具有扩散结构的包含3D细胞培养基材的培养容器的制作方法

具有扩散结构的包含3d细胞培养基材的培养容器
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35u.s.c.
§
119要求2020年9月30日提交的系列号为63/085,701的美国临时申请的优先权权益，本文以该申请的内容为基础并将其通过引用全文纳入本文。
技术领域
3.本说明书一般涉及细胞培养装置，更具体地，涉及具有用于球体的细胞培养的扩散结构的装置。


背景技术：

4.以三维形式培养的细胞(例如球体)可以比作为单层以二维形式培养的对应物表现出更加类似体内的功能性。在2d(二维)细胞培养系统中，细胞可附着于在其上培养它们的基材。然而，当细胞以3d形式(例如在球体内)生长时，细胞往往彼此相互作用而不是附着于基材。因此，就细胞通讯和细胞外基质的发展而言，以3d培养的细胞与体内组织更相似。
5.3d细胞聚集体或球体可由正常细胞、癌细胞和细胞系产生。然而，由于在现有可获得的培养装置中缺乏功能性血管结构，因此球体生长受到限制，这不利地影响着球体中的内部细胞。相比于球体上的外部细胞，内部细胞团块具有不均匀的营养和氧气供应。类似地，由于球体外部的扩散阻力增加，球体中的内部细胞积聚了细胞代谢的废物。这些问题导致形成坏死核，当球体尺寸达到约500μm的直径时，在肿瘤球体培养中已经报道了这些问题。因此，需要消除这些限制的培养装置。


技术实现要素：

6.如本公开阐述的本公开实施方式提供了允许球体生长的细胞培养装置。为了减少或消除球体生长的限制，以及为了建立更像组织的3d培养，本文所述的装置将扩散结构引入到培养装置的孔内的3d细胞培养物中。扩散结构包括支架。在实施方式中，支架包括纤维。纤维的非限制性实例包括塑料或聚合物纤维及水凝胶纤维。纤维可以多孔、可透气或者它们的组合，以允许通过被动扩散作用模式进行进出3d培养物的内部团块的营养物供应和废物交换。
7.在一些实施方式中，本公开的培养基材被构造成使得它们提供改进和/或可定制的性质，包括：相比于不具有本文所述的此类支架的培养容器，在孔的整个截面空间有改进的细胞分布，改进的细胞活力，通过重力作用将废物从细胞向孔底部移除得到改进，坏死核减少或者其他属性。
8.在一方面中，一种细胞培养装置，其包括多孔细胞培养板和多个支架，所述多孔细胞培养板包括多个孔，每个孔包括顶部、底部和侧壁，所述侧壁被设置在顶部与底部之间并具有包含超低附着表面的内表面；所述多个支架被设置在多孔细胞培养板的孔中，每个支架包括细胞粘附性表面。
9.在一些实施方式中，底部包括半球形状。
10.在一些实施方式中，在每个孔中设置有支架。在一些实施方式中，支架的至少一端锚固到各个孔的底部部分。
11.在一些实施方式中，底部包括多个微腔。在一些实施方式中，在所述多个微腔的每个微腔中设置有支架。在一些实施方式中，支架锚固到各个微腔的底部部分。
12.在一些实施方式中，支架具有约100μm至约3000μm的长度。在一些实施方式中，支架具有约100μm至约1000μm的长度。在一些实施方式中，支架具有约100μm至约500μm的长度。在一些实施方式中，支架具有至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm的长度。在一些实施方式中，支架的长度不超过3000μm、不超过2000μm、不超过1000μm、不超过500μm。
13.在一些实施方式中，支架具有约10μm至约100μm的宽度。在一些实施方式中，支架具有约10μm至约50μm的宽度。在一些实施方式中，支架具有约10μm至约20μm的宽度。在实施方式中，支架具有至少10μm、至少15μm、至少20μm的宽度。在实施方式中，支架的宽度不超过100μm、不超过50μm、不超过20μm。
14.在一些实施方式中，支架包含纤维支架。在一些实施方式中，纤维支架由聚乙烯基醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚苯乙烯、聚丙烯或聚半乳糖醛酸(pga或果胶)形成。在使用pga的实施方式中，可以从支架释放或收获附着的3d细胞培养物。例如，可以用酶和/或螯合剂，例如果胶酶来消化支架。在一些实施方式中，可以使用允许温和地消化支架以释放3d细胞培养物的其他水凝胶。
15.在一些实施方式中，纤维支架包括多根塑料纤维或聚合物纤维。在一些实施方式中，所述多根塑料纤维中的每根纤维锚固到各个孔的底部部分。在一些实施方式中，每个孔中的各个纤维彼此分开约100μm至约200μm的距离。
16.在一些实施方式中，支架包含人工血管支架。
17.在一些实施方式中，人工血管支架包含中空纤维。在一些实施方式中，人工血管支架包含多根中空纤维。在一些实施方式中，各个中空纤维彼此相距约100μm至约200μm锚固。在一些实施方式中，中空纤维由非离子型聚合物形成。在一些实施方式中，非离子型聚合物包括聚乙烯基醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚苯乙烯或聚丙烯。
