YAP与SOX9蛋白结合抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

yap与sox9蛋白结合抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，涉及yap与sox9蛋白结合抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用、yap与sox9蛋白结合抑制剂以及包含该抑制剂的抗肿瘤药物。


背景技术：

2.肿瘤作为重大疾病，其发病率和死亡率长期居高不下。肿瘤的致病机制十分复杂，是多途径、多因素以及多步骤长期作用的结果。hippo信号通路是新近发现与肿瘤的发生发展密切相关的信号通路之一，多种外源性因素引起hippo信号通路夫活，导致下游效应因子yap活性持续增强，参与肿瘤发生发展。
3.yap蛋白是hippo信号通路中起中心作用的开关蛋白，在细胞正常生长发育过程中yap结合转录因子tead促进下游目的基因表达从而促进细胞生长、抑制细胞凋亡。yap蛋白活性异常与多种肿瘤相关，如，肝癌，胃癌，乳腺癌、肠癌和肺腺癌等实体肿瘤。诸多研究表明，在多种肿瘤细胞中yap蛋白表达水平及细胞核定位上调。
4.yap蛋白在肿瘤进展及耐药研究中发挥重要作用。yap蛋白进入细胞核是其活化的中心环节，然而相关作用机制仍不清楚。我们通过蛋白互作等相关技术明确sox9蛋白是与yap结合并增强其活性的关键伴侣分子，并通过蛋白质分子对接等方法进一步明确影响sox9与yap蛋白结合的关键氨基酸位点，在此基础上，我们筛选出包含关键位点在内的可抑制yap-sox9结合及yap蛋白活化的功能多肽，该多肽在体内外均显著抑制肿瘤生长。
5.目前还未见有关影响yap与sox9蛋白结合的阻断或抑制剂应用于肿瘤的研究报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供yap与sox9蛋白结合阻断或抑制剂的新应用，特别是用于治疗包括消化道肿瘤在内的实体肿瘤，如肝癌，膀胱癌，胃癌，肺癌，乳腺癌，肠癌，卵巢癌，胰腺癌。该阻断或抑制剂为各种形式的多肽、小分子化合物等。
7.发明人经过广泛而深入的研究，首次发现sox9蛋白可以与yap蛋白在细胞浆直接结合，并促进yap的转录活性继而显著促进肿瘤生长；然后通过一系列的蛋白质互作技术明确了影响yap与sox9蛋白的关键氨基酸位点，分别是yap蛋白的第124位精氨酸(arg-124,r124)及sox9蛋白的第125位天冬氨酸(asp-125,d125)。各自突变相关位点均可显著抑制sox9与yap的结合及yap蛋白的转录活性，并阻遏肿瘤细胞生长。在此基础上，我们筛选出包含关键结合位点(sox9-asp-125)的功能多肽，该多肽可显著抑制yap与sox9结合，在体内外均显著抑制肿瘤生长。
8.本发明的第一方面，提供了yap与sox9蛋白结合抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.通过实验确定，yap蛋白肽段(aa 121-135)及sox9-hmg蛋白结构域(aa 103-174)参与yap与sox9的相互作用。模拟研究结果显示：有三组氨基酸氢键形成可能介导yap与
sox9的相互作用，分别是sox9-k106与yap-l134；sox9-v114与yap-q121；sox9-d125与yap-r124/s127(图4)。
10.进一步研究显示，sox9-d125a或yap-r124突变可显著抑制sox9与yap结合(图5、图8)；sox9-d125a或yap-r124突变体显著抑制sox9对yap蛋白转录活性的促进作用(图6、图9)，并显著降低sox9对yap促进肿瘤细胞生长的增强作用(图7、图11)。
11.因此优选的，该抑制剂为抑制yap蛋白的第124位精氨酸(r124)或sox9蛋白的第125位天冬氨酸(d125)活性的试剂，或为诱导r124位点或d125位点突变的试剂。
