用于神经母瘤基因治疗的慢病毒及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及ipc分类号c12n15/86下的病毒载体领域，具体涉及一种用于神经母瘤基因治疗的慢病毒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外肿瘤，是婴幼儿最常见的肿瘤。有将近一半的神经母细胞瘤发生在2岁以内的婴幼儿。神经母细胞瘤约占6-10％的儿童肿瘤，15％的儿童肿瘤死亡率。神经母细胞瘤属于神经内分泌性肿瘤，可以起源于交感神经系统的任意神经脊部位。其最常见的发生部位是肾上腺，但也可以发生在颈部、胸部、腹部以及盆腔的神经组织。目前已知有少数几种人类肿瘤，可自发性地从未分化的恶性肿瘤退变为完全良性肿瘤，神经母细胞瘤就属于其中之一。
3.肿瘤的生长和转移是依托癌细胞的增殖和迁移实现的，而癌细胞的增殖和迁移往往伴随着一些基因的过度表达。而对这些过度表达的基因进行敲除和沉默，则可以抑制肿瘤的生长和转移，进一步抑制癌症的发展。因此，基因治疗代表了一种新的、具有潜力的、长期有效的癌症控制方式。
4.rna干扰(rna interference,rnai)是指在进化过程中高度保守的、由双链rna(double-stranded rna，dsrna)诱发的、同源mrna高效特异性降解的现象。病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsrna。宿主细胞对这些dsrna迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶dicer将dsrna切割成多个具有特定长度和结构的小片段rna(大约21～23bp)，即sirna。sirna在细胞内rna解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义sirna再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成rna诱导的沉默复合物(rna-induced silencing complex，risc)。risc与外源性基因表达的mrna的同源区进行特异性结合，risc具有核酸酶的功能，在结合部位切割mrna，切割位点即是与sirna中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mrna随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mrna的降解反应。sirna不仅能引导risc切割同源单链mrna，而且可作为引物与靶rna结合并在rna聚合酶(rna-dependent rna polymerase，rdrp)作用下合成更多新的dsrna，新合成的dsrna再由dicer切割产生大量的次级sirna，从而使rnai的作用进一步放大，最终将靶mrna完全降解。慢病毒被广泛地应用于表达rnai的研究中，慢病毒载体能够产生表达shrna的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shrna，实现在多种类型的细胞中特异而稳定的基因表达的功能性沉默。
5.因此，如果能通过转染慢病毒载体对神经母细胞瘤中过度表达的基因进行靶向敲减抑制，则可以有效地特异性遏制神经母细胞瘤的发生发展。现有技术cn 112522318a公开了一种神经母细胞mir-200b/c高表达的慢病毒表达载体，可在神经母细胞中稳定地抑制mirna-200b/c表达，进而对基因表达起到调控作用；但该慢病毒的表达对神经母细胞瘤细胞的增殖和迁移没有可被证实的抑制效果。


技术实现要素：

6.为了遏制神经母细胞瘤的发生发展，本发明人筛选出了在神经母瘤细胞中活跃表达的enpp6基因作为作用靶点，设计出针对enpp6进行rna干扰的br-v108重组慢病毒载体，有效敲减其表达，从而抑制神经母瘤细胞的增殖和迁移，实现神经母瘤的基因治疗。
7.基于此，本发明的目的在于提供一种用于神经母瘤基因治疗慢病毒。
8.另一方面，本发明的目的还在于提供上述慢病毒的制备方法。
9.另一方面，本发明的目的还在于提供上述慢病毒在制备治疗与enpp6基因过表达有关的疾病的药物中的应用、在制备治疗神经母细胞瘤的药物中的应用和在制备抑制癌细胞增殖的药物中的应用。
10.为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
