一种杂交瘤细胞及其在制备分泌鼠抗人降钙素原单克隆抗体的应用

1.本发明属于抗体检测领域，具体涉及一种能产生鼠抗人降钙素原单克隆抗体的杂交瘤细胞、该杂交瘤细胞分泌的抗体、制备方法及应用。


背景技术：

2.降钙素原(procalcitonin，pct)是1975年由moya等发现，首先与脓毒症患者血清中检测到的蛋白。pct由甲状腺c细胞和肺的k细胞产生及分泌，虽然pct是降钙素的前体，但pct跟降钙素的生物活性有明显的差别。pct来自于人第11号染色体上(11p15，4)的单拷贝基因，pct基因由2800个碱基对组成，含6个外显子和5个内含子。血液中钙离子浓度升高和细胞癌变会导致pct基因的转录活化，翻译后经修饰变成一种由116个氨基酸组成的糖蛋白，相对分子量约13kd，在体内稳定性强。当不存在感染的情况下，pct主要局限于甲状旁腺内，血清中水平很低或者几乎检测不到(＜0.05μg/l)。而在病理状态下，内毒素和肿瘤坏死因子均可作用于靶细胞，从而诱导pct的产生。pct的生成过程受细菌毒素和炎性细胞因子(tnfα、il-6)等多种因素的调节。在严重感染时，尤其是全身感染，如败血症、脓毒症(sepsis)、全身炎症反应综合征(sirs)、脓毒症休克(septic shock)等多种疾病时外周血中pct水平明显升高，对判断细菌感染具有较高的敏感度和特异性。pct在感染后2小时即可以检测到，感染后6-12小时达到峰值，12-24h为平台期，24h后浓度下降，半衰期为25-30小时。同时pct水平与感染程度正相关，作为炎症判断的重要指标，pct可用于细菌感染与病毒感染的鉴别诊断，脓毒症的早期诊断，疾病的严重程度的评估及预后，抗生素治疗效果的评估，指导临床抗生素使用，术后细菌感染监测，胰腺炎鉴别诊断，炎症性疾病诊断以及治疗预后等方面。
3.在健康人血浆中pct含量极低，在0.1ng/ml以下，因此，pct抗体的高亲和力和高特异性是影响pct检测结果的重要因素。目前，pct检测体系所用的抗体均来自国外大公司，价格昂贵。因此，制备高亲和力pct特异性单克隆抗体，为pct的免疫检测提供关键原料，对于扩大其临床应用，降低医疗成本，具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种杂交瘤细胞，用于制备高特异性及高亲和力的鼠抗人降钙素原单克隆抗体。
5.本发明的目的是通过以下措施实现的：
6.本发明提供了一种杂交瘤细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no:c2022355，保藏日期为：2022年11月29日。该细胞是将人pct蛋白免疫6-8周龄昆明白小鼠，3次免疫后选择血清效价高的小鼠进行骨髓瘤(sp2/0)细胞和脾脾脏淋巴细胞进行电融合，间接elisa方法检测阳性单克隆，最终获得特异性分泌鼠抗人降钙素原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
7.本发明提供了一种鼠抗人降钙素原单克隆抗体，来源于上述杂交瘤细胞，能特异性结合人降钙素原。
8.本发明还提供了一种鼠抗人降钙素原单克隆抗体的制备方法，包含以下步骤：
9.步骤1，重组质粒制备：将权利要求1所述杂交瘤细胞用5’race测序列获得抗体的重链和轻链序列，将重链和轻链序列分别连接入真核表达载体pcdna3.4中获得重组质粒。
10.步骤2，抗体表达：将重组重链和轻链质粒各10μg转染293f细胞，置于震动培养箱中培养，当活细胞量下降至60％左右时，400
×
g离心20min收取细胞上清液。
11.步骤3，抗体纯化：利用hitrap protein a hp进行上清中蛋白的纯化，再将纯化后的蛋白用pbs透析过夜，超滤管浓缩并调整浓度至0.1-1mg/ml。
12.步骤4，抗体进行sds-page电泳鉴定。
13.本发明还提供了一种上述鼠抗人降钙素原单克隆抗体在制备检测人降钙素原试剂盒中的应用。
14.本发明还提供了一种检测人降钙素原的试剂盒，以上述鼠抗人降钙素原单克隆抗体作为检测抗体。
15.有益效果
16.1.本发明提供了一种能分泌鼠抗人降钙素原单克隆抗体的杂交瘤细胞株，可获得特异性好，亲和力强的鼠抗人降钙素原单克隆抗体。
17.2.本发明提供了一种鼠抗人降钙素原单克隆抗体的制备方法，采用本发明的杂交瘤细胞获得的抗体序列，通过重组技术制备，可以大量生产抗体，抗体纯度高，达95％以上。