12.进一步，发明人发现，sox9蛋白s-a1(aa 111-126)肽段包含影响yap与sox9结合的关键氨基酸-asp-125,含有该肽段的α-螺旋结构在人、小鼠及大鼠中高度保守。在该α-螺旋n端添加穿膜肽(hlyvspw)及连接二肽(gg)，分别合成穿膜肽对照(hlyvspwgg，pep-ctrl，序列编号seq id no.1)、野生型多肽(hlyvspwggafmvwaqaarrkladq,pep-s-a1，序列编号seq id no.2)及d125a突变型多肽(hlyvspwggafmvwaqaarrklaaq，pep-d125a，序列编号seq id no.3)。
13.结果显示，野生型多肽pep-s-a1与细胞内sox9蛋白存在竞争性作用，其能够浓度依赖性地抑制sox9蛋白与yap的结合(图12)。具体体现在，抑制yap蛋白的转录活性(图13)；抑制野生型肝癌细胞的生长，但对sox9敲除的肝癌细胞生长无明显影响(图14)；pep-s-a1野生型多肽浓度依赖性抑制huh-7肝癌细胞的皮下成瘤能力(图15)；pep-s-a1野生型多肽显著抑制hcg-7901胃癌细胞的皮下成瘤能力(图16)；野生型多肽组治疗后肝脏荧光素酶生物发光信号显著减弱(图17)，可显著降低肝脏原位种植瘤的瘤重(图18)。而d125a突变型多肽pep-d125a则不与细胞内sox9蛋白存在竞争性作用，不影响sox9蛋白与yap的结合。
14.本发明第二方面，提供了一种yap与sox9蛋白结合抑制剂，该抑制剂为抑制yap蛋白的第124位精氨酸(r124)或sox9蛋白的第125位天冬氨酸(d125)活性的试剂，或为诱导r124位点或d125位点突变的试剂。该抑制剂的形式不限，可为多肽、小分子化合物等。
15.优选的，该抑制剂包含seq id no.2所示的多肽。
16.本发明第三方面，提供了一种抗肿瘤药物，包括活性组分以及药学上可接受的载体，该活性组分包含上述所述的抑制剂。该活性组分可以将抑制剂作为唯一活性组分，也可以是抑制剂和其他抗肿瘤药物的组合。
17.本发明的有益保障及效果如下：
18.本发明利用蛋白质互作、对接、位点突变及多肽筛选等一系列蛋白质功能研究技术，并结合体内外的肿瘤生物学实验，确定sox9蛋白是与yap结合并促进其转录活性的关键伴侣分子，并明确了影响sox9与yap蛋白结合的关键氨基酸位点，进一步筛选出包含关键位点在内的可抑制yap-sox9结合及yap蛋白活化的功能多肽，该多肽可在体内外发挥抑制肿瘤生长的生物学功能。本发明结合临床肿瘤组织的yap蛋白活性检测，可广泛应用于实体肿瘤患者的术前与术后的辅助治疗以及失去手术时机肿瘤患者的个体化治疗。
附图说明
19.图1为sox9蛋白敲除显著阻遏yap活化蛋白的促肝癌细胞增殖作用；
20.图2为sox9蛋白敲除后显著抑制yap蛋白入核及转录活性；
21.图3为sox9与yap蛋白之间的相互结合；
22.图4为分子对接技术筛选影响yap与sox9蛋白结合的潜在氨基酸位点；
23.图5为突变sox9-d125位点抑制其与yap蛋白的结合；
24.图6为突变sox9-d125位点抑制yap的蛋白活性；
25.图7为突变sox9-d125位点抑制yap蛋白促肿瘤细胞生长的作用；
26.图8为突变yap-r124位点抑制其与sox9蛋白的结合；
27.图9为突变yap-r124位点抑制yap蛋白活性；
28.图10为突变yap-r124位点抑制yap蛋白促肿瘤生长的生物学作用；
29.图11为包含sox9-d125位点的野生型及突变多肽的示意图；
30.图12为相较于d125a突变型多肽，野生型多肽可显著抑制yap与sox9结合；
31.图13为相较于d125a突变型多肽，野生型多肽可显著抑制yap活性；
32.图14为相较于d125a突变型多肽，野生型多肽可显著抑制肿瘤细胞的生长，而无明显抑制sox9敲除肿瘤细胞的生长；
33.图15为相较于d125a突变型多肽，野生型多肽可显著抑制肝癌细胞株huh-7的皮下成瘤；
34.图16为相较于d125a突变型多肽，野生型多肽可显著抑制胃癌细胞株hcg-7901的皮下成瘤；
