一种基于RPA-CRISPR的2019-nCOV一步法检测体系及其应用的制作方法

一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测体系及其应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，涉及一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测体系及其应用。


背景技术：

2.核酸检测是新冠确诊的金标准。除了常规pcr检测，这两年核酸poct检测日新月异，产品层出不穷。例如雅培的以near为基础的idnow平台，以lamp技术为基础的博奥生物晶芯rtisochiptm-a核酸分析系统等。上述核酸扩增技术在检测灵敏度、特异性方面仍有待提升。
3.crispr被誉为“下一代分子检测技术”，灵敏度高，特异性强。然而现有新冠crispr检测方案，无内标，无法质控样本质量，分步检测操作繁琐，易污染，耗时长。
4.专利申请cn114807435a公开了一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂盒及其应用，检测靶标及体系均是针对呼吸道合胞病毒的，实施方案是两步法反应，中间开盖易污染，且不含内标，无法质控样本质量，检测灵敏度100ag/ul，约等于10copy/ul，灵敏度较低。
5.专利申请cn112239795a公开了一种基于rt-rpa和crispr的可视化新冠病毒rna核酸检测试剂盒，本质是两步反应，只是用物理方式分隔了rpa/crispr反应液，rpa在管底，crispr反应液在管盖上，crispr反应液还是容易在操作过程中掉入管底，反应体系中不含内标，无法质控样本质量，且检测下限5拷贝与阴性对比不明显，稳定下限为50拷贝，明显过高。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测体系及其应用，以解决现有新冠检测方法无内标，无法质控样本质量，分步检测操作繁琐，易污染，耗时长等问题。
7.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.1、一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测体系，包含：orf引物组合与orf-grna、和/或n引物组合与n-grna，cas蛋白，报告探针；
9.（1）当cas蛋白为cas12a时，orf引物组合与orf-grna如表1-1所示；
[0010][0011]
n引物组合与n-grna如表1-2所示；
[0012]
[0013][0014]
（2）当cas蛋白为cas13a时，orf引物组合、n引物组合分别是在表1-1、表1-2上游引物5’添加t7启动子序列taatacgactcactatagggaga即可，orf引物组合与orf-grna如表1-3所示；
[0015][0016]
n引物组合与n-grna如表1-4所示；
[0017][0018]
作为优选的技术方案之一，当cas蛋白为cas12a时，所述orf rpa引物对为f2r1：
[0019]
aacttgtgctaatgaccctgtgggttttaca，如seq id no.5所示；
[0020]
attgtgcatcagctgactgaagcatgggttc，如seq id no.10所示；
[0021]
orf-crrna 为：uaauuucuacuaaguguagauugucagacauggcagacgccauac，如seq id no.36所示；
[0022]
所述n rpa引物对为f7r1：
[0023]
gatcaaaacaacgtcggccccaaggtttac，如seq id no.24所示；
[0024]
attggtgttaattggaacgccttgtcctcg，如seq id no.27所示；
[0025]
n crrna为：
[0026]
uaauuucuacuaaguguagauuugcagccgggguuccaaaugggu，如seq id no.40所示；
[0027]
当cas蛋白为cas13a时，orf引物组合是在表1-1中 f2r1上游引物5’添加t7启动子序列taatacgactcactatagggaga即可，orf-crrna为：
[0028]
gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacuaaccuuuccacauaccgcagacggu，如seq id no.49所示；
[0029]
n引物组合是在表1-2中f7r1上游引物5’添加t7启动子序列taatacgactcactatagggaga即可，n-crrna为：
[0030]
gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac guguuaauuggaacgccuuguccucgag，如seq id no.56所示。
[0031]
作为优选的技术方案之一，当cas蛋白为cas12a时，报告探针为uuauu。
[0032]
作为优选的技术方案之一，当cas蛋白为cas13a时，报告探针为uuuuuu。
[0033]
作为进一步优选的技术方案之一，对于荧光法体系，报告探针的一端标记荧光基
团、另一端标记淬灭基团；对于试纸条法体系，报告探针的一端标记荧光基团、另一端标记与试纸条检测线相结合的生物素、抗原、抗体中的任一种。
[0034]
作为更进一步优选的技术方案之一，所述试纸条包含标记有与所述荧光基团结合抗体的显色微球，与所述生物素、抗原、抗体中的任一种结合的蛋白。
[0035]
作为优选的技术方案之一，所述检测体系还包含rp rpa引物及探针，具体包括：
[0036]
上游引物f6：5
’‑
cctgctatcaaagactccacaatgagaagg
ꢀ‑3’
，如seq id no.62所示；
[0037]
下游引物r4：5
’‑
ccacgtcatatggccctcttatttctaaag
ꢀ‑3’
，如seq id no.66所示；
[0038]
rp rpa探针p3：5
’‑
tcaaagactccacaatgagaaggtatacaat[fam][thf]t[bhq1]ccagtgccctcaatt
ꢀ‑3’
，如seq id no.81所示。
[0039]
作为进一步优选的技术方案之一，所述检测体系中cas12a工作浓度0.02～0.06μm，进一步优选为0.04μm，所述grna工作浓度0.04～0.08μm，进一步优选为0.04μm。
[0040]
作为更进一步优选的技术方案之一，所述检测体系中还包括工作浓度0.02m hepes（4-羟乙基哌嗪乙磺酸），0.01m mgcl2（氯化镁），0.3μm报告探针 ，0.2u/ul rnase抑制剂（核糖核酸酶抑制剂），0.4μm的orf上游引物和/或0.4μm的n上游引物，0.4μm的orf下游引物和/或0.4μm的n下游引物。
[0041]
作为进一步优选的技术方案之一，所述检测体系中cas13a工作浓度0.02～0.1μm，进一步优选为0.1μm，所述grna工作浓度0.06-0.1μm，进一步优选为0.08μm。
[0042]
作为更进一步优选的技术方案之一，所述检测体系中还包括工作浓度2mm的 ntp混合物，0.02m 的hepes（4-羟乙基哌嗪乙磺酸），0.01m 的mgcl2（氯化镁），0.3μm的报告探针 ，0.02μm 的t7，0.2u/ul的 rnase抑制剂（核糖核酸酶抑制剂），0.4μm的orf上游引物和/或0.4μm的n 上游引物，0.4μm的orf下游引物和/或0.4μm的n下游引物。
[0043]
作为更进一步优选的技术方案之一，所述检测体系中还包括工作浓度0.4μm的rp上游引物，0.4μm的rp下游引物2μl，0.12μm的rp探针。
[0044]
2、前述检测体系在制备2019-ncov一步法检测试剂或试剂盒中的应用。
[0045]
3、采用前述检测体系的一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测试剂或试剂盒。
[0046]
具体包括以下四种检测方案：
[0047]
方案一：一步法rpa/crispr-cas12a（内标rp）荧光pcr法检测2019-ncov
[0048]
将核酸模板、n或orf引物、rp引物探针、rt-raa试剂、cas12a蛋白、报告探针，以及所述crrna分子在crispr-cas12a反应体系里37℃反应60分钟，进行荧光强度的检测。
[0049]
方案二：一步法rpa/crispr-cas13a（内标rp）荧光pcr法检测2019-ncov
[0050]
将核酸模板、n或orf引物、rp引物探针、rt-raa试剂、cas13a蛋白、报告探针，以及所述crrna分子在crispr-cas13a反应体系里37℃反应60分钟，进行荧光强度的检测。
[0051]
方案三：一步法rpa/crispr-cas12a（内标rp）试纸条法检测2019-ncov
[0052]
将核酸模板、n或orf引物、rp引物探针、rt-raa试剂、cas12a蛋白、报告探针，以及所述crrna分子在crispr-cas12a反应体系里37℃反应60分钟，将反应产物稀释10倍后上试纸条检测，5-10分钟观察显色。
[0053]
方案四：一步法rpa/crispr-cas13a（内标rp）试纸条法检测2019-ncov
[0054]
将核酸模板、n或orf引物、rp引物探针、rt-raa试剂、cas13a蛋白、报告探针，以及