18.3.本发明提供了一种检测试剂盒，用于检测人降钙素原具有高特异性和灵敏度，可用于炎症性疾病的辅助诊断和治疗预后的评估。
附图说明
19.图1.校准品检测杂交瘤细胞上清特异性的胶体金试剂条检测图(1-33分别为：
20.1-1a，1-5b，1-5c，1-7g，1-10c，2-5d，3-1b，2-8e，2-8f，2-9c，2-6d，3-1h，3-5g，3-5h，3-6b，3-7e，3-8d，3-12c，4-1g，4-5c，4-12e，5-2a，5-3f，5-4b，5-4c，5-5c，6-3f，6-7d，6-9d，6-12f，6-12g，7-7c，9-2d；从左向右依次为：10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml)
21.图2.抗原检测杂交瘤细胞上清特异性的胶体金试剂条检测图(上：3-1b，中：2-8f，下：5-3f；从左向右依次为：10ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、500ng/ml)
22.图3.校准品检测三株杂交瘤细胞上清特异性的胶体金试剂条检测图(上：3-1b，中：2-8f，下：5-3f；从左向右依次为：0.1ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml)
23.图4.重组抗体sds-page电泳图(m：marker；1:5-3f；2:2-8f；3:3-1b)
24.图5.重组抗体亲和力检测结果(kd)
具体实施方式
25.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验
方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
26.实施例1
27.1.制备杂交瘤细胞
28.1)动物免疫
29.利用人pct蛋白免疫6-8周龄昆明白小鼠，50μg/次/只，3次免疫后采集小鼠眼眶血，分离血清后用间接elisa法进行免疫效价检测，选取血清效价高的小鼠进行加强免疫，50μg/只，4天后进行杂交瘤融合实验。
30.2)杂交瘤细胞融合及筛选
31.a.小鼠骨髓瘤(sp2/0)细胞培养：复苏sp2/0细胞，置于37℃，5％co2的培养箱中培养，传代3次后调整细胞密度，当细胞密度达到70％-80％，留待使用。
32.b.脾脏淋巴细胞单细胞悬液制备：加强免疫第4天处死小鼠，分离小鼠脾脏，将小鼠脾脏轻轻研磨，使脾脏组织分散为单细胞悬液，研磨结束后，用移液枪取10ml rpmi 1640基础培养基冲洗细胞筛网(40μm)，使上面的细胞通过筛网流至下面的培养皿中，并混匀所得细胞液，1200rpm离心5min，收集脾脏淋巴细胞。
33.c.杂交瘤细胞电融合:将步骤a培养的sp2/0细胞与步骤b得到的脾脏淋巴细胞按照1:5进行混合，1200rpm离心5min，弃上清，用rpmi 1640基础培养基重悬细胞沉淀，1200rpm离心5min，离心后弃上清，用电融合液10ml重悬细胞，1200rpm离心5min，最后再用9ml电融合液重悬细胞，将细胞悬液加入电融合槽，设置好电压参数(900v、40us、1次)，点击融合按钮，进行电融合。
34.3)杂交瘤细胞筛选
35.a.获得单克隆杂交瘤细胞：将上一步得到的杂交瘤融合细胞转移至加有hat的半固体培养基中，混匀后加入10cm培养皿，放于37℃，5％co2培养箱中培养，7-10天后挑取单个克隆至含有ht培养基的96孔板中，继续培养2-3天用于后续检测。
36.b.筛选杂交瘤细胞：采用间接elisa方法检测阳性单克隆杂交瘤细胞分泌抗体，包被抗原为pct蛋白，检测样品为杂交瘤上清，酶标二抗为antimouse igg(hrp)，将检测阳性的单克隆从96孔板传至24孔板，待细胞生长占孔底面积的75％时，取细胞上清进行抗体配对检测。
37.共计挑取864个杂交瘤克隆进行elisa检测，初步筛选od
450nm
＞1.5的杂交瘤细胞有33株，如表1。
38.表1杂交瘤上清与pct蛋白结合elisa检测结果
39.[0040][0041]
4)杂交瘤细胞上清特异性检测
[0042]
根据elisa检测结果，初步筛选33株od
450nm