35.图17为相较于d125a突变型多肽，野生型多肽可显著抑制肝癌细胞株huh-7的肝脏种植瘤；
36.图18为相较于d125a突变型多肽，野生型多肽可显著降低肝脏原位种植瘤的瘤重。
具体实施方式
37.下面结合本发明的实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
38.实施例1
39.分别将cmv-gfp，cmv-yap-s127a(yap活化突变体)慢病毒感染野生型及sox9敲除的huh-7细胞(moi:100)，并将其按照2
×
103的密度接种于96孔板，每隔24小时加入1:10稀释的cck-8试剂，静置1h后，tecan infinite f200酶标仪od 450读值，根据相关数据绘制肿瘤细胞7天的生长曲线。结果显示：sox9敲除后yap-s127a的促肝癌细胞增殖的作用被显著抑制(图1)。
40.实施例2
41.分别用1μm lpa(lysophosphatidic acid)处理野生型及sox9敲除的293a细胞，并于刺激后0、2及4小时收集细胞，使用核浆分离试剂盒(invent,sc-003)，分别提取浆蛋白及核蛋白，定量后行蛋白印迹实验，检测yap蛋白在核浆分布的差异。另应用dual-luciferase reporter试剂盒收集同批样品，tecan infinite f200酶标仪od 562读值，分别读取萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶相关数值，并将萤火虫荧光素酶数值除以海肾荧光素酶数值，各组商值行对比分析。结果显示：sox9蛋白敲除后lpa诱发的yap蛋白入核显著减少，并显著抑制lpa对yap蛋白转录活性的促进作用(图2)。
42.实施例3
43.将2
×
106的huh-7肝癌细胞接种于90mm大皿中，8小时后顺转带v5标签的yap过表达质粒及带flag标签的sox9过表达质粒，48小时后裂解细胞收取蛋白，分别加入anti-v5或anti-flag的igg免疫磁珠，4度摇匀过夜，以ip缓冲液反复清洗磁珠，高温变性后行免疫印迹实验。结果显示：sox9蛋白可以与yap蛋白互相结合(图3)。
44.实验例4
45.根据前期实验结果，确定分别是yap蛋白肽段(aa 121-135)及sox9-hmg蛋白结构域(aa 103-174)参与yap与sox9的相互作用。利用已知的sox9-hmg结构域的晶体结构(pdb code 4euw)及模拟的yap肽段三维结构(af-p46937-f1)行蛋白-蛋白分子对接实验。结果显示：有三组氨基酸氢键形成可能介导yap与sox9的相互作用，分别是sox9-k106与yap-l134；sox9-v114与yap-q121；sox9-d125与yap-r124/s127(图4)。
46.实验例5
[0047]2×
106的huh-7肝癌细胞接种于90mm大皿中，8小时后顺转带flag标签的sox9野生型、sox9-k106a、sox9-v114a及sox9-d125a过表达质粒，48小时后裂解细胞收取蛋白，四组均加入anti-flag的igg免疫磁珠，4℃摇匀过夜，以ip缓冲液反复清洗磁珠，高温变性后行免疫印迹实验。结果显示：sox9-d125a突变可显著抑制sox9与yap结合(图5)。
[0048]
实验例6
[0049]
分别将感染mcherry+egfp，mcherry+egfp-yap，mcherry-sox9+egfp-yap以及mcherry-d125a+egfp-yap慢病毒(moi:100，两种慢病毒比例1:1)的huh-7细胞按照3
×
103的密度接种于96孔板，24小时后顺转入8
×