所述crrna分子在crispr-cas13a反应体系里37℃反应60分钟，将反应产物稀释10倍后上试纸条检测，5-10分钟观察显色。
[0055]
本发明的有益效果在于：
[0056]
本发明采用一步法raa恒温扩增技术保证检测的高灵敏度，联合crispr检测技术，可精确识别单碱基差异，保证了检测的高特异性，操作简便，且能防止污染。具体分析如下：
[0057]
1）含内标，内标与靶标同时检测，可对样本质量进行质控
[0058]
2）raa/crispr单管一步加样反应，防污染，操作简便，耗时短；
[0059]
3）检测灵敏：5拷贝/t；
[0060]
4）检测特异：与常见呼吸道病原体无交叉；
[0061]
5）临床符合率高：100%。
附图说明
[0062]
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
[0063]
图1为2019-ncov-orf rpa引物筛选结果图，其中，（a）为1-16，（b）为17-32，（c）为33-49，各条带含义如下：1：f1-r1；2：f1-r2；3：f1-r3；4:f1-r4；5：f1-r5；6：f1-r6；7：f1-r7；8：f1-r8；9：f2-r1；10：f2-r2；11：f2-r3；12：f2-r4；13：f2-r5；14：f2-r6；15：f2-r7；16：f2-r8；17：f3-r1；18:f3-r2；19：f3-r3；20：f3-r4；21：f3-r5；22：f3-r6；23：f3-r7；24：f3-r8；25：f4-r1；26：f4-r2；27：f4-r3；28：f4-r4；29：f4-r5；30：f4-r6；31：f4-r7；32：f4-r8；33：f5-r1；34：f5-r2；35：f5-r3；36：f5-r4；37：f5-r5；38：f5-r6；39：f5-r7；40：f5-r8；41：f6-r1；42：f6-r2；43：f6-r3；44：f6-r4；45：f6-r5；46：f6-r6；47：f6-r7；48:f6-r8；49:h2o。
[0064]
图2为2019-ncov-n rpa引物筛选结果图，其中，其中，（a）为1-24，（b）为25-48，（c）为49-73，各条带含义如下：1：f1-r1；2：f1-r2；3：f1-r3；4:f1-r4；5：f1-r5；6：f1-r6；7：f1-r7；8：f1-r8；9：f2-r1；10：f2-r2；11：f2-r3；12：f2-r4；13：f2-r5；14：f2-r6；15：f2-r7；16：f2-r8；17：f3-r1；18:f3-r2；19：f3-r3；20：f3-r4；21：f3-r5；22：f3-r6；23：f3-r7；24：f3-r8；25：f4-r1；26：f4-r2；27：f4-r3；28：f4-r4；29：f4-r5；30：f4-r6；31：f4-r7；32：f4-r8；33：f5-r1；34：f5-r2；35：f5-r3；36：f5-r4；37：f5-r5；38：f5-r6；39：f5-r7；40：f5-r8；41：f6-r1；42：f6-r2；43：f6-r3；44：f6-r4；45：f6-r5；46：f6-r6；47：f6-r7；48:f6-r8；49：f7-r1；50：f7-r2；51：f7-r3；52：f7-r4；53：f7-r5；54：f7-r6；55：f7-r7；56：f7-r8；57：f8-r1；58：f8-r2；59：f8-r3；60：f8-r4；61：f8-r5；62：f8-r6；63：f8-r7；64：f8-r8；65：f9-r1：66：f9-r2；67：f9-r3；68：f9-r4；69：f9-r5；70：f9-r6；71：f9-r7：72：f9-r8；73：h2o。
[0065]
图3为rpa/cas12a 2019-ncov 试纸条检测结果，其中，（a）为2019-ncov-orf，（b）为2019-ncov-n。
[0066]
图4为rpa/cas13a 2019-ncov 试纸条检测结果，其中，（a）为2019-ncov-orf，（b）为2019-ncov-n。
具体实施方式
[0067]
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
[0068]
实施例中涉及的试剂及其来源如下：rna恒温快速扩增试剂盒荧光型（上海良润），
rna恒温快速扩增试剂盒基础型（上海良润），ntp混合物（生工，b600057-0500，25mm），cas12a（上海良润，10μm），cas13a（上海良润，10μm），rna酶抑制剂（上海良润，200u/μl），t7 rna聚合酶（上海良润，10μm），hepes（4-羟乙基哌嗪乙磺酸，上海良润，1m） ，mgcl2（氯化镁）溶液(上海良润，1m)，无酶无菌水（索莱宝，r1600）试纸条（上海良润），样本处理液（安徽为臻）。