18.在一些实施方式中，中空纤维还包括水凝胶涂层。在一些实施方式中，人工血管支架包含水凝胶。在一些实施方式中，水凝胶包含细胞外基质(ecm)蛋白、脱细胞组织ecm支架、交联聚合物或其组合。粘附性水凝胶的非限制性实例包括ecm蛋白和脱细胞组织ecm支架，ecm的实例包括多糖糖胺聚糖(gag)和蛋白质，例如胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白。非粘附性水凝胶的非限制性实例包括交联聚合物，例如聚环氧乙烷、聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮和聚丙烯酰胺等。
19.在一方面中，提供了一种培养三维(3d)细胞培养物的方法。所述方法包括：在如本文所述的一个或多个实施方式的细胞培养装置中接种细胞，其中，所述细胞附着于设置在细胞培养装置中的支架的细胞粘附性表面；以及通过向细胞培养装置添加细胞培养基以提供营养物和氧气，将细胞培养成3d细胞培养物，其中，所述细胞在添加或更换细胞培养基期间保持附着于支架。在一些实施方式中，所述方法还包括：对附着于细胞培养装置的支架的3d细胞培养物进行成像。
20.在一方面中，一种互连式细胞培养装置，其包括多孔细胞培养板和多个水凝胶支架，所述多孔细胞培养板包括多个孔，每个孔包括顶部、底部和侧壁，所述侧壁被设置在顶部与底部之间，并具有包含超低附着表面的内表面；所述多个水凝胶支架被设置在多孔细胞培养板中，所述多个水凝胶支架包括不同长度的水凝胶纤维，其中，水凝胶纤维的相对端部被设置在多孔细胞培养板中的不同孔中，以建立互连的孔。
21.在一些实施方式中，底部包括半球形状。
22.在一些实施方式中，水凝胶纤维具有约100μm至约100mm的长度。在一些实施方式中，水凝胶纤维具有约10μm的宽度。
23.在一些实施方式中，每根水凝胶纤维包括细胞粘附性表面。在一些实施方式中，水凝胶纤维由非附着性水凝胶形成并且包括被附着基团官能化的表面。附着基团的非限制性实例包括ecm蛋白和附着肽序列，例如，精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(rgd)。在一些实施方式中，水凝胶纤维由ecm蛋白、脱细胞组织ecm支架、ecm肽序列和交联聚合物形成。粘附性水凝胶的非限制性实例包括ecm蛋白和脱细胞组织ecm支架。ecm的实例包括多糖糖胺聚糖(gag)和蛋白质，例如胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白。非粘附性水凝胶的非限制性实例包括交联聚合物，例如聚环氧乙烷、聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺和聚半乳糖醛酸(pga)等。
24.在一些实施方式中，水凝胶支架在孔内未锚固或是自由漂浮的。
25.在一些实施方式中，底部包括多个微腔。在一些实施方式中，水凝胶纤维的相对端部被设置在不同的微腔中，以建立互连的微腔。
26.在一方面中，提供了一种形成互连式细胞培养装置的方法。所述方法包括：用细胞接种细胞培养装置，所述细胞培养装置包括多孔细胞培养板，所述多孔细胞培养板包括多个孔，每个孔包括顶部、底部和侧壁，所述侧壁被设置在顶部与底部之间并具有包含超低附着表面的内表面；用多个水凝胶支架接种该细胞培养装置，所述水凝胶支架包括多根水凝胶纤维，其中，水凝胶纤维的相对端部被设置在多孔细胞培养板中的不同孔中，以建立互连的孔；以及提供细胞培养基以提供营养物和氧气供三维(3d)细胞培养物的细胞生长和形成。
27.在一些实施方式中，底部包括半球形状。在一些实施方式中，底部包括多个微腔。
28.在以下的具体实施方式中提出了本文所述的实施方式的其他特征和优点，其中的部分特征和优点对本领域的技术人员而言，根据所作描述就容易看出，或者通过实施包括以下具体实施方式、权利要求书以及附图在内的本文所述的实施方式而被认识。
29.应理解，前述的一般性描述和下文的具体实施方式都描述了各个实施方式且都旨在提供用于理解所要求保护的主题的性质和特性的总体评述或框架。包括的附图提供了对各个实施方式的进一步理解，附图并入本说明书中并构成本说明书的一部分。附图例示了本文所描述的各个实施方式，并且与说明书一起用于解释所要求保护的主题的原理和操作。
附图说明
30.图1示出了证明球体核中细胞死亡的荧光图像。
31.图2根据本文所示或所述的一个或多个实施方式，示出了在根据一个或多个实施
方式所述的包含纤维的支架存在时所培养的细胞的图像。
32.图3根据本文所示或所述的一个或多个实施方式，示出了在根据一个或多个实施方式所述的包含纤维的支架存在时所培养的细胞的图像。
33.图4a、4b和4c根据本公开的一个或多个实施方式，示出了多孔微孔板的一个实施方式。各自根据本公开的一个或多个实施方式，图4a示出了多孔微孔板，图4b示出了多孔微孔板的单个孔，图4c示出了图4b的框c中所示的区域的分解图。
34.图5a和5b根据本公开的一个或多个实施方式，示出了微腔阵列的实施方式。