11.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒由br-v108重组慢病毒载体制备得到，所述br-v108重组慢病毒载体由质粒载体br-v108经过age i和ecor i酶切后，连入带age i和ecor i粘性末端的rnai-111特异靶序列重组而得。
12.优选地，所述rnai-111特异靶序列选自rnai-11100、rnai-11101、rnai-11102靶序列。
13.优选地，所述rnai-111特异靶序列如seq id no.1-3任一项所示。
14.rnai-11100、rnai-11101、rnai-11102靶序列的序列分别对应seq id no.1-3所示的序列。
15.优选地，所述br-v108重组慢病毒载体通过如下步骤构建：
16.a.化学合成寡核苷酸链引物，退火形成双链dna；
17.b.对br-v108载体进行酶切，酶切位点为ecor i/age i；
18.c.将上述双链dna与步骤a酶切后的载体相连，得到连接产物；
19.d.将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，培养后使用pcr对菌落进行鉴定，测序，取测序正确的菌液进行质粒抽提。
20.优选地，所述寡核苷酸链引物的序列如seq id no.4和5、或seq id no.6-7、或seq id no.8-9所示，其中，
21.seq id no.4为：f：ccggcaccaacaagtcctttgacatctcgagatgtcaaaggacttgttggtgttttttg，
22.seq id no.5为：r：aattcaaaaaacaccaacaagtcctttgacatctcgagatgtcaaaggacttgttggtg；
23.seq id no.6为：f：ccggcagcgatgctcttgactccttctcgagaaggagtcaagagcatcgctgttttttg，
24.seq id no.7为：r：aattcaaaaaacagcgatgctcttgactccttctcgagaaggagtcaagagcatcgctg；
25.seq id no.8为：f：ccggaaggaaagtttgtctctccttctcgagaaggagagacaaactttccttttttttg，
26.seq id no.9为：r：aattcaaaaaaaaggaaagtttgtctctccttctcgagaaggagagacaaactttcctt。
27.本发明还提供上述慢病毒的制备方法，包括如下步骤：
28.a.培养293t细胞；
29.b.将br-v108重组慢病毒载体、pmd2.g载体质粒、pspax2载体质粒和转染试剂混合得到混合液；
30.c.将混合液滴入293t细胞培养液中进行转染；
31.d.取转染后的细胞上清液，离心、过滤得病毒上清液；
32.e.将病毒上清液超速离心，弃去超速离心后的上清液a，加入病毒保存液，充分溶解后再次离心，取上清液b分装。
33.优选地，所述br-v108重组慢病毒载体、pmd2.g载体质粒、pspax2载体质粒的质量比为2：1.5：1。
34.本发明还提供上述慢病毒在制备治疗与enpp6基因过表达有关的疾病的药物中的应用。
35.本发明还提供上述慢病毒在制备治疗神经母细胞瘤的药物中的应用。
36.本发明还提供上述慢病毒在制备抑制癌细胞增殖的药物中的应用。
37.有益效果：
38.本发明创造性地发现了enpp6基因在神经母瘤细胞中的过度表达，通过设计出有效的enpp6干扰序列，合成了其双链dna，连接到br-v108慢病毒骨架质粒载体中，与辅助质粒共转染工具细胞293t，包装成含有rnai-111特异靶序列的br-v108重组慢病毒载体的慢病毒，其对神经母瘤细胞中的enpp6基因产生了靶向敲减效应，显著抑制了enpp6基因的转录，并在细胞层面上表现出对神经母瘤细胞的增殖抑制、清除和迁移抑制。由于使用了重组慢病毒载体，使得干扰效果产生了持续性作用，具有高效、稳定、特异性强的优点。除对神经母瘤的基因治疗有重要的指导意义以外，也为其他与enpp6基因过表达有关的疾病以及其他癌症的基因治疗奠定了良好的实验基础。
附图说明
39.图1为实施例1得到的含有rnai-11100的特异靶序列的慢病毒感染la-n-5细胞的感染前后荧光照片；
40.图2为实施例1得到的含有rnai-11100的特异靶序列的慢病毒感染sk-n-sh细胞的感染前后荧光照片；
41.图3为经慢病毒感染la-n-5细胞5天后，实验组与对照组细胞数量随时间变化的曲线；
42.图4为la-n-5细胞经阴性对照慢病毒感染后的细胞凋亡情况图；