＞1.5的杂交瘤细胞上清进行抗体配对检测，进一步进行特异性和灵敏性检测，评估其特异性和灵敏度。将筛选出的1-1a，1-5b，1-5c，1-7g，1-10c，2-5d，3-1b，2-8e，2-8f，2-9c，2-6d，3-1h，3-5g，3-5h，3-6b，3-7e，3-8d，3-12c，4-1g，4-5c，4-12e，5-2a，5-3f，5-4b，5-4c，5-5c，6-3f，6-7d，6-9d，6-12f，6-12g，7-7c，9-2d共33株杂交瘤细胞上清进行标记，喷金(金标抗体)，检测用pct正常生产抗体作为包被抗体进行划膜，将pct抗原(原浓度1.1mg/ml)进行稀释至500ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml进行检测，检测结果如表2所示。胶体金免疫层析分析仪(单通道，pmdt8000)分析试剂卡，t线颜色越深，检测值越高。
[0043]
表2杂交瘤细胞上清配对检测(抗原)
[0044][0045]
[0046]
结果如表2所示，3-1b，2-8f，5-3f共3株杂交瘤细胞上清的检测值有梯度，t线颜色随着抗原浓度的增高逐渐加深(图1，7号：3-1b，9号：2-8f，23号：5-3f)，而其余30株杂交瘤细胞上清的检测值无梯度，c线很浅或不显色，可能是这30株杂交瘤细胞上清中含有的杂蛋白与胶体金进行了结合，而上清中的pct抗体浓度太低没有结合上造成。
[0047]
再对3株杂交瘤细胞上清分别进行校准品和抗原检测，即将3株杂交瘤细胞上清进行标记，喷金，用胶体金pct正常生产的抗体作为包被抗体进行划膜，将pct抗原(1.1mg/ml)稀释至500ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml进行检测，另外校准品稀释至25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml、0.1ng/ml，进行同上检测。
[0048]
结果如图2-3和表3-4所示，3-1b、2-8f、5-3f这3株杂交瘤细胞上清的检测值梯度和cv较好，因此结合校准品和抗原的检测结果，最终筛选以上3株杂交瘤细胞进行抗体基因测序及重组表达。
[0049]
表3三株杂交瘤细胞上清配对检测(抗原)
[0050][0051][0052]
表4杂交瘤细胞上清配对检测(校准品)
[0053]
抗原01ng/ml025ng/ml05ng/ml25ng/ml5ng/ml10ng/ml25ng/ml3-1b检测值000034762022-8f检测值00035571342315-3f检测值00059135238384
[0054]
实施例2制备鼠抗人降钙素原单克隆抗体
[0055]
1.载体构建：将筛选的3株杂交瘤细胞用5’race方法进行序列测定，获得抗体的重链和轻链序列，将获得的重链和轻链序列分别连接入真核表达载体pcdna3.4中获得重组质粒。
[0056]
2. 2抗体小量表达：取对数生长期的293f细胞按照0.8
×
106cells/ml密度进行传代。第二天，待细胞长到1.5
×
106cells/ml，并且细胞活率大于95％后，将细胞稀释到1
×
106cells/ml后进行转染。取2个无菌的2ml ep管，一个加入200μl opti-mem培养液和重组重链和轻链质粒各10μg，另一个加入200μl opti-mem培养液和60μl转染试剂，各自混匀后室温孵育5min。再将混匀的pei溶液快速加入混匀的重组质粒dna中，用移液枪轻轻吹打混匀，室温孵育15min，再逐滴加入准备好的293f细胞中，边加边轻轻震荡细胞。将转染好的细胞至于震动培养箱中培养，每天用台盼蓝染色法计算细胞活率，当活细胞量下降至60％左右时，400
×
g离心20min收取细胞上清液。
[0057]
3.抗体纯化：利用hitrap protein a hp进行上清中蛋白的纯化。先用5倍柱体积的超纯水冲洗柱子，再用5倍柱体积的结合缓冲液(20mmol/l pb buffer，0.2mol/l nacl，ph＝7.2)平衡柱子。将收集的细胞上清用0.45μm滤膜过滤后与等体积的结合缓冲液混合，再上样，流速为1ml/min，收集流穿液。用10倍柱体积的结合缓冲液洗柱子，直到紫外和电导均为基线。用洗脱缓冲液(100mmol/l甘氨酸，ph＝2.7)洗脱至中和缓冲液(1mol/l tris-hcl，ph＝9.0)中，流速1ml/min。洗脱后立即用10倍柱体积的结合缓冲液重新平衡柱子。再将纯化后的蛋白用pbs透析过夜后用超滤管浓缩并调整至合适浓度0.1-1mg/ml。