35.图6a和6b根据本公开的一个或多个实施方式，示出了3d细胞培养微孔板的一个实施方式。
36.图7根据本文所示或所述的一个或多个实施方式，示出了具有栓系纤维的孔的截面侧视图。
37.图8根据本文所示或所述的一个或多个实施方式，示出了具有人工血管支架的孔的截面侧视图。
38.图9根据本文所示或所述的一个或多个实施方式，示出了图8的孔的俯视图，其中具有血管支架的插图。
39.图10根据本文所示或所述的一个或多个实施方式，示出了水凝胶支架的侧视透视图。
40.图11根据本文所示或所述的一个或多个实施方式，示出了具有水凝胶支架的互连孔的俯视图。
具体实施方式
41.用于球体细胞培养的常规装置和容器承受着与球体的生长受限相关的弊端。常规装置缺乏功能性血管结构，这不利地影响了球体中的内部细胞并且限制了球体生长。相比于球体上的外部细胞，内部细胞团块具有不均匀的营养物和氧气供应。由于球体外的扩散阻力增加，球体中的内部细胞积聚了细胞代谢的废物。这些问题导致形成坏死的核，当球体尺寸达到约500μm的直径时，在肿瘤球体培养中已经报道了这些问题。
42.球体活力使用肝癌细胞系来评估。hepg2细胞以120k个细胞/ml接种在专为6孔微孔板设计的微腔插入原型(每个微腔有733个微孔)中进行大量球体培养。图1示出了第9天的hepg2球体的亮视场图像。示出了用钙黄绿素am染色的第9天的hepg2球体的荧光图像，其中绿色表示钙黄绿素am和活细胞——该绿色显示为黑色图像背景下的浅灰色。示出了用ethd-1染色的第9天的hepg2球体的荧光图像，其中红色表示ethd和死亡细胞——该红色显示为黑色图像背景下的中度灰。第9天的hepg2球体还显示了死亡细胞(用红色ethd染色/中度灰表示)和活细胞(用绿色钙黄绿素am染色/浅灰色表示)的合并荧光图像，显示出显著的细胞死亡，其中，黑色图像背景下，浅灰色外环内有中度灰的环。因此，图1中所示的第9天的hepg2球体的球体活力评估证明了球体核中的细胞死亡。
43.用于使细胞以3d球体生长的可商购常规基材一般具有微结构化的坑状几何，并且具有对细胞无粘附性的表面涂层。细胞沉到这些坑的底部并且彼此附着，然后以细胞聚集体(即，球体)生长。然而，如果微坑太浅，则球体容易从坑中移出并在培养基更换期间丢失。相反，如果微坑太深，则在将细胞培养基初始添加到包含微坑的容器期间，可能难以避免空
气滞留在微坑体积中。
44.本公开描述的细胞培养装置在细胞培养期间将塑料纤维、水凝胶支柱或其组合引入到3d细胞培养物中。纤维或支柱可以是多孔或透气的，以允许将营养物供应到球体核，以及允许进出3d细胞培养物的内部团块进行废物交换。由于塑料纤维或水凝胶支柱的特征，废物交换通过被动扩散作用模式发生。
45.由于将3d细胞团块固定在孔或微腔中的特征，因此，根据本文所述实施方式的装置防止了在细胞培养操作期间球体丢失。在实施方式中，使用人工血管支架，其允许营养物、代谢废物和氧气在3d细胞培养物中均匀分布，因此，本文所述的装置支持组织状3d培养。另外，本文所述的装置实施方式有助于避免在3d细胞培养物中形成坏死的核，以及增加以3d形式产生的人工组织的尺寸。
46.图2和图3示出了在根据本公开的一个实施方式所述的培养装置的孔中培养的细胞的图像。两种不同的原代人肝细胞(phh)供体批号(lot)被用于建立肝球体培养。图像示出了在康宁(corning)96孔球体板[纽约州康宁市康宁股份有限公司(corning incorporated)]的孔中的肝细胞，该孔涂覆有超低附着(ula)表面涂层。图2的图像关于phh供体批号336，在第28天时拍摄；图3的图像关于phh供体批号404，在第13天时拍摄。如图2所示，培养装置包括在孔内呈基本直线形状的塑料纤维，并且细胞以3d构造附着于塑料纤维，该3d构造沿着塑料纤维的长度伸长。如图3所示，培养装置包括在孔内呈弯曲形状的塑料纤维，并且细胞以3d构造附着于塑料纤维，该3d构造从纤维的第一端跨到相对端。图2和图3中的塑料纤维被设置在孔中并且在培养基中漂浮。然而，在一些实施方式中，塑料纤维可锚固在孔中。
[0047]
在本文所述的方面中，在细胞培养装置中可以设置多个支架。所述细胞培养装置可以包括多个孔，每个孔包括顶部孔口、底部和设置在顶部与底部之间的侧壁，其中，每个孔被构造成具有包含细胞非粘附性表面的内表面。在一个实施方式中，培养装置的多个孔中的每个孔可以包括多个支架。在一个实施方式中，培养装置的多个孔中的每个孔可以包括至少一个支架。在一个实施方式中，培养装置的多个孔中的至少一些孔包括支架。
[0048]
在一个实施方式中，本文所述的支架，例如塑料纤维或人工血管支架可以锚固在孔或微腔内。所述支架可以通过将支架稳固地定位在孔或微腔内的任何合适的方式得到锚固。在非限制性实例中，支架可以通过粘合剂或模制或重叠模制到孔或微腔中来稳固。
[0049]