43.图5为la-n-5细胞经实施例1得到的含有rnai-11100的特异靶序列的慢病毒感染后的细胞凋亡情况图；
44.图6为sk-n-sh细胞经阴性对照慢病毒感染后的细胞凋亡情况图；
45.图7为sk-n-sh细胞经实施例1得到的含有rnai-11100的特异靶序列的慢病毒感染后的细胞凋亡情况图；
46.图8为经慢病毒感染的sk-n-sh细胞克隆形成的数码照片，左列为shctrl细胞组，右列为shenpp6细胞组；
47.图9为经阴性对照慢病毒感染的la-n-5细胞划痕后0小时的划痕照片；
48.图10为经阴性对照慢病毒感染的la-n-5细胞划痕后48小时的划痕照片；
49.图11为经实施例1得到的含有rnai-11100的特异靶序列的慢病毒感染的la-n-5细胞划痕后0小时的划痕照片；
50.图12为经实施例1得到的含有rnai-11100的特异靶序列的慢病毒感染的la-n-5细胞划痕后48小时的划痕照片；
51.图13为经阴性对照慢病毒感染的sk-n-sh细胞划痕后0小时的划痕照片；
52.图14为经阴性对照慢病毒感染的sk-n-sh细胞划痕后72小时的划痕照片；
53.图15为经实施例1得到的含有rnai-11100的特异靶序列的慢病毒感染的sk-n-sh细胞划痕后0小时的划痕照片；
54.图16为经实施例1得到的含有rnai-11100的特异靶序列的慢病毒感染的sk-n-sh细胞划痕后72小时的划痕照片；
55.图17为经阴性对照慢病毒感染的sk-n-sh在transwell小室内孵育72小时后的转移细胞在200倍视野下的显微照片；
56.图18为经实施例1得到的含有rnai-11100的特异靶序列的慢病毒感染的sk-n-sh在transwell小室内孵育72小时后的转移细胞在200倍视野下的显微照片；
具体实施方式
57.实施例1
58.一、构建含有rnai-11100(seq id no.1)的特异靶序列的br-v108的重组慢病毒载体：
59.1、重组br-v108构建和基因编辑效果鉴定
60.a.目的基因片段的获取
61.(1)合成单链引物
62.f：ccggcaccaacaagtcctttgacatctcgagatgtcaaaggacttgttggt gttttttg；
63.r：aattcaaaaaacaccaacaagtcctttgacatctcgagatgtcaaaggac ttgttggtg。
64.(2)引物退火形成双链dna
65.合成的成对的引物干粉溶解于18.2m超纯水中配制成退火反应体系，混匀25℃下静置。退火反应体系如下所示：
[0066][0067]
在pcr仪上按照如下程序进行退火处理。
[0068][0069]
b.切割载体质粒
[0070]
酶切位点1：ecor i(#r0101l，neb)5'-gaattc-3'
[0071]
酶切位点2：age i(r3552l，neb)5'-accggt-3'。
[0072]
配制300μl酶切体系。按下表顺序依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，1000rpm离心30秒，置于37℃过夜。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。酶切体系如下所示：
[0073][0074]
c.退火产物与载体进行连接
[0075]
按照fermentas t4 dna ligase说明书配制20μl反应体系，将上述退火产物双链dna与线性化的载体相连。反应体系如下所示：
[0076][0077]
于16℃反应1h，之后进行转化实验。
[0078]
d.转化
[0079]
将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，详细操作步骤如下：
[0080]
1)将10μl连接产物加入到100μl大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min；
[0081]
2)42℃热激90s，冰浴2min；
[0082]
3)加入500μl无抗生素的lb液体培养基，200rpm于37℃摇床震荡培养1h；
[0083]
4)取150μl菌液均匀涂在含有amp的lb固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养。
[0084]
e.菌落pcr鉴定
[0085]
鉴定引物-f：ctatttcccatgattccttcatatttg
[0086]
鉴定引物-r：agttatgtaacgcggaactccatatatg
[0087]