[0069]
本发明涉及到的检测用的寡核酸序列全部由通用生物合成，浓度是10μm。
[0070]
实施例1：一步法rpa/crispr-cas12a（内标rp）荧光pcr法检测2019-ncov
[0071]
（一）rt-raa扩增所需引物设计及筛选
[0072]
1.rt-raa扩增引物的设计
[0073]
根据国家基因组科学数据中心(ng dc) 中公布的2019-ncov 病毒核酸序列(https://bigd .big .ac .cn/search？dbid＝2019ncovr&q＝2019-ncov&page＝1) ，根据序列比对结果在相对保守的n基因及orf设计相应的引物。引物由通用生物合成，具体见表1。
[0074]
[0075]
2.引物筛选
[0076]
2.1以经过免提取样本处理液处理后的2019-ncov假病毒（外购于金唯智，含：orf1a/b（seq id no.1）及n序列（seq id no.2），浓度1.5 e+9copy/ml）作为模板。
[0077]
2.2 orf：6条orf-f和8条orf-r引物组合测试，共计48组合；n：9条n-f和8条n-r引物组合测试，共计72组合。
[0078]
2.3进行rt-raa扩增（体系见表2），引物分别为表1所示的各引物组合，得到rt-raa扩增产物。设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。
[0079][0080]
具体扩增操作步骤如下：将混合好的表2所示的除缓冲液b以外的组分混合，共47 .5μl溶液加入到装有冻干粉的反应管中，使冻干粉充分重溶均匀。向每个反应管管盖上加入2.5μl 缓冲液b (乙酸镁) ，合上管盖，上下颠倒5-6次混匀，快速离心10秒钟。（若无特别说明，含rpa反应的体系均按照此步骤添加试剂）。将配置好的反应溶液置于42℃恒温金属浴或pcr仪中反应30分钟，扩增完成后取出。
[0081]
2.4取50μl扩增产物，加入50μl的三氯甲烷：tris平衡酚＝1：1与反应后产物等量混匀，振荡后离心10min，弃去上清的混合液中，振荡混匀，10000rpm离心10min，吸取上清15μl，加入2μl 10*上样缓冲液，混匀后琼脂糖凝胶电泳。
[0082]
2.5 orf rpa引物筛选结果如图1中，（a）为1-16，（b）为17-32，（c）为33-49：较优的组合是f2r1/f1r4/f4r1/f6r1/f1r6，最优f2r1；
[0083]
n rpa引物筛选结果如图2中，（a）为1-24，（b）为25-48，（c）为49-73：较优的组合是f1r6/f2r6/f2r8/f3r4/f5r6/f6r2/f6r4/f7r1/f7r3/f8r1/f9r4，最优f7r1。
[0084]
（二）crrna设计及筛选
[0085]
1.crrna设计
[0086] 根据已确定的n及orf引物组合，设计相应的crrna，crrna序列如表3。通用生物合成。
[0087][0088]
2.crrna筛选
[0089]
2.1 以经过免提取样本处理液处理后的2019-ncov假病毒（外购于金唯智，含：orf1a/b及n序列，浓度1.5 e+9copy/ml）作为模板。
[0090]
2.2 报告探针选择ttatt，荧光标记fam。
[0091]
2.3crrna筛选体系，见表4。
[0092][0093]
具体配制操作同rt-raa扩增操作。
[0094]
反应条件：37℃，30s，60cycles（循环）。
[0095]
2.2筛选结果
[0096]
检测结果如表5，orf-crrna-2及n crrna-2荧光信号值最高，效率最高。故选择orf-crrna-2及n-crrna-2。
[0097][0098]
（三）报告探针筛选
[0099]
1.报告探针序列
[0100]
为筛选出最适配rpa/cas12a荧光pcr法检测的报告探针，通过rna修饰的方法合成了 3种含有不同碱基种类的报告探针，报告探针具体序列见表6，且两端分别标记fam 和bhq1。
[0101][0102]
2.检测体系同crrna筛选反应体系。检测数据见表7，结果显示报告探针-1的荧光信号值最高，最佳。因此，选择序列为ttatt的报告探针。
[0103][0104]
（四）一步法rpa/crispr-cas12a荧光pcr法检测2019-ncov
[0105]
1.根据筛选的最佳rpa引物、报告探针及crrna，调整关键试剂用量确定最佳一步法rpa/cas12a检测体系，见表8。共计5个检测方案。
[0106]
2.根据检测结果表9，方案4荧光值最高，定为2019-ncov rpa/cas12a检测方案。
[0107][0108]
反应条件：37℃，30s，60cycles。