gtⅱc(yap-tead报告基因)及prl-sv40质粒(比例10:1)，并予以稻瘟霉素(dox，1um)处理12或24小时，应用dual-luciferase reporter试剂盒收集样品，tecan infinite f200酶标仪od 562读值，分别读取萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶相关数值，并将萤火虫荧光素酶数值除以海肾荧光素酶数值，各组商值行对比分析，结果显示：sox9可显著促进yap蛋白的转录活性，sox9-d125a突变体显著抑制sox9对yap蛋白转录活性的促进作用(图6)。
[0050]
实施例7
[0051]
分别将感染mcherry+egfp，mcherry+egfp-yap，mcherry-sox9+egfp-yap以及mcherry-d125a+egfp-yap慢病毒(moi:100，两种慢病毒比例1:1)的huh-7细胞按照3
×
103的密度接种于96孔板，8小时后予以稻瘟霉素(dox，1um)处理各组细胞，每隔24小时加入1:10稀释的cck-8试剂，静置1h后，tecan infinite f200酶标仪od 450读值，根据相关数据绘制肿瘤细胞7天的生长曲线。结果显示：sox9-d125a突变体显著降低sox9对yap促进肿瘤细胞生长的增强作用(图7)。
[0052]
实施例8
[0053]2×
106的huh-7肝癌细胞接种于90mm大皿中，8小时后顺转带v5标签的yap野生型、yap-r124k及yap-s127a过表达质粒，48小时后裂解细胞收取蛋白，三组均加入anti-v5的igg免疫磁珠，4度摇匀过夜，以ip缓冲液反复清洗磁珠，高温变性后行免疫印迹实验。结果显示：yap-r124k突变可显著抑制sox9与yap结合，yap-s127a突变对二者结合无明显影响(图8)。
[0054]
实施例9
[0055]
分别将感染cmv-gfp，cmv-yap及cmv-r124k慢病毒(moi:100)的huh-7细胞按照3
×
103的密度接种于96孔板，24小时后顺转入8
×
gtⅱc(yap-tead报告基因)及prl-sv40质粒(比例10：1)，应用dual-luciferase reporter试剂盒收集样品，tecan infinite f200酶标仪od562读值，分别读取萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶相关数值，并将萤火虫荧光素酶数值除以海肾荧光素酶数值，各组商值行对比分析，结果显示：yap-r124k可显著抑制yap蛋白的转录活性(图9)。
[0056]
实施例10
[0057]
分别将感染cmv-gfp，cmv-yap及cmv-r124k慢病毒(moi:100)的huh-7细胞按照1
×
106的密度种植于balb/c裸鼠右侧腋窝皮下组织内(每组n＝6)，2周后处死各组裸鼠，留取瘤组织并称重，结果显示：yap-r124k可显著抑制yap对肝癌细胞皮下肿瘤瘤的促进作用(图10)。
[0058]
实施例11
[0059]
利用i-tasser server筛选sox9-hmg蛋白结构域上存在的α-螺旋结构，其中s-a1(aa 111-126)包含影响yap与sox9结合的关键氨基酸-asp-125,该α-螺旋在人、小鼠及大鼠中高度保守。在该α-螺旋n端添加穿膜肽(hlyvspw)及连接二肽(gg)，分别合成穿膜肽对照(hlyvspwgg，pep-ctrl)、野生型多肽(hlyvspwggafmvwaqaarrkladq,pep-s-a1)及d125a突变型多肽(hlyvspwggafmvwaqaarrklaaq,pep-d125a)(图11)。
[0060]
实施例12
[0061]2×
106的huh-7肝癌细胞接种于90mm大皿中，24小时后顺转带v5标签的yap野生型质粒，8小时后加入穿膜肽对照(pep-ctrl，10um)、野生型多肽(pep-s-a1,1um)、野生型多肽(pep-s-a1,10um)及d125a突变型多肽(pep-d125a，10um)，24小时后裂解细胞收取蛋白，四组均加入anti-v5的igg免疫磁珠，4℃摇匀过夜，以ip缓冲液反复清洗磁珠，高温变性后行免疫印迹实验。结果显示：pep-s-a1野生型多肽浓度依赖性抑制yap与sox9的结合，而d125a突变型多肽无明显影响(图12)。