配制20μl pcr反应体系，用无菌枪头挑取单个菌落为模板，进行pcr扩增，反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，22次循环；72℃5min。pcr结束后，取5μl产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测条带(电泳上样：空白对照以18.2m超纯水为模板；阴性对照以未插入目的基因的空br-v108载体为模板)。pcr反应体系如下：
[0088][0089]
f.测序
[0090]
将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃培养12h，取适量菌液进行测序。
[0091]
g.质粒抽提
[0092]
将测序正确的菌液转接于150ml含amp抗生素的lb液体培养基中，37℃摇床震荡培养过夜。按照endofree maxi plasmid kit说明书提取质粒，质检合格的质粒进入下游流程。
[0093]
二、br-v108慢病毒的包装：
[0094]
慢病毒包装载体为：
[0095]
携带目的基因或靶点序列的工具载体质粒(br-v108)、
[0096]
病毒包装辅助质粒(pmd2.g)、
[0097]
病毒包装辅助质粒(pspax2)。
[0098]
以qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种质粒，质粒溶于除菌的te中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒dna的a260/a280在1.8-2.0之间。
[0099]
本实施例所用试剂如下：
[0100][0101]
具体过程如下：
[0102]
a.质粒转染与慢病毒收获
[0103]
1.转染前18h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293t细胞，用含10％fbs培养基调整细胞密度约为5
×
106个/15ml，重新接种于10cm细胞培养皿中，37℃在5％ co2培养箱内培养。待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；
[0104]
2.转染前2h细胞培养基更换为无血清培养基；
[0105]
3.在500μl opti-mem r1培养基中加入各dna溶液(br-v108载体质粒10μg、pmd2.g载体质粒7.5μg、pspax2载体质粒5μg)，25℃下静置5min；在另一500μl opti-mem r1培养基中加入对应质量的懿贝瑞转染试剂，25℃下静置5min；将两者轻柔混匀并在25℃下静置20min；
[0106]
所述转染试剂为懿贝瑞公司生产的dyb3893；
[0107]
4.混合液缓慢滴加至293t细胞培养液中，轻轻混匀，放置37℃、5％co2细胞培养箱中培养；
[0108]
5.6h后更换10ml的10％ fbs培养基，37℃、5％ co2培养箱内继续培养48-72h。
[0109]
b.慢病毒浓缩与纯化
[0110]
1.根据细胞状态，收集转染后48h、72h(转染即可计为0h)的细胞上清液；
[0111]
2.于4℃、4000g离心10min，除去细胞碎片；
[0112]
3.0.45μm滤膜过滤上清液于40ml超速离心管中；
[0113]
4.分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至beckman超速离心机内,设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；
[0114]
5.离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入deme病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；
[0115]
6.经充分溶解后，高速离心10000rpm、5min后，取上清按要求分装。
[0116]
病毒滴度检测：
[0117]
将病毒上清以10倍梯度稀释，利用病毒计数仪(virocyt
tm
2100)直接进行病毒滴度的测定，如病毒滴度为1.5
×
107。为了检测活病毒含量，将病毒稀释150倍后(1.0
×
104)，感染293t细胞(1.0
×
104)，即m.o.i.＝1.0，48小时之后加入puromycin药物(终浓度2μg/ml)检测活细胞比率(没有病毒感染的细胞因不能表达puromycin抗性基因被药物杀死)，根据活细胞数量计算出病毒滴度。如活细胞数量为n，则病毒滴度为(n/1.0
