官评吸及gc-ms分析结果都显示较好，通过感官评吸后发现，评吸总分提高了2.69分，烟叶的杂气降低，香气得到提高，甜感增加；gc-ms分析中性香味成分后发现茄酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮a、巨豆三烯酮b、巨豆三烯酮c、等香味成分含量都有所提高，分别提高30.55%、45.58%、34.59%、45.71%、47.78%。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为该医院不动杆菌的平板图。
19.图2为该医院不动杆菌的电镜图。
20.图3为该医院不动杆菌的系统进化树分析图。
21.图4为该医院不动杆菌的生长曲线。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发
明保护的范围。
23.实施例1一株医院不动杆菌的鉴定和保藏：将初烤后烟叶样品加入无菌水振荡培养12 h，获得的富集微生物菌液在含有胡萝卜素（0.5 g/l）和烟碱（0.1 g/l）的再造烟叶浓缩液中培养24 h，按一定的梯度稀释后涂布到lb固体培养基，于30 ℃恒温培养箱中培养2～3 d，挑取平板上的单菌落，采用平板划线法进行纯化，接种到lb液体培养基，于30 ℃，150 r/min恒温摇床培养12 h，获得种子液。将种子液按1%接种量接种到质量分数50%的再造烟叶浓缩液中，于30 ℃，150 r/min恒温摇床培养24 h，利用嗅闻再造烟叶浓缩液的香味变化，筛选得到香味变化最明显的目标菌株。
24.使用dna抽提试剂盒提取目标菌株基因组dna，pcr扩增反应使用的引物(27f 和 1492r)由上海生物工程有限公司合成；对目标菌株进行16s rdna测序，测序由上海生物工程有限公司完成。将获得的基因序列在ncbi genebank 中利用blast软件进行序列比对，依据同源序列相似性对目标菌株进行菌种鉴定。使用mega5.1软件依据16s rdna测序结果，采用neighbor-joining算法构建系统进化树，如图3所示，命名为sd-1，属于医院不动杆菌。
25.将分离得到的医院不动杆菌涂布到lb固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养24 h，观察其菌落形态如图1所示；使用冷冻型高分辨率场发射扫描电镜观察菌株形态，如图2所示。可知本技术的医院不动杆菌的菌株在lb固体培养基平板上表现为中心凸起，直径约2 mm的奶白色圆状，菌体湿润粘稠有光泽、不透明且无菌丝。
26.将医院不动杆菌斜面保存，寄送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏。所述医院不动杆菌已于2023年5月22日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类名为：acinetobacter nosocomialis，其保藏的编号是cgmcc no.27403，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，电话：010-64806086。
27.实施例2一株医院不动杆菌的培养方法和菌剂的制备：将医院不动杆菌活化培养，得到活化液，将活化液按照一定的梯度稀释后涂布到lb固体培养基，于30℃恒温培养箱中培养2-3 d菌种的生长曲线如图4所示，挑取平板上的单菌落，接种到lb液体培养基，于30℃，150 r/min恒温摇床培养12 h，获得种子液，将种子液按1%接种量接种到lb液体培养基中，于30℃，150 r/min恒温摇床培养至od600nm值为0.8~1.0，将菌液于4℃、10000 r/min离心10 min，弃上清液，等量无菌水复溶，重复离心，双倍无菌水复溶，即得菌制剂。
28.应用例将菌制剂按照处理菌量为1.87
×
108~2.82
×
108cfu/g将菌制剂均匀喷洒于烟丝表面，保持处理水分为26~29%，置于温度为30~37℃，相对湿度为60%~80%的恒温恒湿箱中发酵8~36 h，用同等量的无菌水按照上述方法处理等量烟丝，制备对照烟叶样品。
29.1、感官评吸将发酵后的烟丝于175℃电热烤箱灭菌烘干至水分为12%，卷制成烟支后于温度为22
±
2℃、相对湿度为60%
±
2%恒温恒湿箱中平衡48 h，参照gb 5604.4—2005《卷烟第4部分:感官技术要求》，组织专业评吸人员评吸，评吸人数不少于7个人，采用对比评吸法进行
感官质量评价，结果如表1所示。
30.表1由表1可知，烟丝的香气、杂气、刺激性及余味等得分均有提高，评吸总分较对照提高了2.69分，经发酵后烟叶的杂气降低，香气得到提高，甜感增加。