[0062]
实施例13
[0063]
分别将感染cmv-gfp及cmv-yap-s127a慢病毒(moi:100)的huh-7细胞按照3
×
103的密度接种于96孔板，24小时后顺转入8
×
gtⅱc(yap-tead报告基因)及prl-sv40质粒(比例10：1)，8小时后分别加入穿膜肽对照(pep-ctrl,10um)、野生型多肽(pep-s-a1,10um)及d125a突变型多肽(pep-d125a，10um)，24小时后应用dual-luciferase reporter试剂盒收集样品，tecan infinite f200酶标仪od562读值，分别读取萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶相关数值，并将萤火虫荧光素酶数值除以海肾荧光素酶数值，各组商值行对比分析，结果显示：pep-s-a1野生型多肽抑制yap蛋白的转录活性，而d125a突变型多肽无明显影响(图13)。
[0064]
实施例14
[0065]
分别将感染野生型及sox9敲除的huh-7细胞按照3
×
103的密度接种于96孔板，8小时后分别加入穿膜肽对照(pep-ctrl,10um)、野生型多肽(pep-s-a1,10um)及d125a突变型多肽(pep-d125a，10um)，于24及48小时后应用dual-luciferase reporter试剂盒收集样品，tecan infinite f200酶标仪od562读值，分别读取萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶相关数值，并将萤火虫荧光素酶数值除以海肾荧光素酶数值，各组商值行对比分析，结果显示：相较于d125a突变型多肽，pep-s-a1野生型多肽显著抑制野生型肝癌细胞的生长，但对
sox9敲除的肝癌细胞生长无明显影响(图14)。
[0066]
实施例15
[0067]
将1
×
106的huh-7肝癌细胞种植于balb/c裸鼠右侧腋窝皮下组织内，2周后形成绿豆样大小瘤样组织，随机分为5组(n＝7)，分别于瘤内注射生理盐水(多肽溶剂)、穿膜肽对照(pep-ctrl,8mg/kg)、野生型多肽(pep-s-a1,2mg/kg)、野生型多肽(pep-s-a1,8mg/kg)及d125a突变型多肽(pep-d125a，8mg/kg)，共给药两次，分别是第一天与第四天，第七天处死裸鼠，留取瘤组织并称重。结果显示：pep-s-a1野生型多肽浓度依赖性抑制huh-7肝癌细胞的皮下成瘤能力，而d125a突变型多肽无明显影响(图15)。
[0068]
实施例16
[0069]
将2
×
106的hcg-7901胃癌细胞种植于balb/c裸鼠右侧腋窝皮下组织内，1周后形成绿豆样大小瘤样组织，随机分为2组(n＝7)，分别于瘤内注射野生型多肽(pep-s-a1,8mg/kg)及d125a突变型多肽(pep-d125a，8mg/kg)，共给药三次，分别是第一天、第四天及第七天，第十天处死裸鼠，留取瘤组织并称重。结果显示：pep-s-a1野生型多肽显著抑制hcg-7901胃癌细胞的皮下成瘤能力，而d125a突变型多肽无明显影响(图16)。
[0070]
实施例17
[0071]
将1
×
106感染含荧光素酶基因的慢病毒(cmv-luciferase)的huh-7肝癌细胞种植于balb/c裸鼠右侧腋窝皮下组织内，2周后留取瘤样组织，在hanks液中，去除坏死组织后切成1～2mm3小块，六周龄balb/c裸鼠用戊巴比妥钠腹腔麻醉后，行左上腹横切口，暴露肝脏，取上述小块瘤组织，在离体40min内用粗针头植入裸鼠肝右叶深部实质内，全层关腹。术后第4天于活体成像仪下检测肝脏荧光素酶的生物发光信号(pre-treatment)，并随机分为2组(n＝8)，术后第5、10及15天分别于尾静脉注射野生型多肽(pep-s-a1,8mg/kg)及d125a突变型多肽(pep-d125a，8mg/kg)，术后第19天于活体成像仪下再次检测肝脏荧光素酶的生物发光信号(after treatment)，术后第20天处死裸鼠并留取肝脏原位种植瘤组织并称重。统计相关实验数据并分析。结果显示：治疗前二组荧光素酶发光(total flux)无明显差异；相较于d125a突变型多肽组，野生型多肽组治疗后肝脏荧光素酶生物发光信号显著减弱(图17)。相较于d125a突变型多肽，野生型多肽可显著降低肝脏原位种植瘤的瘤重(图18)。