×
104)
×
1.5
×
107。
[0118]
实施例2
[0119]
构建含有rnai-11101(seq id no.2)的特异靶序列的br-v108的重组慢病毒载体并包装成慢病毒：操作方法同实施例1，不同之处是：
[0120]
目的基因的获取中单链引物的序列为：
[0121]
f：
[0122]
ccggcagcgatgctcttgactccttctcgagaaggagtcaagagcatcgct gttttttg；
[0123]
r：
[0124]
aattcaaaaaacagcgatgctcttgactccttctcgagaaggagtcaaga gcatcgctg。
[0125]
实施例3
[0126]
构建含有rnai-11102(seq id no.3)的特异靶序列的br-v108的重组慢病毒载体并包装成慢病毒：操作方法同实施例1，不同之处是：
[0127]
目的基因的获取中单链引物的序列为：
[0128]
f：
[0129]
ccggaaggaaagtttgtctctccttctcgagaaggagagacaaactt tcctt ttttttg；
[0130]
r：
[0131]
aattcaaaaaaaaggaaagtttgtctctccttctcgagaaggagaga caaactttcctt。
[0132]
实施例4
[0133]
使用实施例1包装得到的含有rnai-11100靶序列的慢病毒感染目的细胞：
[0134]
1.目的细胞复苏：
[0135]
(1)从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并同时摇动使其尽快解冻。
[0136]
(2)完全解冻后，擦干冻存管。
[0137]
(3)移至离心机处，配平。转速：1000rpm，离心3min，取出。
[0138]
(4)使用75％酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。
[0139]
(5)弃上清。加1ml新鲜培养基，重悬细胞。
[0140]
(5)将细胞悬液接种至含有4ml完全培养基的6-cm dish中，(若10cm dish则加入8-10ml培养基)轻轻晃匀后置于37℃、5％ co2培养箱。
[0141]
(6)24h后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80％左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。
[0142]
2.目的细胞慢病毒感染：
[0143]
(1)贴壁细胞：
[0144]
a)处于对数生长期的细胞胰酶消化，制备成细胞悬液。
[0145]
b)根据所需铺板大小不同，加入不同细胞悬液。
[0146]
c)24小时后，细胞状态良好。弃培养基，加入感染液，同时加入所需病毒进行感染。
[0147]
d)感染20小时后，更换新制备的培养基。
[0148]
e)72小时后，显微镜下观察荧光及感染效率。
[0149]
(2)悬浮细胞
[0150]
a)无需消化细胞，根据所需铺板大小不同，加入不同细胞悬液。
[0151]
b)弃上层培养基(不要吸出细胞)，加入感染液同时加入所需病毒进行感染。
[0152]
c)感染20小时后，更换新制备的培养基。
[0153]
d)感染48小时，可根据细胞量多少扩大细胞培养板(如24well扩大至6well)。
[0154]
e)72小时后，显微镜下观察荧光及感染效率。
[0155]
对照及目的慢病毒感染目的细胞后72小时于显微镜下荧光观察，感染荧光照片如图1、2所示；观察结果显示细胞感染效率达到80％以上，细胞状态正常。
[0156]
本实施例中所用细胞信息如下：
[0157][0158]
本实施例中的病毒信息如下：
[0159][0160]
本实施例中各试剂及仪器来源如下：
[0161][0162][0163]
性能测试
[0164]
1.在mrna水平上检测敲减效率：通过real-time qpcr检测方法检测la-n-5细胞分别感染实施例1和2得到的慢病毒前后enpp6基因的表达丰度，试验参数如下：
[0165][0166]
检测结果如表1所示：
[0167]
表1
[0168][0169]
从定量pcr结果可以看出，la-n-5细胞中，感染慢病毒后，相对于shctrl组，shenpp6-1组enpp6的敲减效率达到了89.7％(p《0.001)，shenpp6-2组enpp6的敲减效率达到了69.6％(p《0.001)。
[0170]