[0058]
将3个重组表达及纯化后的抗体进行sds-page电泳，结果显示，3个抗体经过还原buffer处理后，重链均在50kda左右，轻链在25kda左右(图4)，符合预期大小，且抗体纯度都在95％以上。
[0059]
实施例3抗体的特异性和亲和力检测
[0060]
1.间接elisa方法检测重组表达的单克隆抗体对抗原的结合能力：用包被液将pct蛋白稀释至2μg/ml，100μl/孔，4度包被过夜。取出包被好的elisa板，pbst(取250μl吐温-20至500ml pbs中)洗涤三次，含1％bsa的pbs(取1g bsa溶解至100ml pbs)37度封闭1h。取出封闭好的elisa板，pbst洗涤三次，加入重组表达的抗体(稀释100倍)，设置免疫小鼠和免疫前小鼠为阳性和阴性对照(稀释100倍)，加含1％bsa的pbs为空白对照，37℃孵育2h。取出孵育好的elisa板，pbst洗涤三次，anti mouse igg(hrp)(1∶5000，用1％bsa pbs稀释)，37度孵育2h。取出封闭好的elisa板，pbst洗涤三次，加入tmb显色15min，用终止液(2.5m h2so4)终止，酶标仪读取od
450
数值。
[0061]
根据表5中elisa检测结果可知，将重组表达抗体3-1b、2-8f、5-3f稀释至0.1mg/ml，3个重组抗体都能与pct蛋白结合，但3-1b结合优于2-8f和5-3f。
[0062]
表5重组抗体结合elisa检测
[0063]
[0064]
2.重组单克隆抗体亲和力检测：将纯化后的3个重组单克隆抗体进行kd检测，利用fortebio octet分子相互作用技术平台，将纯化抗体固相化到anti mouse igg fc传感器上，分别经过5个不同浓度(0、25、50、75或100nmol/l)pct蛋白结合，计算kd值。
[0065]
根据图5中抗体亲和力的结果可知，3-1b、2-8f、5-3f 3个重组表达的抗体亲和力分别为：1.6
×
10-9
m、7.6
×
10-9
m、1.2
×
10-8
m，其中3-1b亲和力最好，因此，综合elisa和亲和力的结果，优选杂交瘤细胞株3-1b进行保藏。

技术特征：
1.一种杂交瘤细胞，其特征在于，保藏号为cctcc no：2022355。2.一种鼠抗人降钙素原单克隆抗体，其特征在于：所述抗体来源于权利要求1所述杂交瘤细胞。3.一种鼠抗人降钙素原单克隆抗体的制备方法，包含以下步骤：步骤1，重组质粒制备：将权利要求1 所述杂交瘤细胞用5
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race 测序列获得抗体的重链和轻链序列，将重链和轻链序列分别连接入真核表达载体pcdna3.4 中获得重组质粒；步骤2，抗体表达：将重组重链和轻链质粒各10μg 转染293f 细胞，置于震动培养箱中培养，当活细胞量下降至60%左右时，400
×
g 离心20 min 收取细胞上清液；步骤3， 抗体纯化：利用hitrap protein a hp 进行上清中蛋白的纯化，再将纯化后的蛋白用pbs 透析过夜，超滤管浓缩并调整浓度至0.1-1mg/ml；步骤4， 抗体进行sds-page 电泳鉴定。4.一种如权利要求1 所述杂交瘤细胞和/或权利要求2 所述抗体在制备检测人降钙素原试剂盒中的应用。5.一种检测人降钙素原的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2 所述单克隆抗体。6.一种检测人降钙素原的胶体金检测试剂条，其特征在于：检测抗体或包被抗体为权利要求2 所述单克隆抗体。

技术总结
本发明提供了一种杂交瘤细胞株，可获得特异性好，亲和力强的鼠抗人降钙素原单克隆抗体。本发明还提供了一种鼠抗人降钙素原单克隆抗体的制备方法，采用本发明杂交瘤细胞获得的鼠抗人降钙素原单克隆抗体，通过杂交瘤技术和重组技术生产抗体，产量高，抗体产物纯度高，达95%以上。本发明还提供了包含所述抗人降钙素原单克隆抗体的试剂盒，检测人降钙素原具有高特异性和灵敏度的优势，可用于炎症性疾病的辅助诊断和治疗预后的评估。助诊断和治疗预后的评估。助诊断和治疗预后的评估。


技术研发人员：葛良鹏 吴梦 郎巧利 刘雪芹 肖普英 罗林 蒋雨
受保护的技术使用者：重庆市畜牧科学院
技术研发日：2023.06.09
技术公布日：2023/8/24