在一些实施方式中，支架被锚固在多孔板的各个孔或微腔内的基本相同的位置，这有利于3d细胞培养物的有效成像。例如，支架可以被锚固到各个孔或微腔的中心底部部分。在一个实施方式中，纤维支架的多根纤维中的每根纤维锚固到各个孔的底部，或底部的一部分。可以将每根纤维的一端锚固到底部。各个纤维的锚固端可以与相邻的锚固纤维间相距一定距离。例如，在各个孔中，各个纤维的锚固端可以彼此间隔约100μm至约200μm的距离。在一些实施方式中，塑料纤维的至少一端可以被锚固在孔或微腔中，并且该塑料纤维在该孔或微腔中可以具有垂直或基本垂直的取向。在一些实施方式中，塑料纤维的相对各端可以被锚固在孔或微腔中，并且该塑料纤维在该孔或微腔中可以具有水平或基本水平的取向。
[0050]
在一个方面中，提供了一种细胞培养装置，其包括在多孔板的孔中的3d细胞培养扩散结构。在实施方式中，所述扩散结构包括支架。支架可以包括纤维，例如，栓系塑料纤维
的非限制性实例。在实施方式中，在孔板的每个孔中可以设置有支架。在实施方式中，在孔板的选定孔中可以设置有支架。所述孔板可以包括多个孔，例如，在多孔板中的多个孔。在实施方式中，每个孔的内表面是细胞非粘附性表面，例如，用超低附着(ula)涂层处理或涂覆的表面的非限制性实例。支架包括细胞粘附性表面并且为3d细胞培养物提供了锚固点，其允许在细胞培养过程期间进行更加完全的培养基更换。通过锚固3d细胞培养物，在细胞培养操作或测定过程期间，例如在培养基更换或化合物配量给予期间，防止了3d细胞培养物的移位或丢失。
[0051]
现参考图4a、图4b和图4c，其示出了作为微腔板的细胞培养装置的一个实施方式。96孔微腔板在每个孔的底表面上具有微腔阵列，并且每个微腔经结构化以限制所培养的细胞以3d构造生长，从而在96孔的每一孔中提供多个3d细胞培养物。图4a例示了具有孔阵列110的多孔板10。图4b例示了图4a的多孔板10的单个孔101。该单个孔101具有顶部孔口118，液体不可渗透的底表面106和侧壁113。图4c是图4b中的框c中所示的孔101的底表面106的区域的分解图，其例示了图4b所示的单个孔的底表面中的微腔阵列112。微腔阵列112中的每个微腔115具有侧壁121和液体不可渗透的底表面116。图4a、图4b和图4c所示的微腔球体板在每个单独的孔101的底部中提供微腔阵列112，该微腔球体板可用于在多孔板的每个单独孔的每个微腔中生长单独的3d细胞培养物。通过使用这种类型的容器，使用者可在多孔板的每个孔中生长大量3d细胞培养物，由此提供维持长久活力和功能性的大量3d细胞培养物，并且该大量3d细胞培养物可在相同的培养和实验条件下处理以用于如本文所提供的测定。另外，这种类型的容器在各个3d细胞培养物之间提供了物理屏障以在培养或测试期间防止任何3d细胞培养物融合。
[0052]
现在参考图5a，其示出了微腔阵列112的一种示例性图示。图5a例示了微腔115，每个微腔115具有顶部孔口118，底表面119，深度d，和由侧壁121限定的宽度w。如图5a和图5b所示，微腔阵列具有液体不可渗透的凹弧形底表面116。在实施方式中，微腔的底表面可以是圆形或圆锥形，有角度的，平底的，或适于形成3d细胞培养物的任何形状。在一些实施方式中，优选圆化底部。当垂直侧壁过渡到圆底119时，圆底119可以具有过渡区114。其可以是平顺或有角度的过渡区。在实施方式中，“微腔”可以是例如微孔115，其限定了上孔口118和最低点116，上孔口的中心以及上孔口的中心和最低点之间的中心轴线105。在实施方式中，孔围绕轴线旋转对称(即，侧壁是圆柱形的)。在一些实施方式中，上孔口限定了跨越上孔口的距离(宽度w)，其在250μm至1mm之间，或者这些测量值内的任何范围。在一些实施方式中，从上孔口到最低点的距离(深度“d”)在200μm至900μm之间，或在400μm至600μm之间。微腔阵列可具有不同的几何结构，例如，抛物线形，双曲线形，v形和横截面几何结构，或其组合。在实施方式中，微腔在其下方可以具有保护层130，以保护它们免于与诸如实验室工作台或桌子之类的表面直接接触。在一些实施方式中，可以在孔119的底部与保护层之间提供空气空间110。在实施方式中，空气空间110可以与外部环境连通，或者可以是封闭的。在一些单独的微腔115的底部示出了3d细胞培养物25。
[0053]
现在参考图5b，其示出了微腔阵列112的另一种示例性图示。图5b例示了微腔阵列112可以具有正弦或抛物线形状。该形状产生圆化的顶边缘或微腔边缘，在实施方式中，这减少了空气被滞留在微腔顶部处的尖锐角落或90度角处。如图5b所示，在一些方面中，微腔115具有顶部开口，其具有顶直径d
顶
；从微腔的底部116到微腔的顶部的高度h；在微腔的顶
部与微腔的底部116之间的高度一半处的微腔直径dh；以及侧壁113。在这样的实施方式中，孔的底部是圆化的(例如，半球圆形)，侧壁的直径从孔的底部到顶部增大，并且孔之间的边界是圆化的。由此，孔的顶部不以直角终止。在一些实施方式中，孔具有在底部与顶部之间的中间点处的直径d(也被称为dh)，在孔的顶部处的直径d
顶
以及从孔的底部到顶部的高度h。在这些实施方式中，d
顶
大于d。
[0054]
