lncRNACASC15作为肝纤维化生物标志物的应用的制作方法

lncrna casc15作为肝纤维化生物标志物的应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物医药技术领域，尤其涉及lncrna casc15作为肝纤维化生物标志物的应用。


背景技术：

2.肝纤维化是多种慢性肝病进展至肝硬化的中间过程，其严重的并发症影响着慢性肝病患者的长期预后及生存质量。虽然肝纤维化的病理过程是可逆的，但目前在临床上尚无明确的抗纤维化治疗方法，肝纤维化一旦进展到肝硬化阶段则不可逆转。肝纤维化的早期诊断和及时正确的治疗，直接影响肝纤维化患者的预后。因此，探究一种新型高灵敏度和高特异度的肝纤维化诊断生物标志物及治疗靶点，提高肝纤维化的早期诊出率，是近年来关注的热点和难点。
3.人类基因组中有超过70％的核酸序列能够被转录成rna，其中绝大多数是非编码rna。在众多非编码rna中，长链非编码rna(long non-coding rna，lncrna)是备受关注的一类长度大于200个核苷酸的非编码rna分子，具有特定的空间结构和高度保守的序列元件，广泛存在于生物体内各种组织细胞中。虽然lncrna并不编码任何蛋白质，但它们的表达在不同发育阶段及不同组织中依然具有时空特异性，这说明lncrna有着重要的生物学功能。研究表明，lncrna可通过顺式或反式作用方式从表观遗传、转录、转录后等多个层次来调控编码蛋白基因的表达，从而广泛参与诸如细胞增殖、迁移、分化、衰老、死亡、细胞能量代谢、细胞周期调控等各种生物学过程。有文献报道显示，异常表达的lncrna与人类肝纤维化疾病进程密切相关，lncrna分子在肝纤维化的发生发展过程中发挥十分关键的作用，并逐渐成为临床肝纤维化诊断、治疗、预后的全新靶点。
4.早期肝纤维化通常缺乏明显的临床体征，主要通过病理学检查、影像学检查和实验室检查来获得早期诊断。其中，肝活检病理检查作为肝纤维化诊断传统意义上的“金标准”，为有创操作，存在取样误差、判读误差和可重复性差等缺陷；而影像学检查无法对肝纤维化进行确诊，更难于准确判断肝纤维化的严重程度，故仅作为一种辅助诊断。实验室诊断主要是血清学检查。截至目前，尚无单一血清学指标可准确诊断并判断肝纤维化的发展，临床用于诊断慢性肝炎肝纤维化的血清学指标主要依靠肝纤四项即肝纤维化四项检查，包括ⅲ型前胶原(piiinp)、iv型胶原(c-iv)、透明质酸(ha)、层粘连蛋白(ln)。然而，肝纤四项受到肝脏炎症的影响较大，故其临床特异性和敏感性均不够高，逐渐成淘汰之势。基于lncrna在纤维化肝组织中的异常表达及生物学功能，确定新型lncrna作为肝纤维化诊断生物标志物及治疗靶点并探究lncrna在肝纤维化进展中的生物学调节功能，对于肝纤维化的诊断及治疗具有潜在的临床意义。
5.目前有研究显示lncrna casc15在肝癌组织中表达上调。肝纤维化与肝癌是两种不同的疾病，在影像学、病因学、血清学、分子机制等方面均有着显著的差异。影像学上，肝纤维化发展到一定程度可引起肝脏弥漫性病变，而肝癌典型的影像学表现则是肝脏局部占位性病变，两者不相同；病因学上，肝纤维化常见病因有病毒性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝
病、遗传代谢性肝病、慢性药物性肝炎等，而肝癌则与这些疾病不同、有着独特的临床表现；作用机制上，肝纤维化的本质是细胞外基质(extracellular matrix,ecm)合成与降解失衡，导致胶原纤维广泛沉积于肝组织，肝脏受损后肝实质与非实质细胞会分泌大量细胞因子，进一步激活肝星状细胞(hepatic satellite cell，hsc)使之转化为肌成纤维样细胞，导致ecm合成大于降解而过度沉积于肝组织引起肝纤维化，而肝癌的分子机制则极为复杂，与肝癌细胞无限增殖、免疫逃逸等十大特征密切相关。