2.hcs细胞增殖检测：参照celigo细胞计数实验方法检测分别感染阴性对照慢病毒和本发明实施例1得到的含有rnai-11100靶序列的慢病毒的人神经母细胞瘤细胞la-n-5的细胞数量，shctrl代表感染阴性对照慢病毒的la-n-5细胞组，shenpp6代表感染实施例1得到的含有rnai-11100靶序列的慢病毒的la-n-5细胞组。实验参数如下：
[0171][0172]
检测结果见图3，可以看出，慢病毒感染后，相比shctrl组，shenpp6组细胞增殖抑制明显(p《0.001，fold change＝-2.7)。
[0173]
3.细胞凋亡检测：采用annexin v-apc单染法使用流式细胞仪检测分别感染阴性对照慢病毒和本发明实施例1得到的含有rnai-11100靶序列的慢病毒的人神经母细胞瘤细胞的细胞凋亡数量。shctrl代表感染阴性对照慢病毒的人神经母细胞瘤细胞组，shenpp6-1和shenpp6-2分别代表感染实施例1得到的含有rnai-11100靶序列的慢病毒的la-n-5和sk-n-sh细胞组。实验参数如下：
[0174][0175]
细胞凋亡情况如图4-7所示。各组分别进行3组平行实验，分别计算凋亡率再取平均值，细胞凋亡率如表2所示：
[0176]
表2
[0177][0178]
从感染慢病毒后人神经母细胞瘤细胞的凋亡情况来看，相比shctrl组，shenpp6-1和shenpp6-2组细胞凋亡数增多，分别增多了2.3倍和1.8倍，证明含有rnai-11100靶序列的慢病毒能够促进人神经母细胞瘤细胞la-n-5和sk-n-sh的凋亡。
[0179]
4.细胞克隆形成检测：采用细胞克隆形成实验检测分别感染阴性对照慢病毒和本发明实施例1得到的含有rnai-11100靶序列的慢病毒的sk-n-sh细胞的克隆数。shctrl代表感染阴性对照慢病毒的sk-n-sh细胞组，shenpp6代表感染实施例1得到的含有rnai-11100靶序列的慢病毒的sk-n-sh细胞组。实验参数如下：
[0180][0181]
各组分别进行3组平行实验，克隆形成的数码照片如图8所示。统计各组的克隆数再取平均值，克隆数如表3所示：
[0182]
表3
[0183]
组别shctrlshenpp6克隆数平均值295159标准偏差117
[0184]
结果显示，相比shctrl组，shenpp6组克隆数减少，减少倍率约为1.9倍，表明含有rnai-11100靶序列的慢病毒能够削弱sk-n-sh细胞的增殖能力。
[0185]
5.hcs细胞划痕检测：根据hcs细胞划痕实验方法、通过cellomics扫描和统计分别感染阴性对照慢病毒和本发明实施例1得到的含有rnai-11100靶序列的慢病毒的人神经母细胞瘤细胞的细胞迁移率。shctrl代表感染阴性对照慢病毒的人神经母细胞瘤细胞组，shenpp6-1和shenpp6-2分别代表感染实施例1得到的含有rnai-11100靶序列的慢病毒的la-n-5和sk-n-sh细胞组。实验参数如下：
[0186][0187]
划痕照片如图9-16所示。各组分别进行3组平行实验，分别计算迁移率再取平均值，迁移率如表4所示：
[0188]
表4
[0189][0190]
从划痕结果来看，相比shctrl组，shenpp6-1组48小时细胞迁移率降低56％(p《0.01)，shenpp6-2组72小时细胞迁移率降低21％(p《0.01)，证明含有rnai-11100靶序列的慢病毒能够明显抑制人神经母细胞瘤细胞la-n-5和sk-n-sh的迁移，即削弱了人神经母细胞瘤细胞的愈合能力。
[0191]
6.细胞transwell实验：使用3422corning转移实验试剂盒、通过transwell实验的一般方法检测分别感染阴性对照慢病毒和本发明实施例1得到的含有rnai-11100靶序列的慢病毒的sk-n-sh细胞的迁移能力。shctrl代表感染阴性对照慢病毒的sk-n-sh细胞组，shenpp6代表感染实施例1得到的含有rnai-11100靶序列的慢病毒的sk-n-sh细胞组。实验参数如下：
[0192][0193]
拍摄转移细胞在200倍视野下的显微照片(图17-18)。各组分别进行3组平行实验，分别对200倍视野下的细胞进行计数再取平均值，各组在transwell小室内孵育72h后的转移细胞数如表5所示：
[0194]
表5
[0195][0196]
从计数结果可以计算得出，相比shctrl组，shenpp6组细胞transwell转移率降低了82％，细胞转移是肿瘤转移的一个重要指标，通过测量细胞的转移能力可以衡量肿瘤转移能力，因此上述数据可以证明，含有rnai-11100靶序列的慢病毒能够大大减少人神经母细胞瘤的转移。