[0109][0110]
实施例2：一步法rpa/crispr-cas13a荧光pcr法检测2019-ncov
[0111]
（一）rt-raa扩增所需引物设计及筛选
[0112]
1.rt-raa扩增引物的设计
[0113]
实施例1已确定最佳orf及n基因rt-raa引物组合，在此上游引物5’添加t7启动子序列(taatacgactcactatagggaga)即可使用。具体见表10。
[0114]
[0115]
（二）crrna设计及筛选
[0116]
1.crrna设计
[0117] 根据已确定的n基因及orf引物组合，设计相应的crrna，crrna序列如表11。通用生物合成。
[0118][0119]
2.crrna筛选
[0120]
2.1 以经免提取样本处理液处理的假病毒作为模板（外购于金唯智，含orf及n基因，浓度1.5 e+9拷贝/ml）
[0121]
2.2 报告探针为序列两端分别标记荧光基团fam 和猝灭基团bhq 1的5u(通用生物合成)。
[0122]
2.3 crrna筛选体系，见表12。
[0123][0124]
反应条件：37℃，30s，60cycles（循环）。
[0125]
2.2筛选结果
[0126]
根据检测结果如表13，orf-crrna-3及n crrna-5荧光信号值最高，效率最高。故选择orf-crrna-3及n-crrna-5。
[0127][0128]
（三）报告探针筛选
[0129]
1.报告探针序列
[0130]
为筛选出最适配rpa/cas13a荧光pcr法检测的报告探针，通过rna修饰的方法合成了 3种含有不同碱基种类的报告探针，报告探针具体序列见表14，且两端分别标记荧光基团fam 和猝灭基团bhq1。
[0131][0132]
2.检测体系同表12crrna筛选反应体系，检测数据如表15，结果显示报告探针-3的荧光信号值最高，最佳。因此，选择序列为6u的报告探针。
[0133][0134]
（四）一步法rpa/crispr-cas13a荧光pcr法检测2019-ncov体系优化确定
[0135]
1.根据筛选的最佳rpa引物、报告探针及crrna，优化用量确定一步法rpa/cas13a 检测体系，见表16。
[0136]
2.根据检测结果如表17，方案3荧光值最高，定为2019-ncov rpa/cas13a检测方案。
[0137][0138]
反应条件：37℃，30s，60cycles（循环）。
[0139][0140]
实施例3：rp基因检测方案
[0141]
（一）rp引物探针设计及筛选
[0142]
1.rp引物探针设计
[0143][0144][0145]
2.rp引物探针筛选
[0146]
2.1于金唯智合成rp 检测区段，浓度为40ng/ul，作为模板用于后续筛选。
[0147]
2.2如表18和表19所示，rp上游引物6组，下游引物16组，探针3组，交叉组合测试，共计288组合。
[0148]
2.3 rp检测体系：具体操作步骤同实施例1 rt-raa扩增方案，见表20。
[0149][0150]
2.4 检测结果如表21，f6/r4/p3的荧光值最高，故确定rp最佳引物探针组合为f6/r4/p3。
[0151]
[0152]
[0153]
[0154]
[0155]
[0156]
[0157]
[0158][0159]
实施例4：一步法rpa/crispr（含内标rp）荧光pcr法检测2019-ncov体系
[0160]
（一）一步法rpa/cas12a（含内标rp）荧光pcr法检测2019-ncov体系
[0161]
1. 以经过处理的假病毒（购自金唯智）及rp模板（人t47d细胞rna）（seq id no.3） 1：1混合液作为模板，orf基因选用f2r1、n基因选用f7r1、rp基因选用f6r4p3，按照表22体系扩增后置于荧光定量pcr仪，反应条件：37℃，30s，60cycles（循环）。将假病毒替换为双蒸水即为阴性对照。
[0162][0163]
2检测结果如表23，靶标2019-ncov-n/orf分别及内标共检，均可以正常检出。
[0164][0165]
（二）一步法rpa/cas13a（含内标rp）荧光pcr法检测2019-ncov体系
[0166]
1.以经过处理的假病毒及rp模板 1：1混合液作为模板，orf基因选用f2r1、n基因选用f7r1、rp基因选用f6r4p3，按照如表24所示体系扩增后置于荧光定量pcr仪，反应条件：37℃，30s，60cycles（循环）。将假病毒替换为双蒸水即为阴性对照。
[0167][0168]
2 检测结果如表25，靶标2019-ncov-n/orf分别及内标共检，均可以正常检出。
[0169][0170]
实施例5：一步法rpa/cas12a（含内标rp）试纸条法检测2019-ncov
[0171]
