伊马替尼在抑制纤维瘢痕治疗脊髓损伤中的新用途

1.本发明涉及医药技术领域，尤其涉及伊马替尼经典化疗药物在抑制纤维瘢痕治疗脊髓损伤中的新用途。


背景技术：

2.脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统损伤，将导致患者运动、感觉和自主神经系统功能严重障碍，目前临床上缺乏有效的治疗手段。脊髓损伤后，直接的物理创伤导致血-脊髓屏障破裂而引发出血和缺血相关损伤，随后大量细胞死亡以及炎症细胞浸润引发炎症级联反应而加剧神经损害，最终成纤维细胞在星形胶质瘢痕内侧包绕损伤核心炎症细胞形成纤维瘢痕，进而严重阻碍神经轴突再生和功能恢复。因此，通过措施干预脊髓损伤后纤维瘢痕形成，有望促进神经再生及功能恢复，为临床脊髓损伤的治疗提供新的思路。
3.脊髓损伤后纤维瘢痕主要由周细胞及其分泌的细胞外基质组成。脊髓损伤后，周细胞从血管脱离并逐渐在脊髓损伤核心处聚集，随后大量增殖并迁移至损伤核心边缘，沉积大量细胞外基质而形成纤维瘢痕结构。尽管脊髓损伤后纤维瘢痕具有局限炎症、促进伤口愈合和维持组织完整性等功能，但纤维瘢痕形成的物理性屏障结构最终将导致轴突再生失败。因此，通过干预措施抑制纤维瘢痕形成，可能作为脊髓损伤的潜在治疗方式。然而，周细胞作为纤维瘢痕主要细胞成分，其来源和迁移至损伤核心形成纤维瘢痕的机制仍未明确。
4.在脊髓组织中，pdgfrβ几乎分布于所有周细胞，可以作为周细胞的特异性标记物。目前研究表明，仅pdgfbb和pdgfdd可与pdgfrβ结合而激活下游plcγ/pkc、nck/pak、grb2/erk和pi3k/akt信号蛋白，在细胞增殖、分化和迁移等方面发挥重要作用，其中包括pdgf/pdgfrβ通路对周细胞转化和迁移的调控作用。然而，有关pdgfrβ在脊髓损伤中的研究甚少，特别是有关pdgfrβ对“脊髓损伤后血管周细胞向周细胞转化和周细胞的迁移的作用以及对纤维瘢痕形成的作用”未见报道。因此，基于pdgfrβ研究“脊髓损伤后血管周细胞向周细胞转化和周细胞迁移形成纤维瘢痕的机制”，有望为pdgfrβ作为临床药物治疗靶点提供科学依据，具有重要意义。
5.伊马替尼(imatinib)是一种主要针对bcr-abl、c-kit、pdgfrα和pdgfrβ的特异性酪氨酸激酶抑制剂，目前主要用于临床上慢性髓性白血病和恶性胃肠道间质肿瘤等疾病的治疗。研究表明，imatinib特异性阻断pdgfr信号通路，可以减少周细胞的增殖，进而抑制肾脏纤维化。但imatinib对脊髓损伤后纤维瘢痕形成的作用尚不清楚，特别是基于pdgfrβ探讨“imatinib抑制血管周细胞向周细胞转化和周细胞迁移而抑制纤维瘢痕形成的效果”尚不清楚。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于基于发现imatinib治疗脊髓损伤的有效结果，提供一种伊马替尼经典化疗药物在抑制纤维瘢痕治疗脊髓损伤中的新用途。
7.本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
8.一种伊马替尼在抑制纤维瘢痕治疗脊髓损伤中的新用途。
9.作为本发明的优选方式之一，所述伊马替尼通过阻断pdgf-bb/pdgfrβ信号通路抑制周细胞-成纤维细胞转化，减少维瘢痕形成，促进运动功能恢复和轴突再生。
10.作为本发明的优选方式之一，当用于抑制纤维瘢痕治疗脊髓损伤时，伊马替尼采用鞘内注射形式。
11.作为本发明的优选方式之一，鞘内注射伊马替尼的疗程为每天注射，剂量为10mg/kg。
12.本发明相比现有技术的优点在于：
13.(1)本发明基于发现imatinib治疗脊髓损伤的有效结果，提供了imatinib治疗脊髓损伤抑制纤维瘢痕形成的特异性靶点和用药方式；通过检测脊髓损伤后小鼠运动功能恢复和轴突再生，同时结合血管修复情况，扩大了经典化疗药物imatinib的治疗用途，并为早期imatinib的应用提供一个直接有效的给药方式；
14.(2)本发明注射imatinib的方法采用鞘内注射；鞘内注射有效避免血-脊髓屏障的物理隔离作用，imatinib在注射后可直接进入损伤部位而不经过血-脊髓屏障，此种方法目前比较成熟，为本发明的具体实施提供了技术基础；同时，经过前期测试，鞘内注射imatinib的疗程为每天注射，注射最佳剂量为10mg/kg。