6.肝纤维化组织(尤其是血清)中casc15的表达情况未见任何报道，其是否可作为肝纤维化诊断生物标志物及治疗靶点也未有相关研究。有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明提供了lncrna casc15作为肝纤维化生物标志物的应用。
8.具体的，本发明提供的技术方案如下：
9.第一方面，本发明提供了lncrna casc15作为肝纤维化生物标志物在肝纤维化相关疾病诊断和/或治疗中的应用。
10.lncrna casc15的gene id为ensg00000272168，来源于人类第6号染色体，其核苷酸序列如seq id no:1所示。本发明首次发现：来自可能患有肝纤维化对象的血清中lncrna casc15的表达水平，其中较高表达量的lncrna casc15与所述对象患肝纤维化的风险及严重程度增加有关。
11.进一步研究结果表明：lncrna casc15在肝纤维化患者的血清中显著上调。经验证，lncrna casc15具备良好的诊断肝纤维化的能力。lncrna casc15主要表达于肝纤维化肝细胞的胞浆，干扰lncrna casc15可显著抑制促纤维化细胞因子ihh的表达与分泌，从而抑制肝星状细胞的活化并改善肝纤维化。表明lncrna casc15在肝纤维化的发生发展中发挥重要的正调节作用，可为临床治疗肝纤维化提供新的靶点。
12.本发明首次发现lncrna casc15可作为肝纤维化诊断生物标志物和药物治疗靶点。
13.第二方面，本发明提供了lncrna casc15在制备用于诊断和/或治疗肝纤维化的产品中的应用。
14.第三方面，本发明具体提供了一种用于诊断肝纤维化的产品，所述的产品包含能够测量样本中lncrna casc15表达量的试剂和/或仪器。
15.基于lncrna casc15的肝纤维化生物标志物作用，包含能够测量样本中lncrna casc15表达量的试剂和/或仪器可制备得到用于诊断肝纤维化的产品，可准确诊断肝纤维化相关疾病。
16.优选的，所述样本选自血液、血清、血浆。
17.进一步的，所述试剂优选包含lncrna casc15扩增引物。例如，实时定量pcr检测lncrna casc15表达水平的试剂等。
18.更优选的，所述lncrna casc15扩增引物包含上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no:3所示。
19.进一步的，所述的产品优选还包含：处理样本的试剂；和/或用于内参基因检测的
引物组合；和/或使用所述产品评估受试者是否患有肝纤维化相关疾病的说明书；和/或使用所述产品评估受试者肝纤维化预后情况的说明书。其中，所述处理样本的试剂可选自血清总rna提取试剂、cdna合成试剂等。
20.更优选的，所述内参基因选自gapdh。以gapdh作为内参基因，可基于对lncrna casc15表达量的检测，获得更为准确的肝纤维化相关疾病判断结果。
21.在本本发明提供的更为具体的实施方式中，所述用于诊断肝纤维化的产品，其检测lncrna casc15表达水平的方法包括如下步骤：总rna提取(norgen血浆血清rna纯化小提试剂盒)，gapdh(引物的核苷酸序列为tcggagtcaacggatttggt和tcgccccacttgattttgga)用作内部参照，使用sybr green pcr master mix进行所有实时荧光定量pcr反应。
22.第四方面，本发明具体提供了一种用于治疗肝纤维化的产品，所述的产品包含能够抑制lncrna casc15表达水平的试剂和/或仪器。
23.lncrna casc15在肝纤维化的发生发展中发挥重要的正调节作用，可为临床治疗肝纤维化提供新的靶点。因此，包含能够抑制lncrna casc15表达水平的试剂和/或仪器可制备得到用于治疗肝纤维化相关疾病的产品。