1.根据实施例1中已确定一步法荧光pcr检测方案，将已筛选的荧光标记的报告探针替换为抗原（fam及生物素）标记，以假病毒及rp 混合液作为模板，orf基因选用f2r1、n基因选用f7r1、rp基因选用f6r4p3，按照表26配制反应液。
[0172]
2.该反应体系使用基础型raa恒温扩增试剂盒。
[0173][0174]
2.将表中的模板替换为双蒸水，且保持其他试剂组分不变，即为阴性对照。
[0175]
3.将上述反应管放置在37℃金属浴或pcr仪反应60分钟，得到反应产物。
[0176]
4.试纸条检测
[0177]
将使用无酶无菌水将上述3得到的反应产物稀释10倍，取50
µ
l加入试纸条的样品板的加样孔中，静置5-10分钟肉眼观察。
[0178]
5.结果判定
[0179]
若试纸没有“t”线显现且有“c”线显现，则待测样本含有或候选含有新型冠状病毒，内标正常检出（c线）；若试纸有“t”线显现且有“c”线显现，则待测样本不含有或候选不含有新型冠状病毒；若试纸没有“c”线显现，则内标未检出，需重新实验。
[0180]
6.检测结果如图3中，（a）为2019-ncov-orf，（b）为2019-ncov-n， rpa/cas12a一步法检测体系可检测orf及n，且内标正常检出。
[0181]
实施例6：一步法rpa/cas13a（含内标rp）试纸条法检测2019-ncov体系
[0182]
1.根据实施例2中已确定一步法荧光pcr检测方案，将荧光标记的报告探针替换为抗原（fam及生物素）标记。orf基因选用f2r1、n基因选用f7r1、rp基因选用f6r4p3，按照表27配制反应液。
[0183]
2.该反应体系使用基础型raa恒温扩增试剂盒。
[0184][0185]
3.操作步骤同实施例4
[0186]
4.检测结果如图4中，（a）为2019-ncov-orf，（b）为2019-ncov-n， 一步法rpa/cas13a检测体系可检测orf及n，内标正常。
[0187]
实施例7：基于crispr系统的新型冠状病毒核酸的检测方法的灵敏度检测
[0188]
1.将实施例1的中的假病毒调整浓度至1e+6拷贝/μl，利用无酶无菌水进行10倍系列梯度稀释，得到含有不同浓度新型冠状病毒基因的溶液。在获得的溶液中添加相同浓度的rp rna；
[0189]
2.按照实施例4、5、6的方案进行检测。
[0190]
3.检测结果如表28-29，发明涉及4种检测方法检测灵敏度到5拷贝/t。
[0191]
[0192][0193]
实施例8：基于crispr系统的新型冠状病毒核酸的检测方法的特异性检测
[0194]
1.以肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、冠状病毒oc43、冠状病毒nl63、冠状病毒hku-1、禽流感h7n9、禽流感h5n1、乙型流感病毒、甲型流感病毒、eb病毒、副流感2型核酸作为模板，按照实施例4、5、6所确定的方案检测常见病原体核酸，以验证本发明方法的特异性。
[0195]
2.检测结果如表30-31，发明涉及4种检测方法具有很高的特异性，检测过程中不存在交叉反应。
[0196]
[0197][0198]
实施例9：新型冠状病毒核酸样本检测
[0199]
1.使用上述建立的基于crispr系统新冠病毒n基因及orf基因的检测方法，对经过
荧光定量pcr法确认的新冠病毒核酸样本进行检测，验证一步法rpa/crispr荧光/试纸条检测对实际核酸样本的检出情况。
[0200]
2.使用上海伯杰医疗科技有限公司的新型冠状病毒2019-ncov核酸检测试剂盒(荧光pcr法)，国械注准 20203400065，对新型冠状病毒样本核酸进行检测与鉴定。按照说明书配制反应体系，使用bio-rad 7500荧光定量pcr仪对样本核酸进行检测。
[0201]
3.本次试验共收到165例新型冠状病毒环境样本，包含85例阳性样本、80例阴性样本。经荧光定量rt-pcr实验验证后，所有核酸样本完整性良好。
[0202]
4.使用本研究实施例4/5/6建立的基于crispr技术的4种检测方法，对新型冠状病毒核酸样本进行检测。检测结果如表32所示，阳性样本全部检出，阴性样本全部检出，该检测方法的检测阳性符合率为100％，阴性符合率为100％，总体符合率100%。能有效检出新型冠状病毒的核酸样本，与荧光定量pcr法一致性高。
[0203][0204]
实施例10：不同检测组合性能评价
[0205]
将实施例1和2筛选所得的可实现rpa-crispr系统一步法检测的新冠病毒检测所用的寡核酸组合（最优组合和较优组合），均采用荧光法分别按照实施例7/8/9的方法进行灵敏度、特异性、样本检测阳性符合率和阴性符合率的评价（2种crrna中的次结果）。并将淘汰的寡核酸组合进行了灵敏度检测，发现检测灵敏度≥500拷贝或无扩增，无法满足临床检测需求，不再进行特异性、临床样本检测阳性符合率和阴性符合率的评价。