附图说明
15.图1是实施例1中pdgf-bb/pdgfrβ信号与脊髓损伤后运动功能恢复之间的研究结果图(图1中：a图为实验方案的示意图，从损伤后4h到28天每天鞘内注射imatinib或pbs；b图为指定时间点使用bms评分进行行为学检测；c、d图为用pbs或imatinib治疗的小鼠在第28天时足迹分析和定量分析；e图为第28天时小鼠完整脊髓组织的低倍照片；数据表示为平均值
±
标准差；每个时间点或每组n＝5～7只小鼠；所有图像均来自矢状切面；**p《0.01和***p《0.001)；
16.图2是实施例1中pdgf-bb/pdgfrβ信号与脊髓损伤后轴突再生之间的研究结果图(图2中：a图为第28天处理的小鼠中gfap(绿色)和5-ht
+
轴突(红色)的代表性免疫荧光图像，右面板显示左侧面板上的虚线框的高倍放大图像；b图为量化5-ht
+
轴突尖端到病变部位的距离；c、d、f图为第28天时gfap(绿色)、nf-h
+
纤维(红色)、gap43
+
纤维(红色)和neun
+
神经元(红色)的代表性免疫荧光图像；d、e、g图分别为nf-h密度、gap43密度和neun
+
神经元数量的量化；数据表示为平均值
±
标准差；每个时间点或每组n＝5～7只小鼠；所有图像均来自矢状切面；*p《0.05，**p《0.01和***p《0.001)；
17.图3是实施例2中imatinib抑制pdgf-bb/pdgfrβ信号通路减少脊髓损伤后纤维瘢痕形成的研究结果图(图3中：a图为用imatinib或pbs对照处理的小鼠在损伤后14天和28天的gfap(绿色)和pdgfrβ(红色)的代表性免疫荧光图像；b图为pdgfrβ(绿色)和细胞外基质纤连蛋白fibronectin(红色，上图)和层粘连蛋白laminin(红色，下图)在28dpi时的代表性免疫荧光图像；c图为a图中纤维瘢痕面积的百分比的量化；d图为b图中细胞外基质面积的百分比的量化；e图为处理的小鼠14dpi时pdgfrβ(绿色)和fsp1(红色)的代表性免疫荧光图像；f图为所述处理的小鼠28dpi(f)时pdgfrβ(绿色)和fsp1(红色)的代表性免疫荧光图像；
g图为e、f图中fsp1标记的成纤维细胞面积百分比的量化；所有图像均来自矢状切面；数据表示为平均值
±
标准差。n＝4～6；**p《0.01和***p《0.001)；
18.图4是实施例3中pdgf-bb/pdgfrβ信号通路对微血管渗漏影响的研究结果图(图4中：a图为损伤后14天鞘内注射imatinib或pbs对照治疗的小鼠中cd31(红色)、pdgfrβ(绿色)和dapi(蓝色)的代表性免疫荧光图像；b图为处理的小鼠中cd31(红色)和纤维蛋白原(绿色)的代表性免疫荧光图像；c图为处理的小鼠在14dpi(上图)和28dpi(下图)的gfap(绿色)和cd68(红色)的代表性免疫荧光图像；d、e、f图分别为图a、b、c中周细胞覆盖微血管、纤维蛋白原渗漏和cd68
+
炎症区域的百分比；所有图像均来自矢状切面；数据表示为平均值
±
标准差；n＝4～6；ns，无显著差异；***p《0.001与对照相比)；
19.图5是实施例4中微血管内皮细胞在体外通过pdgf-bb/pdgfrβ信号通路诱导周细胞-成纤维细胞转分化研究结果图(图5中，a，b图为用sinc或靶向pdgfb的sirna转染bend.3细胞后pdgf-bb的蛋白质印迹分析和定量；c图为elisa检测转染sinc或sipdgfb#2后髓鞘碎片处理的bend.3细胞中pdgf-bb的表达水平；d、e图为pdgf-bb在bend.3细胞中的蛋白质印迹分析和定量；f图为用sinc或sipdgfb#2转染后髓磷脂处理的条件培养基诱导周细胞表型转化的实验示意图；g图为如图f所示处理原代周细胞后周细胞标志物ng2(绿色，上图)和成纤维细胞标志物fsp1(绿色，中图)和vimentin(绿色，下图)的免疫荧光染色；h图为ng2
+
、fsp1
+
和vimentin
+
周细胞量化的百分比；i图为用pdgfrβ抑制剂伊马替尼或su16f抑制后用mye-cm处理周细胞表型转变的实验示意图；j图为如图i所示处理原代周细胞后周细胞标志物ng2(绿色，上图)和成纤维细胞标志物fsp1(绿色，中图)和vimentin(绿色，下图)的免疫荧光染色；k图为ng2
+
、fsp1
+