24.进一步的，所述试剂优选包含lncrna casc15特异性小干扰rna。
25.更优选的，所述lncrna casc15特异性小干扰rna包含正义链和反义链，所述正义链的核苷酸序列如seq id no:4所示，所述反义链的核苷酸序列如seq id no:5所示。
26.在本发明中，所述lncrna casc15特异性小干扰rna优选经过2
’‑
甲氧基(2
’‑
ome)的化学基团修饰，能够增强核酸药物的稳定性并降低免疫原性。和/或，所述lncrna casc15特异性小干扰rna优选经过硫代磷酸化(ps)修饰，即采用一个硫原子取代磷酸酯骨架中的一个非桥接氧原子，能够提高核酸药物的细胞膜渗透性并进一步增强生物稳定性。和或，所述lncrna casc15特异性小干扰rna优选经过n-乙酰半乳糖胺(galnac)修饰，即将n-乙酰化的半乳糖胺以三价态的方式共价缀合到sirna正义链的3
′
末端，形成多糖-sirna单缀合物，能够实现向肝细胞的特异性递送。
27.本发明研究结果表明：经修饰后的sicasc5(如：galnac-sicasc15)经皮下给药，能在肝组织中显著富集并进入肝细胞，进而显著抑制小鼠肝组织中促纤维化细胞因子ihh、hsc活化指标col1α1及α-sma的蛋白表达水平，对肝纤维化起到缓解治疗作用。
28.有益效果：
29.本发明提供了lncrna casc15作为肝纤维化生物标志物的应用。lncrna casc15在肝纤维化患者的血清中显著上调。经验证，lncrna casc15具备良好的诊断肝纤维化的能力。lncrna casc15主要表达于肝纤维化肝细胞的胞浆，干扰lncrna casc15可显著抑制促纤维化细胞因子ihh的表达与分泌，从而抑制肝星状细胞的活化并改善肝纤维化。表明lncrna casc15在肝纤维化的发生发展中发挥重要的正调节作用，可为临床治疗肝纤维化提供新的靶点。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
31.图1是本发明实施例1中肝纤维化患者和健康体检者血清中差异表达lncrna的火
山图。
32.图2为本发明实施例1中使用特异性识别lncrna casc15的引物对肝纤维化患者和健康体检者血清中lncrna casc15的表达量检测的结果图。***代表p值《0.001。
33.图3为本发明实施例1中评价lncrna casc15诊断肝纤维化潜能的roc曲线图。
34.图4为本发明实施例2中使用casc15特异性小干扰rna转染l02和qsg-7701两种细胞系后检测casc15表达水平的结果图。sinc代表阴性对照组；sicasc15代表抑制lncrna casc15的特异性小干扰rna组。***代表p值《0.001。
35.图5为本发明实施例3中fam-galnac-sicasc15在小鼠肝组织中特异性富集的结果图，使用fam-galnac-sicasc15皮下注射c57bl/6小鼠，48小时后处死小鼠取肝组织制成冰冻切片，通过荧光显微镜鉴定fam-galnac-sicasc15在小鼠肝组织中的富集情况。fam-galnac-sicasc15代表经过fam荧光标记以及n-乙酰半乳糖胺修饰的casc15特异性小干扰rna，blank代表空白对照组。
36.图6为本发明实施例3中使用抑制lncrna casc15表达的特异性小干扰rna对肝纤维化模型小鼠治疗4周后小鼠肝组织中促纤维化细胞因子ihh、hsc活化指标ⅰ型胶原及α-sma蛋白相对表达量的结果图。sinc代表阴性对照组；sicasc15代表抑制lncrna casc15的特异性小干扰rna组。*代表p值《0.05，**代表p值《0.01。
具体实施方式
37.以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