现在参考图6a和图6b，其示出了细胞培养装置的一个实施方式，所述细胞培养装置包括孔，所述孔经结构化以约束细胞以3d构造生长，例如，3d细胞培养板。图6a示出了3d细胞培养板11的一个实施方式，在该情况中，3d细胞培养板11是96孔板，其中，圆化底部119被构造成在96个孔的每个孔中容纳单个3d细胞培养物。虽然这些板通常在孔101的顶部孔口118朝上的情况下使用，但是在图6a中，板被倒置示出以显示孔101的底部的结构。图6b是3d细胞培养微孔板的一个实施方式的例示，其具有框架130；多个孔101，每个孔101具有顶部孔口118，侧壁121，以及液体不可渗透的凹弧形底表面119。在每个单独的孔101的底部示出了3d细胞培养物25。在实施方式中，框架130可以将孔的底部保持在某表面(例如，实验室工作台或桌子)的上方。在一些实施方式中，可以在孔119的底部与板下方的所述表面之间提供空气空间。在实施方式中，空气空间可以与外部环境连通，或者可以是封闭的。
[0055]
在实施方式中，孔的所述至少一个凹弧形底表面可以具有例如在同一孔内的多个相邻的凹弧形底表面。或者，如图4a-4c所示，多孔板可以具有包含平底表面的孔，所述平底表面在同个孔中具有相邻的凹弧形底表面或微腔阵列。在实施方式中，细胞培养装置可以是，例如，具有许多“3d细胞培养孔”的单孔或多孔板构造，例如每个孔的底部或基底中的多个凹陷或凹坑，例如微腔3d细胞培养板。在一些实施方式中，所述多个3d细胞培养孔被构造成每个3d细胞培养孔容纳例如单个或一个3d细胞培养物。
[0056]
在实施方式中，具有所述至少一个凹弧形底表面的微腔或“杯子”的底表面例如可以是半球形表面，具有圆底的锥形表面，以及类似的表面几何，或者其组合。微腔底部最终以对3d细胞培养物友好的圆化或弯曲表面(例如凹陷、凹坑等凹形截头圆锥形起伏(relief)表面或其组合)终止、结束或见底。在实施方式中，腔室中的每个微腔的至少一个凹形表面包括半球形表面，从侧壁到底表面具有30至约60度锥度的锥形表面，或其组合。在一些实施方式中，所述至少一个凹弧形底表面可以是例如半球的一部分，例如半球的水平截面或切片，其直径为例如约250至约5000微米(即，0.010至0.200英寸)，包括中间值和范围，这取决于例如所选择的孔几何，每个孔内的凹弧形表面的数量，板中孔的数量及类似的考虑因素。其他凹弧形表面可以具有例如抛物线形，双曲线形，v形等截面几何结构或其组合。
[0057]
在实施方式中，包含孔的细胞培养装置，例如3d细胞培养板或微腔3d细胞培养板可进一步包括细胞非粘附性表面。细胞培养板的每个孔可以包含被构造成具有细胞非粘附性表面的内表面。例如，细胞非粘附性表面可以在孔的一部分上，例如，在所述至少一个凹表面和/或一个或多个侧壁上包含低粘附性、超低粘附性或无粘附性涂层。细胞非粘附性材料的实例包括全氟化聚合物、烯烃或类似聚合物或其混合物。其他实例包括琼脂糖，非离子型水凝胶(例如聚丙烯酰胺)，或聚醚(例如聚氧化乙烯)，或多元醇(例如聚乙烯基醇)，或类似材料，或其混合物。
[0058]
在实施方式中，侧壁表面(即，环绕部)可以是例如垂直圆柱或筒，从孔顶部到孔底
部的直径减小的垂直圆锥的一部分，具有锥形过渡的垂直方筒或垂直椭圆筒，即，在所述孔的顶部是正方形或椭圆形，过渡到圆锥形，并且以具有至少一个凹弧形表面(即，圆化或弯曲)的底部结束，或其组合。其他说明性几何结构实例包括带孔圆柱、带孔圆锥圆柱，先圆柱后圆锥，以及其他类似几何结构或其组合。
[0059]
例如，细胞非粘附性表面或低附着性基材，细胞培养制品腔室的主体和基部中的孔曲率，以及重力中的一者或多者可以诱导肿瘤细胞自组装成3d细胞培养物。肿瘤细胞保持分化的细胞功能，指示相对于以单层生长的细胞而言更像体内的响应。在实施方式中，3d细胞培养物可以具有球体状的形状，并且作为非限制性实例，直径为约100至约500微米，约150至约400微米，约150至约300微米，约200至约250微米，包括中间值和范围，这取决于例如3d细胞培养物中的细胞类型。
[0060]
在实施方式中，细胞培养装置，包括孔和/或在腔室中的每个微腔，可进一步包括不透明侧壁和/或透气且不透液体的底部，其包括至少一个凹形表面。当采用荧光成像时，不透明侧壁防止了孔或微孔之间的串扰。在一些实施方式中，包括至少一个凹形表面的至少一部分底部是透明的。具有这些特征的细胞培养装置(例如微腔球体板、微腔插入件、微腔插入板等)可以为本公开的方法提供若干优点，包括不需要将3d细胞培养物从一个多壁板(其中形成3d细胞培养物并且可以可视化)转移到另一个板以进行测定，因此节省了时间并避免了任何不必要的3d细胞培养物破坏。另外，透气性底部(例如，由在特定的给定厚度下具有透气性质的聚合物制成的孔底部)可使得3d细胞培养物接收的氧合增加。示例性的透气性底部可以由一定厚度的全氟化聚合物或例如聚4-甲基戊烷之类的聚合物形成。
[0061]
透气性聚合物的代表性厚度和范围可以是，例如，约0.001英寸至约0.025英寸，0.0015英寸至约0.03英寸，包括中间值和范围(其中1英寸＝25,400微米；0.000039英寸＝1微米)。附加或替代地，具有高透气性的其他材料，例如聚二甲基硅氧烷聚合物，可以在例如厚达约1英寸的厚度下提供足够的气体扩散。
[0062]