[0197]
综上所述，本发明构建得到的br-v108重组慢病毒载体及其慢病毒能够敲减enpp6基因的转录和表达，在细胞层面上对人神经母细胞瘤细胞的增殖和转移都有良好的抑制作用。

技术特征：
1.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒由br-v108重组慢病毒载体制备得到，所述br-v108重组慢病毒载体由质粒载体br-v108经过age i和ecor i酶切后，连入带age i和ecor i粘性末端的rnai-111特异靶序列重组而得。2.根据权利要求1所述的慢病毒，其特征在于，所述rnai-111特异靶序列如seq id no.1-3任一项所示。3.根据权利要求1或2所述的慢病毒，其特征在于，所述br-v108重组慢病毒载体通过如下步骤构建：a.化学合成寡核苷酸链引物，退火形成双链dna；b.对br-v108载体进行酶切，酶切位点为ecor i/age i；c.将上述双链dna与步骤a酶切后的载体相连，得到连接产物；d.将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，培养后使用pcr对菌落进行鉴定，测序，取测序正确的菌液进行质粒抽提。4.根据权利要求3所述的慢病毒，其特征在于，所述寡核苷酸链引物的序列如seq id no.4和5、或seq id no.6-7、或seq id no.8-9所示，其中，seq id no.4为：f：ccggcaccaacaagtcctttgacatctcgagatgtcaaaggacttgttggtgttttttg，seq id no.5为：r：aattcaaaaaacaccaacaagtcctttgacatctcgagatgtcaaaggacttgttggtg；seq id no.6为：f：ccggcagcgatgctcttgactccttctcgagaaggagtcaagagcatcgctgttttttg，seq id no.7为：r：aattcaaaaaacagcgatgctcttgactccttctcgagaaggagtcaagagcatcgctg；seq id no.8为：f：ccggaaggaaagtttgtctctccttctcgagaaggagagacaaactttcctt ttttttg，seq id no.9为：r：aattcaaaaaaaaggaaagtttgtctctccttctcgagaaggagagacaaactttcctt。5.一种含有权利要求1-4任一项所述的慢病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：a.培养293t细胞；b.将br-v108重组慢病毒载体、pmd2.g载体质粒、pspax2载体质粒和转染试剂混合得到混合液；c.将混合液滴入293t细胞培养液中进行转染；d.取转染后的细胞上清液，离心、过滤得病毒上清液；e.将病毒上清液超速离心，弃去超速离心后的上清液a，加入病毒保存液，充分溶解后再次离心，取上清液b分装。6.根据权利要求5所述的慢病毒的制备方法，其特征在于，所述br-v108重组慢病毒载体、pmd2.g载体质粒、pspax2载体质粒的质量比为2：1.5：1。7.根据权利要求5所述的慢病毒的制备方法，其特征在于，所述培养293t细胞的培养基为10％fbs培养基。
8.权利要求1-4任一项所述的慢病毒在制备治疗与enpp6基因过表达有关的疾病的药物中的应用。9.权利要求1-4任一项所述的慢病毒在制备治疗神经母细胞瘤的药物中的应用。10.权利要求1-4任一项所述的慢病毒在制备抑制癌细胞增殖的药物中的应用。

技术总结
本发明涉及IPC分类号C12N15/86下的病毒载体领域，具体涉及一种用于神经母瘤基因治疗的慢病毒及其制备方法和应用。本发明选择在神经母瘤细胞中活跃表达的ENPP6基因作为作用靶点，设计出针对ENPP6进行RNA干扰的RNAi-11100、RNAi-11101、RNAi-11102靶序列，与慢病毒载体质粒BR-V108相连接构建BR-V108重组慢病毒载体，并包装成含有该重组慢病毒载体的慢病毒，含有BR-V108重组慢病毒载体的慢病毒能够有效敲减ENPP6基因的转录和表达，并显著抑制神经母细胞瘤细胞的增殖和迁移，对神经母细胞瘤的基因治疗有重要的临床意义。胞瘤的基因治疗有重要的临床意义。


技术研发人员：王飞飞
受保护的技术使用者：上海懿贝瑞生物医药科技有限公司
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/8/24