31.2、中性香味成分分析采取涡旋冷萃法提取烟丝发酵前后的香味成分。按照最优发酵条件处理后，分别设置0 h、8 h、16 h、24 h、36 h五组不同发酵时间样品，每组设三个平行，发酵后的烟丝于40℃烘箱烘干2 h，粉碎成粉末过40目分样筛，向离心管中加入2 g烟末、10 ml的pbs（h2po428 g/l、二水nah2po4100 g/l），2500 r/min涡旋5 min，充分混匀后静置5 min，加入10 ml色谱级乙腈和50 μl的0.2096 mg/ml的2，6-二氯甲苯内标，2500 r/min涡旋20 min，
ꢀ‑
20℃冷冻30 min，加入1.5 gnacl和6 g无水mg2so4，快速摇匀，加入5 ml二氯甲烷，2500 r/min涡旋10 min，于4℃、10000 r/min的冷冻离心机离心3 min，取上清液于60℃电热恒温水浴锅常压浓缩至1 ml，经0.22
ꢀµ
m有机微孔滤膜过滤，进行gc-ms分析检测，结果取平均值，如表2所示。
32.色谱条件：agilent 19091s-436色谱柱（60 m
×
250 μm
×
0.25 μm）；进样口温度280℃；进样量1 μl；不分流；流速1 m l/min；升温程序为初始温度50℃，以5℃/min升温至120℃，保持10 min；以4℃/min升温至180℃，保持10 min；0.6℃/min升温至210℃，保持0 min；4 ℃/min升温至280 ℃，保持0 min。
33.质谱条件：电离方式为电子轰击离子源(ei)，电离能量70ev，四极杆温度150℃，溶剂延迟8min，全扫描检测，扫描范围35～550 amu。
34.表2
由表2可知，发酵后烟叶中的茄酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮a、巨豆三烯酮b、巨豆三烯酮c等典型香味成分含量都有所提高，分别提高30.55%、45.58%、34.59%、45.71%、47.78%。
35.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1. 一种医院不动杆菌，其分类名为acinetobacter nosocomialis，于2023年5月22日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏的编号为cgmcc no. 27403，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.权利要求1所述的医院不动杆菌的培养方法，其特征在于，步骤为：将医院不动杆菌菌液按一定的接种量，接种至lb液体培养基中进行培养。3.根据权利要求2所述的医院不动杆菌的培养方法，其特征在于：所述接种量为1%。4. 根据权利要求2所述的医院不动杆菌的培养方法，其特征在于：所述培养的条件为温度30℃，转速120 rpm，时间为12 h。5. 根据权利要求2所述的医院不动杆菌的培养方法，其特征在于，所述lb液体培养基的配方为：蛋白胨10 g/l，氯化钠10 g/l，酵母粉5 g/l，lb固体培养基配方为：蛋白胨10 g/l，氯化钠10 g/l，酵母粉5 g/l，琼脂20 g/l。6.一种菌制剂，其特征在于：所述菌制剂为权利要求1所述的医院不动杆菌的悬浮液。7. 根据权利要求6所述的菌制剂，其特征在于：所述悬浮液中医院不动杆菌的浓度为1.87
×
10
8 ~2.82
×
108cfu/g。8.权利要求6所述的菌制剂在发酵复烤后的烟叶的的应用。9.权利要求6所述的菌制剂在提高烟叶中中性香味成分含量中的应用，其中中性香味成分为茄酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮a、巨豆三烯酮b和巨豆三烯酮c中的一种或多种。10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，步骤为：将菌制剂喷洒到烟叶上，保持喷洒后烟叶水分为26~29%，于30~37℃、60%~80%相对湿度的恒温恒湿箱中发酵12~30 h，发酵好的烟叶于175℃灭菌烘干至12%水分，用于卷制成烟。

技术总结
本发明属于生物工程领域，涉及一株菌株，特别是指一株医院不动杆菌及其培养方法和应用。所述医院不动杆菌已于2023年5月22日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏的编号是CGMCC NO.27403该菌可作为发酵菌株在复烤后烟叶发酵中发挥作用。本申请的医院不动杆菌发酵低等级烟叶可以增加烟叶中的茄酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮a、巨豆三烯酮b、巨豆三烯酮c等香味物质含量，能明显降低烟叶杂气、提高香气和甜感。提高香气和甜感。提高香气和甜感。


技术研发人员：毛多斌 黄申 陈丽娟 石栋栋 胡慧博 杨鹏飞 白冰
受保护的技术使用者：郑州轻工业大学
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/8/24