图7示出了在包含扩散结构或支架的细胞培养装置中的孔或微腔300的截面侧视图。如图7所示，根据一个实施方式，支架是栓系支架或栓系塑料纤维。栓系支架或塑料纤维具有允许细胞附着的粘附性表面，并且为3d细胞培养物提供了机械支撑和固定。侧壁370被设置在孔或微腔的顶部380与孔或微腔的底部360之间。孔或微腔的底部360可以包括半球形状。孔或微腔的内部或内表面340可以包括细胞非粘附性表面，例如ula表面330。栓系塑料纤维350可以被设置在孔或微腔内并且是3d细胞培养物310的锚固点。在一些实施方式中，在孔或微腔中可以设置多根栓系塑料纤维。
[0063]
在一些实施方式中，一个或多个支架，例如一根或多根纤维附着于微腔的底部，这允许微腔较浅，同时在培养基更换期间仍保留住3d细胞培养物。发生这样的原因是因为3d细胞培养物围绕形成支架的这些纤维或支柱生长，并且在一些实施方式中，附着于这些纤维或支柱。以这种方式，在最初将培养基引入到容器中期间，空气滞留变得微不足道。
[0064]
栓系支架可以通过任何合适的方式锚固到孔或微腔。作为非限制性实例，支架可以包括塑料纤维，其可以通过将塑料纤维模制到孔或微腔中锚固。培养基320以覆盖3d细胞培养物310和塑料纤维350的量放置在孔或微腔300中。孔或微腔300在内表面340上具有ula表面330，并且该ula表面防止细胞附着于孔或微腔的内表面。
[0065]
如本文所述的支架可以包括纤维或多根纤维。支架可以由能够栓系细胞以形成3d
细胞培养物的任何合适的材料形成。在一个实施方式中，细胞培养装置的每个孔可以具有由不同材料形成的纤维支架。在一个实施方式中，细胞培养装置的每个孔可以具有由相同材料形成的纤维支架。例如，纤维可以是由聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚半乳糖醛酸(pga或果胶)和/或其组合形成的聚合物纤维或塑料纤维。
[0066]
在使用pga的实施方式中，可以从支架释放或收获附着的3d细胞培养物。例如，可以用酶和/或螯合剂，例如果胶酶来消化支架。使用如本文所述的支架的方法可以任选地包括消化步骤，其中，通过在细胞培养后或者细胞培养期间的规定时间添加酶和/或螯合剂，支架被消化。在一些实施方式中，可以使用允许温和地消化支架以释放3d细胞培养物的其他水凝胶。
[0067]
在一些实施方式中，纤维可以在孔中自由漂浮。在一些实施方式中，纤维可以被锚固于孔的一部分。例如，纤维的一端可以被锚固在孔的底部。在一些实施方式中，纤维具有形状或者是经过成形的，例如，呈基本直线的形状，以弧形或弯曲形状的形式成形，或者以圆形的形式成形。
[0068]
支架可以具有允许将支架放置在孔或微腔中并且允许有足够的空间供细胞培养的任何尺寸。设置在细胞培养装置中的支架的尺寸可以不同。在一些实施方式中，支架具有约100μm至约3000μm的平均长度。在一些实施方式中，支架具有约100μm至约1000μm的平均长度。在一些实施方式中，支架具有约100μm至约500μm的平均长度。在一些实施方式中，支架具有约10μm至约100μm的平均宽度。在一些实施方式中，支架具有约10μm至约50μm的平均宽度。在一些实施方式中，支架具有约10μm至约20μm的平均宽度。
[0069]
根据本文所述的实施方式，在细胞培养装置中可以使用任何合适的多孔板用于细胞培养。在一些实施方式中，细胞培养装置是多孔板，例如，6孔板、96孔板、384孔板或1536孔板。孔板包括多个孔，布置在孔板内的孔的量依孔板的尺寸和应用而不同。在一些实施方式中，细胞培养装置还包括微腔插入件。例如，孔板可以是九十六(96)孔、超低附着表面的无菌球体微孔板(购自康宁股份有限公司；纽约州康宁市；目录号为4515,4520)。例如，根据本文实施方式所述的支架可以包括任何合适的多孔板，例如康宁96孔或384孔球体板(购自康宁股份有限公司；纽约州康宁市)和elplasia微腔孔板(购自康宁股份有限公司；纽约州康宁市)。孔板可以由玻璃、塑料或类似材料制造。孔板可以任选地具有盖子，所述盖子被构造成布置在孔板的顶部上方，以防止外来物质进入所述多个孔。盖子可以紧密地装在孔板上，或者可以通过替代性手段，例如胶带、橡皮筋等固定于孔板。
[0070]
孔板包括布置在各个孔中的细胞培养物。细胞培养物被布置在孔板的多个孔的每个孔内并在其中培育。在孔板的多个孔的每个孔内还布置有培养基，其中，培养基包封细胞培养物并且用于移除孔内的任何空气囊。在培育了一段时间(即，～6天)后，细胞培养物可能已经在孔板内形成了3d细胞培养物。在一些情况中，细胞培养物可以通过将孔板放置在孵育器(未示出)中来培育。在一些实施方式中，在将细胞培养物放置在孔内之前，可以对孔板进行消毒。
[0071]
根据本公开实施方式所述的方法可以包括：在细胞培养装置上培养细胞。在每个孔或微腔中包含支架的细胞培养装置中，将细胞培养成3d细胞培养物可以包括：将细胞接种在位于孔中的支架上。将细胞接种在支架上可以包括：使支架或孔与含有细胞的溶液接