38.实施例1
39.本实施例对lncrna casc15在肝纤维化患者血清中的表达及诊断效能进行验证。
40.(1)血清：收集40例计划接受肝纤维化治疗的患者及28例健康体检者的血清。纳入标准：
①
所有患者均符合肝纤维化的临床诊断标准，入院前未曾接受任何治疗，入院后经病理检查确认；
②
本人及家属均自愿签署知情同意书。排除标准：
①
近期有/疑似细菌感染、组织损伤或各种炎症性疾病者；
②
患有其他肝脏疾病。所有血液样本均在接受任何药物治疗前或术前取得。血清标本通过4℃离心获得，存于-80℃冰箱。
41.(2)lncrna差异基因表达谱：从血清标本库中选取肝纤维化患者及健康体检者的血清各6例，经质检合格后进行全转录组测序，分析肝纤维化患者血清中差异表达lncrnas(设置差异显著基因的默认阈值为：p≤0.001且fold change≤0.5或≥2.0)；随后将全转录组测序分析得到的肝纤维化患者血清中差异表达lncrna与geo数据库中肝硬化患者血清差异表达lncrna进行比对，筛选诊断人体肝纤维化的潜在生物标志物。
42.(3)血清总rna提取及荧光实时定量pcr(qrt-pcr)：采用norgen血浆血清rna纯化小提试剂盒提取血清总rna；采用primescript rt reagent kit逆转录试剂盒(takara，中国，大连)合成cdna；采用sybr green pcr master mix(takara，中国，大连)进行实时荧光定量pcr反应，gapdh作为内参，通过2-δδct
法计算目的lncrna的相对表达量；引物由上海生工生物工程有限公司合成；引物序列见表1，qrt-pcr反应体系见表2，反应条件见表3。
43.表1 qrt-pcr引物序列
44.基因名称上游引物下游引物casc15ttagggaaagccttctttagggatctcccagcccctattcctttgapdhtcggagtcaacggatttggttcgccccacttgattttgga
45.表2 qrt-pcr反应体系
46.试剂使用量2
×
sybr green pcr master mix10μl上游引物(10μm)1μl下游引物(10μm)1μlcdna模板2μlrnase-free dh2o6μl
47.表3 qrt-pcr反应条件
[0048][0049]
(4)数据处理与分析：使用spss软件对数据进行统计分析，使用graphpad prism 8.0软件做统计图。根据需要采用t检验或wilcoxon秩和检验比较样本间或组间差异，p《0.05被认为具有统计学差异。实验数据以来自三次独立实验的平均值
±
标准差来表示。lncrna casc15的诊断效能采用roc曲线分析和auc(曲线下面积)评价指标表示。
[0050]
(5)实验结果：
[0051]
在本实施例中，通过对肝纤维化患者及健康体检者的血清进行全转录组测序分析，得到肝纤维化患者血清中差异表达lncrna的火山图，见图1；随后将全转录组测序分析得到的肝纤维化患者血清中差异表达lncrna与geo数据库中肝硬化患者血清差异表达lncrna进行比对，得到诊断人体肝纤维化的潜在生物标志物，其中lncrna casc15在肝纤维化患者及肝硬化患者血清中的表达均显著上调。
[0052]
在本实施例中，本发明从血清标本库中选取了40例肝纤维化患者及28例健康体检者的血清样本，提取血清总rna后进行反转录。qrt-pcr检测结果显示：lncrna casc15在肝纤维化患者血清中显著高表达，见图2。roc曲线下面积auc为0.8777，表明其对肝纤维化具有较好的诊断价值，见图3。
[0053]
实施例2
[0054]
本实施例对靶向lncrna casc15的特异性小干扰rna抑制casc15表达水平的情况进行验证。
[0055]