[0072]
由以上试验结果可知，通过蛋白质互作、对接、位点突变及多肽筛选等一系列蛋白质功能研究技术，并结合体内外的肿瘤生物学实验，确定sox9蛋白是与yap结合并促进其转录活性的关键伴侣分子，并明确了影响sox9与yap蛋白结合的关键氨基酸位点，进一步筛选出包含关键位点在内的可抑制yap-sox9结合及yap蛋白活性的功能多肽，该多肽在体内外发挥抑制肿瘤生长的生物学功能。该发明结合临床肿瘤组织的yap蛋白活性检测(yap-r124me2a的发明专利)，可广泛应用于实体肿瘤患者的术前与术后的辅助治疗以及失去手术时机肿瘤患者的个体化治疗。
[0073]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。

技术特征：
1.yap与sox9蛋白结合抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：其中，所述抑制剂为抑制yap蛋白的第124位精氨酸(r124)或sox9蛋白的第125位天冬氨酸(d125)活性的试剂，或为诱导r124位点或d125位点突变的试剂。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：其中，所述抑制剂为抑制如下任一组氨基酸氢键形成或活性的试剂，分别是sox9-k106与yap-l134、sox9-v114与yap-q121、sox9-d125与yap-r124或s127。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：其中，所述抑制剂包含seq id no.2所示的多肽。5.一种yap与sox9蛋白结合抑制剂，其特征在于，该抑制剂为抑制yap蛋白的第124位精氨酸(r124)或sox9蛋白的第125位天冬氨酸(d125)活性的试剂，或为诱导r124位点或d125位点突变的试剂。6.根据权利要求5所述的yap与sox9蛋白结合抑制剂，其特征在于：其中，所述抑制剂包含seq id no.2所示的多肽。7.一种抗肿瘤药物，其特征在于，包括活性组分以及药学上可接受的载体，所述活性组分包含权利要求5或6所述的抑制剂。8.根据权利要求7所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述活性组分以抑制剂为唯一活性组分。9.根据权利要求7所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述活性组分为抑制剂和其他抗肿瘤药物的组合。

技术总结
本发明涉及医学生物检测技术领域，YAP与SOX9蛋白结合抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。所述抑制剂优选为抑制YAP蛋白的第124位精氨酸(R124)或SOX9蛋白的第125位天冬氨酸(D125)活性的试剂，或为诱导R124位点或D125位点突变的试剂，更优选HLYVSPWGGAFMVWAQAARRKLADQ多肽。相应的，本发明进一步提供了YAP与SOX9蛋白结合抑制剂和抗肿瘤药物。本发明结合临床肿瘤组织的YAP蛋白活性检测，可广泛应用于实体肿瘤患者的术前与术后的辅助治疗以及失去手术时机肿瘤患者的个体化治疗。个体化治疗。个体化治疗。


技术研发人员：谢渭芬 钱慧 张新 丁晨虹 刘方 肖梦超
受保护的技术使用者：上海长征医院
技术研发日：2023.01.18
技术公布日：2023/8/24