[0206]
检测结果（表33）显示，较优组合的临床样本检测阳性符合率均超过95%、阴性符合率均超过98%，可以满足临床检测需求，可作为rpa-crispr系统一步法检测的新冠病毒的备选。
[0207]
[0208]
[0209][0210]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

技术特征：
id no.49所示；orf rpa引物对为f1r4上游引物5’添加t7启动子序列，orf-crrna的核苷酸序列如seq id no.89所示；orf rpa引物对为f4r1上游引物5’添加t7启动子序列，orf-crrna的核苷酸序列如seq id no.90所示；orf rpa引物对为f6r1上游引物5’添加t7启动子序列，orf-crrna的核苷酸序列如seq id no.91所示；orf rpa引物对为f1r6上游引物5’添加t7启动子序列，orf-crrna的核苷酸序列如seq id no.89所示；n引物组合与n-grna如以下任一种所示：n rpa引物对为f1r6上游引物5’添加t7启动子序列，n-crrna的核苷酸序列如seq id no.93所示；n rpa引物对为f2r6上游引物5’添加t7启动子序列，n-crrna的核苷酸序列如seq id no.93所示；n rpa引物对为f2r8上游引物5’添加t7启动子序列，n-crrna的核苷酸序列如seq id no.93所示；n rpa引物对为f3r4上游引物5’添加t7启动子序列，n-crrna的核苷酸序列如seq id no.94所示；n rpa引物对为f5r6上游引物5’添加t7启动子序列，n-crrna的核苷酸序列如seq id no.95所示；n rpa引物对为f6r2上游引物5’添加t7启动子序列，n-crrna的核苷酸序列如seq id no.96所示；n rpa引物对为f6r4上游引物5’添加t7启动子序列，n-crrna的核苷酸序列如seq id no.96所示；n rpa引物对为f7r1上游引物5’添加t7启动子序列，n-crrna的核苷酸序列如seq id no.56所示；n rpa引物对为f7r3上游引物5’添加t7启动子序列，n-crrna的核苷酸序列如seq id no.97所示；n rpa引物对为f8r1上游引物5’添加t7启动子序列，n-crrna的核苷酸序列如seq id no.98所示；n rpa引物对为f9r4上游引物5’添加t7启动子序列，n-crrna的核苷酸序列如seq id no.99所示。2.根据权利要求1所述的一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测体系，其特征在于，当cas蛋白为cas12a时，所述orf rpa引物对为f2r1：aacttgtgctaatgaccctgtgggttttaca，如seq id no.5所示；attgtgcatcagctgactgaagcatgggttc，如seq id no.10所示；orf-crrna 为：uaauuucuacuaaguguagauugucagacauggcagacgccauac，如seq id no.36所示；所述n rpa引物对为f7r1：
gatcaaaacaacgtcggccccaaggtttac，如seq id no.24所示；attggtgttaattggaacgccttgtcctcg，如seq id no.27所示；n crrna为：uaauuucuacuaaguguagauuugcagccgggguuccaaaugggu，如seq id no.40所示；当cas蛋白为cas13a时，orf引物组合是在表1-1中 f2r1上游引物5’添加t7启动子序列taatacgactcactatagggaga即可，orf-crrna为：gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacuaaccuuuccacauaccgcagacggu，如seq id no.49所示；n引物组合是在表1-2中f7r1上游引物5’添加t7启动子序列taatacgactcactatagggaga即可，n-crrna为：gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac guguuaauuggaacgccuuguccucgag，如seq id no.56所示。3.根据权利要求1所述的一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测体系，其特征在于，当cas蛋白为cas12a时，报告探针的核苷酸序列为 ttatt。4.