触。在将细胞接种在支架上期间，细胞粘附于支架的表面。在支架上培养细胞可以进一步包括：使支架与细胞培养基接触。一般而言，使支架与细胞培养基接触包括：将要在支架上培养的细胞放置在具有培养基的环境中，细胞将在该培养基中得到培养。使支架与细胞培养基接触可以包括：将细胞培养基移取到支架上，或者将支架浸没在细胞培养基中，或者使细胞培养基以连续的方式在支架上通过。
[0072]
在一方面中，根据本文所述实施方式的细胞培养装置包括人工血管支架，其支持更像组织的3d细胞培养。人工血管支架可以包括多根纤维，其分支、接触和/或彼此触碰。细胞培养装置允许进行更像组织的3d培养，这是因为人工血管支架允许氧气和营养物扩散到3d细胞结构的内部团块中，同时允许代谢废物更容易地向外扩散(即，向孔的内部侧壁扩散)。细胞培养装置包括具有多个孔和/或多个微腔的多孔细胞培养板。
[0073]
图8根据本文所示或所述的一个或多个实施方式，示出了具有人工血管支架的孔或微腔的截面侧视图。图9根据本文所示或所述的一个或多个实施方式，示出了图8的孔或微腔的俯视图，其中具有血管支架的插图。孔或微腔400包括顶部480，底部460和设置在顶部480与底部460之间的侧壁470。孔或微腔400包括内表面或内部表面440，其具有对细胞无粘附性的表面430。在一些实施方式中，细胞非粘附性表面430是超低附着(ula)表面。细胞被接种到细胞培养装置的孔/微腔中，并且细胞培养基420被设置在孔/微腔内。
[0074]
具有细胞粘附性表面的人工血管支架455被设置在孔/微腔中，并且可以锚固于孔/微腔底部460。人工血管支架可以通过任何合适的方式锚固，例如，通过粘合剂或通过模制或重叠模制形成。在一些实施方式中，人工血管支架包含多根具有细胞粘附性表面的纤维450。在一些实施方式中，人工血管支架455的纤维450的形状类似于支柱或柱，并且在一端锚固于孔/微腔400的底部460。在一些实施方式中，人工血管支架包括多根纤维，并且纤维彼此相距约100μm至约200μm的距离布置。
[0075]
人工血管支架455可以由允许携带营养物和氧气的介质进行被动扩散的任何合适的材料形成。例如，人工血管支架可以包括水凝胶材料或中空纤维。中空纤维或水凝胶材料允许携带营养物和氧气的介质从细胞培养基420被动扩散到3d细胞培养物410的内部。人工血管支架可以由非离子型聚合物制造。非离子型聚合物的非限制性实例包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)、聚丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(phema)、聚半乳糖醛酸(pga或果胶)和/或其组合。在使用pga的实施方式中，可以从支架释放或收获附着的3d细胞培养物。例如，可以用酶和/或螯合剂，例如果胶酶来消化支架。可以将水凝胶材料施涂于人工血管，例如，通过将水凝胶材料表面涂覆、模制、或者印刷在支架上。水凝胶可以由本领域已知的任何材料组成，并且可生产成对细胞有粘附性或无粘附性。例如，在一些实施方式中，水凝胶纤维由ecm蛋白、脱细胞组织ecm支架、ecm肽序列、交联聚合物或其组合形成。粘附性水凝胶的非限制性实例包括ecm蛋白和脱细胞组织ecm支架。ecm的实例包括多糖糖胺聚糖(gag)和蛋白质，例如胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白。非粘附性水凝胶的非限制性实例包括交联聚合物，例如聚环氧乙烷、聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺和聚半乳糖醛酸(pga)等。在一些实施方式中，可以使用允许温和地消化支架以释放3d细胞培养物的其他水凝胶。在一些实施方式中，水凝胶由非附着性水凝胶形成并且包括被附着基团官能化的表面。附着基团的非限制性实例包括ecm蛋白和附着肽序列，例如，精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(rgd)。
[0076]
接种在孔/微腔中的细胞可以附着于人工血管支架或围绕人工血管支架形成。在细胞培养期间，细胞不断生长以在支架中的纤维之间以及围绕人工血管支架形成3d细胞团块。随着3d细胞团块在细胞培养期间生长，人工血管支架的中空纤维或水凝胶材料允许携带营养物和氧气的介质从细胞培养基420被动扩散到3d细胞培养物410的内部。由于人工血管支架的扩散特征，营养物和氧气在3d细胞培养物的整个体积中更加均匀地供应。另外，由人工血管支架提供的扩散性允许在3d细胞培养物的整个体积中更加均匀地耗尽代谢废物浓度。由此，人工血管支架的扩散特征允许在坏死的核形成出现之前生产更大的3d细胞培养体积。另外，人工血管支架在孔/微腔中提供了3d细胞团块的机械支撑和固定。通过固定3d细胞团块，3d细胞培养物的成像得到了简化。作为对孔或微腔的许多不同部分进行聚焦并且搜索3d细胞培养物的存在或位置的替代，使用者可取而代之地将成像设备聚焦在嵌在3d细胞团块中的人工血管支撑件上。另外，人工血管支撑件在全部的孔或微腔中可以锚固在统一的位置。作为非限制性实例，在一些实施方式中，人工血管支撑件在每个孔或微腔中居中并锚固在孔或微腔的中心底部部分。