和vimentin
+
周细胞量化的百分比；数据表示为平均值
±
标注差；n＝3次独立培养；*p《0.05，**p《0.01和***p《0.001)。
具体实施方式
20.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
21.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
22.实施例1
23.本实施例用于研究pdgf-bb/pdgfrβ信号在sci后运动功能恢复和轴突再生中的作用：
24.一、为了研究pdgf-bb/pdgfrβ信号在脊髓损伤(sci)后运动功能恢复中的作用，从脊髓损伤(sci)后4h到28dpi，小鼠每天鞘内注射伊马替尼(imatinib)，注射剂量为10mg/kg。之后利用bms评分分析小鼠运动功能恢复情况，同时通过足迹分析与脊髓组织观察进一步证实(参照图1a)。
25.bms评分分析结果表明：鞘内注射imatinib治疗的小鼠在14dpi至28dpi的运动功能恢复方面明显优于对照组小鼠(图1b)。
26.足迹分析结果表明：与对照组相比，imatinib组在28dpi时建立了更好的运动功能恢复(图1c、d)。
27.脊髓组织结果表明：在28dpi，鞘内注射imatinib的小鼠没有明显的脊髓组织缺损(图1e)。
28.以上数据表明，抑制pdgf-bb/pdgfr信号通路有助于sci后运动功能恢复，而不会造成组织缺陷。
29.二、脊髓组织损伤会破坏下行运动通路，功能恢复意味着轴突再生和纤维增加。为了研究抑制pdgf-bb/pdgfrβ信号通路对轴突再生的影响，在上述方法的基础上，使用免疫荧光染色检测下行5-ht轴突、nf-h纤维、gap43轴突再生以及神经细胞存活情况。
30.结果表明：在28dpi，与对照组相比，imatinib组小鼠脊髓有明显更多的5-ht轴突和gap43轴突纤维穿过损伤部位(图2a、b、c、e)，更多的nf-h纤维出现在损伤核心和更多的neu+神经元存留(图2c、d、f、g)。
31.以上数据表明，抑制pdgf-bb/pdgfr信号通路有助于sci后轴突再生。
32.综合上述所有实验结果可知：imatinib药理性抑制pdgf-bb/pdgfrβ信号传导，可促进sci后的运动功能恢复和轴突再生。
33.实施例2
34.本实施例用于验证pdgf-bb/pdgfrβ信号通道在纤维瘢痕形成中的作用：
35.为了验证pdgf-bb/pdgfrβ信号通道在纤维瘢痕形成中的作用，检测imatinib治疗的小鼠在星形胶质细胞-纤维瘢痕边界建立时(14dpi)和慢性期(28dpi)的纤维瘢痕形成情况。
36.免疫荧光染色结果表明：在14dpi和28dpi时，imatinib组小鼠损伤核心的pdgfrβ
+
纤维瘢痕面积分别减少了41.81％和56.74％(图3a和c)；在用imatinib治疗后，细胞外基质纤连蛋白和层粘连蛋白的面积在28dpi分别减少了47.68％和57.34％(图3b、d)。这些数据表明，用imatinib抑制pdgf-bb/pdgfrβ信号传导，可以减少纤维瘢痕形成。
37.同时，与对照组相比，在用imatinib治疗后14dpi和28dpi，损伤核心中密集的fsp1
+
成纤维细胞显著减少，表明抑制pdgfrβ受体可能抑制sci后周细胞-成纤维细胞转化(图3e、f、g)。纤维瘢痕面积和成纤维细胞的显著变化解释了imatinib治疗后功能恢复和轴突再生。
38.实施例3
39.本实施例用于评估阻断pdgf-bb/pdgfrβ信号通路对微血管渗漏的影响：
40.一、血脊髓屏障破裂引起的微血管渗漏是sci后功能恢复的障碍之一。为了评估阻断pdgf-bb/pdgfrβ信号通路对微血管渗漏的影响，首先如上所述在imatinib治疗后使用免疫荧光染色评估损伤核心中新形成的微血管的周细胞覆盖率。
41.结果表明：在用imatinib治疗后14天时，在损伤核心内大部分血管壁仍被pdgfrβ
+
周细胞覆盖(图4a)；imatinib组和对照组(即，control组)在损伤核心新形成的微血管周细胞覆盖率上没有显著差异(图4d)。
42.二、脊髓损伤后血脊髓屏障受损，纤维蛋白原作为血浆中的主要凝血蛋白和炎症诱导剂，渗入到脊髓实质引起炎症反应和微血管重塑。为消除急性期纤维蛋白原渗漏的影响，我们接下来在14dpi时检查了病变部位微血管和纤维蛋白原的分布。