(1)细胞系及培养：人正常肝细胞系l02和qsg-7701为本实验室保存，两种细胞系均培养在含有10％胎牛血清的rpmi-1640培养基(gibco,usa)中，在37℃和5％co2的培养箱中进行培养。
[0056]
(2)细胞转染：靶向lncrna casc15的特异性小干扰rna(sicasc15)及阴性对照
(sinc)由上海吉玛制药技术有限公司进行合成，使用lipofectamine 3000(thermo fisher scientific,usa)将sirna 转染入人正常肝细胞系l02和qsg-7701中；sirna序列见表4。
[0057]
表4sirna序列
[0058]
基因名称靶向序列negative control(sinc)uucuccgaacgugucacguttsi-casc15gaguccaagugugacugccaatt
[0059]
(3)总rna提取及荧光实时定量pcr(qrt-pcr)：采用trizol试剂(invitrogen,carlsbad,usa)提取细胞总rna，逆转录合成cdna及qrt-pcr检测同实施例1。
[0060]
(4)数据处理与分析：同实施例1。
[0061]
(5)实验结果：
[0062]
在本实施例中，本发明采用靶向lncrna casc15的特异性小干扰rna对人正常肝细胞系l02和qsg-7701进行转染，48小时后提取总rna并进行反转录。qrt-pcr检测结果显示：靶向lncrna casc15的特异性小干扰rna可显著抑制肝细胞系中casc15的表达水平，见图4。
[0063]
实施例3
[0064]
本实施例对n-乙酰半乳糖胺修饰的sicasc5(galnac-sicasc15)在小鼠肝组织中富集情况以及对肝纤维化的缓解治疗作用进行验证。
[0065]
(1)动物模型：建立ccl4诱导的小鼠肝纤维化模型：选择8周龄雄性c57bl/6小鼠，分为两组(每组15只)，采用20％的ccl4橄榄油混悬液每周2次腹腔注射模型组小鼠，对照组小鼠腹腔注射等体积橄榄油，持续12周。
[0066]
(2)galnac-sicasc15合成及给药：经fam荧光及n-乙酰半乳糖胺修饰的sicasc5(fam-galnac-sicasc15)及阴性对照(galnac-sinc)由苏州贝信生物技术有限公司进行合成。在小鼠肝纤维化造模进行到第4周时，采用3mg/kg剂量对小鼠进行皮下给药(每月1次)。
[0067]
(3)荧光显微镜观察：肝纤维化造模小鼠皮下给药2周后，从每组随机抽取3只，颈椎脱臼法处死小鼠并收取完整肝组织，进行oct包埋(sakura finetechnical,tokyo,japan)及冰冻切片，经dapi(beyotime,china)衬染后置于荧光显微镜下进行观察拍照。
[0068]
(4)总蛋白提取及蛋白免疫印迹(western blotting)：肝纤维化造模小鼠皮下给药8周后，颈椎脱臼法处死小鼠并收取肝组织，取其中100mg剪切成小块，加入适量的冰预冷pbs洗涤两次后，4℃700
×
g离心3min，弃上清。按照每20mg组织加100μl裂解液的比例加入裂解液以及匀浆专用的磁珠，将试管放入组织匀浆机中，60hz运转5min，充分裂解后，4℃10000
×
g离心5min，取上清。进行蛋白定量后，取相应体积的蛋白裂解液与5
×
sds上样缓冲液充分混匀，煮沸5min后制成蛋白上样液，进行蛋白免疫印迹检测。所用ihh、col1α1、α-sma、β-actin抗体购自abcam公司，结果分析采用bio-rad凝胶成像仪，以β-actin为内参，运用image-j软件对条带灰度值进行计算分析。
[0069]
(5)实验结果
[0070]
在本实施例中，本发明采用fam-galnac-sicasc15对肝纤维化造模小鼠进行皮下给药，两周后取肝组织进行冰冻切片及dapi衬染，荧光显微镜观察结果显示：galnac-sicasc15在肝组织中显著富集并进入肝细胞中，见图5。