根据权利要求1所述的一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测体系，其特征在于，当cas蛋白为cas13a时，报告探针的核苷酸序列为uuuuuu。5.根据权利要求3或4任一所述的一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测体系，其特征在于，对于荧光法体系，报告探针的一端标记荧光基团、另一端标记淬灭基团；对于试纸条法体系，报告探针的一端标记荧光基团、另一端标记与试纸条检测线相结合的生物素、抗原、抗体中的任一种。6.根据权利要求5所述的一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测体系，其特征在于，所述试纸条包含标记有与所述荧光基团结合抗体的显色微球，与所述生物素、抗原、抗体中的任一种结合的蛋白。7.根据权利要求1所述的一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测体系，其特征在于，所述检测体系还包含rp rpa引物及探针，具体包括：上游引物f6：5
’‑
cctgctatcaaagactccacaatgagaagg
ꢀ‑3’
，如seq id no.62所示；下游引物r4：5
’‑
ccacgtcatatggccctcttatttctaaag
ꢀ‑3’
，如seq id no.66所示；rp rpa探针p3：5
’‑
tcaaagactccacaatgagaaggtatacaat[fam][thf]t[bhq1]ccagtgccctcaatt
ꢀ‑3’
，如seq id no.81所示。8.根据权利要求3或7任一所述的一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测体系，其特征在于，所述检测体系中cas12a工作浓度0.02～0.06μm，进一步优选为0.04μm，所述grna工作浓度0.04～0.08μm，进一步优选为0.04μm。9.根据权利要求8所述的一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测体系，其特征在于，所述检测体系中还包括工作浓度0.02m hepes，0.01m mgcl2 ，0.3μm报告探针 ，0.2u/ul rnase抑制剂，0.4μm的orf上游引物和/或0.4μm的n 上游引物，0.4μm的orf下游引物和/或0.4μm的n下游引物。10.根据权利要求4所述的一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测体系，其特征在于，所述检测体系中cas13a工作浓度0.02～0.1μm，进一步优选为0.1μm，所述grna工作浓度0.06-0.1μm，进一步优选为0.08μm。
11.根据权利要求10所述的一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测体系，其特征在于，所述检测体系中还包括工作浓度2mm的 ntp mix，0.02m 的hepes，0.01m 的mgcl2，0.3μm的报告探针 ，0.02μm 的t7，0.2u/ul的 rnase抑制剂，0.4μm的orf上游引物和/或0.4μm的n 上游引物，0.4μm的orf下游引物和/或0.4μm的n下游引物。12.根据权利要求9或11所述的一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测体系，其特征在于，所述检测体系中还包括工作浓度0.4μm的rp上游引物，0.4μm的rp下游引物2μl，0.12μm的rp探针。13.权利要求1～12中任一项所述检测体系在制备2019-ncov一步法检测试剂或试剂盒中的应用。14.采用权利要求1～12中任一项所述检测体系的一种基于rpa-crispr的2019-ncov一步法检测试剂或试剂盒。

技术总结
本发明涉及一种基于RPA-CRISPR的2019-nCOV一步法检测体系及其应用，采用一步法RAA恒温扩增技术保证检测的高灵敏度，联合CRISPR检测技术，可精确识别单碱基差异，保证了检测的高特异性，操作简便，且能防止污染。具体分析如下：1）含内标，内标与靶标同时检测，可对样本质量进行质控；2）RAA/CRISPR单管一步加样反应，防污染，操作简便，耗时短；3）检测灵敏：5拷贝/T；4）检测特异：与常见呼吸道病原体无交叉；5）临床符合率高：100%。100%。100%。


技术研发人员：渠香云 刘洋 蒋晓旭 朱红雨 袁升 王弢 张田田
受保护的技术使用者：江苏为真生物医药技术股份有限公司
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/8/24