43.结果表明：脊髓损伤后14天，imatinib治疗组血管外纤维蛋白原的渗漏明显低于对照小鼠(图4b和e)。大量巨噬细胞/小胶质细胞在损伤部位浸润和炎症因子的释放可导致
微血管渗漏增加。这可能是归因于渗漏的纤维蛋白原介导的炎症反应。在14dpi和28dpi时，imatinib组病变部位cd68
+
巨噬细胞/小胶质细胞的面积明显小于对照组(图4c)。cd68
+
巨噬细胞/小胶质细胞染色的定量显示，与对照小鼠相比，imatinib治疗后在14dpi和28dpi其阳性面积分别减少了43.54％和47.58％(图4f)。
44.因此，数据表明微血管渗漏的减少可能与sci后的炎症减弱有关。
45.实施例4
46.本实施例用于检测imatinib阻断pdgf-bb/pdgfrβ信号通路对周细胞-成纤维细胞转化的作用：
47.首先，用靶向pdgfb(sipdgfb#1、sipdgfb#2和sipdgfb#3)的sirna和阴性对照(sinc)转染bend.3细胞。通过蛋白质印迹分析评估pdgfb敲低的有效性(图5a、b)。在pdgf-bb敲低后用髓磷脂碎片处理，通过elisa检测表明，培养基中pdgf-bb的表达水平显著降低(图5c)。蛋白质印迹分析的结果进一步证实，pdgf-bb敲低后pdgf-bb的表达水平显著降低(图5d、e)。pdgf-bb敲低增加了周细胞标志物ng2的表达并降低了成纤维细胞标志物fsp1和波形蛋白的表达，表明pdgf-bb是体外微血管内皮细胞诱导的周细胞-成纤维细胞转化所必需的(图5f-h)。
48.接下来使用imatinib(一种选择性pdgfrβ抑制剂)和su16f(一种特异性pdgfrβ抑制剂)抑制pdgf-bb/pdgfrβ信号传导(图5i)，imatinib和su16f都有效地逆转了微血管内皮细胞诱导的周细胞-成纤维细胞转化(图5j、k)。
49.总之，这些结果表明imatinib通过阻断pdgf-bb/pdgfrβ信号通路抑制周细胞-成纤维细胞转化。
50.综合上述实施例1～4可知，伊马替尼可通过阻断pdgf-bb/pdgfrβ信号通路抑制周细胞-成纤维细胞转化，减少维瘢痕形成，进而促进运动功能恢复和轴突再生，治疗脊髓损伤。
51.此外，需要注意的是，上述实施例中小鼠鞘内注射imatinib的剂量采用的是10mg/kg，最佳剂量。经过本发明的前期测试，鞘内注射imatinib的疗程为每天注射，注射最佳剂量为10mg/kg。当鞘内注射imatinib的剂量采用30mg/kg时，小鼠无法耐受该剂量而死亡；而5mg/kg的剂量效果不如注射10mg/kg的效果。
52.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种伊马替尼在抑制纤维瘢痕治疗脊髓损伤中的新用途。2.根据权利要求1所述的伊马替尼在抑制纤维瘢痕治疗脊髓损伤中的新用途，其特征在于，所述伊马替尼通过阻断pdgf-bb/pdgfrβ信号通路抑制周细胞-成纤维细胞转化，减少维瘢痕形成，促进运动功能恢复和轴突再生。3.根据权利要求1所述的伊马替尼在抑制纤维瘢痕治疗脊髓损伤中的新用途，其特征在于，当用于抑制纤维瘢痕治疗脊髓损伤时，伊马替尼采用鞘内注射形式。4.根据权利要求3所述的伊马替尼在抑制纤维瘢痕治疗脊髓损伤中的新用途，其特征在于，鞘内注射伊马替尼的疗程为每天注射，剂量为10mg/kg。

技术总结
本发明涉及医药技术领域，提供了一种伊马替尼在抑制纤维瘢痕治疗脊髓损伤中的新用途。所述伊马替尼通过阻断PDGF-BB/PDGFRβ信号通路抑制周细胞-成纤维细胞转化，减少维瘢痕形成，促进运动功能恢复和轴突再生。且当用于抑制纤维瘢痕治疗脊髓损伤时，伊马替尼采用鞘内注射形式，疗程为每天注射，剂量10mg/kg。本发明基于发现Imatinib治疗脊髓损伤的有效结果，提供了伊马替尼治疗脊髓损伤抑制纤维瘢痕形成的特异性靶点和用药方式，扩大了经典化疗药物Imatinib的治疗用途。物Imatinib的治疗用途。物Imatinib的治疗用途。


技术研发人员：荆珏华 程里 郑嵋戈 姚飞 余水生 李子煜
受保护的技术使用者：安徽医科大学第二附属医院
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/8/24