[0071]
在本实施例中，本发明采用galnac-sicasc15对肝纤维化造模小鼠进行皮下给药，8周后取肝组织提取总蛋白并进行蛋白免疫印迹检测，结果显示：galnac-sicasc15皮下给
药可显著抑制小鼠肝组织中促纤维化细胞因子ihh、hsc活化指标col1α1及α-sma的蛋白表达水平，见图6。
[0072]
综上，本发明所提出的这一新颖的长链非编码rna不仅能成为肝纤维化诊断相关的生物标志物，更有望成为肝纤维化治疗新的靶点，有望改善提高临床肝纤维化的治疗效果。准确地找到更多像casc15这样的有望参与辅助肝纤维化诊断、治疗及预后相关的生物标志物，具有十分重要的现实意义。
[0073]
以上所述的实施例是示例性的，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，但凡所属本技术领域的技术人员对所描述的技术方案做简单修改或补充或采用类似的方式替代，只要未脱离本发明技术方案内容或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.lncrna casc15作为肝纤维化生物标志物在制备用于诊断和/或治疗肝纤维化的产品中的应用，所述lncrna casc15的核苷酸序列如seq id no:1所示。2.用于诊断肝纤维化的产品，其特征在于，所述的产品包含能够测量样本中lncrna casc15表达量的试剂和/或仪器。3.根据权利要求2所述用于诊断肝纤维化的产品，其特征在于，所述样本选自血液、血清、血浆。4.根据权利要求2所述用于诊断肝纤维化的产品，其特征在于，所述试剂包含lncrna casc15扩增引物。5.根据权利要求4所述用于诊断肝纤维化的产品，其特征在于，所述lncrna casc15扩增引物包含上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no:3所示。6.根据权利要求2-5任意一项所述用于诊断肝纤维化的产品，其特征在于，所述的产品还包含：处理样本的试剂；和/或用于内参基因检测的引物组合；和/或使用所述产品评估受试者是否患有肝纤维化相关疾病的说明书；和/或使用所述产品评估受试者肝纤维化预后情况的说明书。7.根据权利要求6所述用于诊断肝纤维化的产品，其特征在于，所述内参基因选自gapdh。8.用于治疗肝纤维化的产品，其特征在于，所述的产品包含能够抑制lncrna casc15表达水平的试剂和/或仪器。9.根据权利要求8所述用于治疗肝纤维化的产品，其特征在于，所述试剂包含lncrna casc15特异性小干扰rna。10.根据权利要求9所述用于治疗肝纤维化的产品，其特征在于，所述lncrna casc15特异性小干扰rna包含正义链和反义链，所述正义链的核苷酸序列如seq id no:4所示，所述反义链的核苷酸序列如seq id no:5所示。

技术总结
本发明涉及分子生物医药技术领域，尤其涉及lncRNA CASC15作为肝纤维化生物标志物的应用。本发明提供了lncRNA CASC15作为肝纤维化生物标志物的应用。lncRNA CASC15在肝纤维化患者的血清中显著上调。经验证，lncRNA CASC15具备良好的诊断肝纤维化的能力。lncRNA CASC15主要表达于肝纤维化肝细胞的胞浆，干扰lncRNA CASC15可显著抑制促纤维化细胞因子Ihh的表达与分泌，从而抑制肝星状细胞的活化并改善肝纤维化。表明lncRNA CASC15在肝纤维化的发生发展中发挥重要的正调节作用，可为临床治疗肝纤维化提供新的靶点。床治疗肝纤维化提供新的靶点。床治疗肝纤维化提供新的靶点。


技术研发人员：王磊 周罗晶 谈维 史甜 王方方 孙钰 赵祥安 党园园
受保护的技术使用者：江苏省苏北人民医院
技术研发日：2023.06.20
技术公布日：2023/8/24