[0077]
在一个方面中，细胞培养装置包括如图10所示的水凝胶支架。图10根据本文所示或所述的一个或多个实施方式，示出了水凝胶支架600的侧视透视图。水凝胶支架600包括长度不同的水凝胶纤维655、653、657。例如，水凝胶纤维653具有比水凝胶纤维657更长的长度。支架的水凝胶纤维具有细胞粘附性表面，并且粘附于水凝胶支架的细胞形成3d细胞培养物610。
[0078]
水凝胶允许化合物被动扩散进出3d细胞培养物，因此由于大大提高了气体、营养物和代谢废物的扩散交换而有助于防止形成坏死的核。在一些实施方式中，纤维由水凝胶材料形成。在一些实施方式中，纤维或支柱由固体材料形成，例如聚合物(如聚苯乙烯)，其接着涂覆有一定厚度的水凝胶，该厚度足以允许对3d细胞培养物的核进行扩散交换。在一个实施方式中，水凝胶纤维或支柱为游离水凝胶纤维的形式，其在细胞接种之前或细胞接种期间沉积到微腔中。水凝胶可包括本领域已知的任何材料，并且可生产成对细胞有粘附性或无粘附性。在一些实施方式中，水凝胶纤维由细胞外基质(ecm)蛋白、脱细胞组织ecm支架、ecm肽结合序列或交联聚合物形成。粘附性水凝胶的非限制性实例包括ecm蛋白、脱细胞组织ecm支架和ecm肽序列。ecm的实例包括多糖糖胺聚糖(gag)和蛋白质，例如胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白。在一些实施方式中，水凝胶纤维由非附着性水凝胶形成并且包括被附着基团官能化的表面。附着基团的非限制性实例包括ecm蛋白和附着肽序列，例如，精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(rgd)。非粘附性水凝胶的非限制性实例包括交联聚合物，例如聚环氧乙烷、聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺和聚半乳糖醛酸(pga)等。
[0079]
在实施方式中，水凝胶支架允许形成互连式细胞培养装置，其包括在装置的孔/微腔中的3d细胞培养物之间的水凝胶通道，如图11所示。为了形成互连式细胞培养装置，在用于3d细胞培养的培养装置的初始设置期间，可以将预制的水凝胶支架纤维与细胞混合。结果，在3d细胞培养物结构内将存在不同尺寸的水凝胶支架。例如，可以制备包含细胞悬液和水凝胶支架的混合物，并将其施涂于多孔细胞培养板以用于3d细胞培养物的大批培养。用于3d细胞培养物的大批培养的多孔细胞培养板的一个非限制性实例包括elplasia 24孔微腔板(可购自康宁股份有限公司；纽约州康宁市)。由于支架的扩散特征，营养物和氧气在3d细胞培养物的整个体积中更加均匀地供应，反过来，代谢废物浓度在整个3d细胞培养物的
体积中能被更均匀地耗尽。这允许在3d细胞培养中出现坏死的核形成之前，产生更大的3d细胞培养体积。
[0080]
图11根据本文所示或所述的一个或多个实施方式，示出了在互连式细胞培养装置700中的互连孔或微腔702-705的俯视图。本公开的实施方式包括多孔细胞培养板701。所述细胞培养板可以包括多个孔和/或多个微腔702、703、704、705，并且孔或微腔的内表面可以进一步包括非粘附性表面以防止细胞附着。为了建立水凝胶支架600，将细胞710连同水凝胶纤维655一起接种在细胞培养板701的孔或微腔702-705中。
[0081]
由于孔和/或微腔702-705的非粘附性表面和水凝胶纤维655的细胞粘附性表面，细胞710附着到水凝胶支架600中的水凝胶纤维655的表面。利用从设置在孔或微腔702-705中的细胞培养基720供应的营养物，细胞710在水凝胶支架600中的水凝胶纤维655之间及周围不断生长，以形成3d细胞培养物725。另外，由于水凝胶纤维具有不同的尺寸和长度，因此一个支架的纤维也可以嵌入到相邻微腔/孔中的3d细胞培养物中。例如，当水凝胶纤维的各相对端部位于不同的孔或微腔中时，建立了扩散路径或水凝胶通道750，由该扩散路径或水凝胶通道750形成了互连式细胞培养装置。作为一个实例，水凝胶纤维655a的一端位于孔/微腔702中，而水凝胶纤维655a的相对端部位于相邻的孔/微腔703中，以在孔或微腔702与703之间建立水凝胶通道750。水凝胶纤维和水凝胶通道起到扩散路径的作用，其允许被动扩散到3d细胞培养物的核及从3d细胞培养物的核被动扩散，并且允许在3d细胞培养物内部以及整个培养物上提供营养。另外，水凝胶纤维提供了与互连孔或微腔的物理连接，该物理连接防止了在操作期间，例如培养基更换或药物测试期间，3d细胞培养物丢失。
[0082]
在细胞培养装置的实施方式中可以培养任何类型的细胞，包括但不限于永生化细胞、原代培养细胞、癌细胞、干细胞(例如胚胎干细胞或诱导多能干细胞)等。虽然本文所述的实施方式中考虑了三维细胞培养，但是当引入到根据本公开实施方式所述的细胞培养装置时，细胞可以为任何培养形式，包括分散(例如刚接种的)、融合、二维、三维、球体等。所述细胞可以是哺乳动物细胞、禽细胞、鱼细胞等。所述细胞可以属于任何组织类型，包括但不限于肾、成纤维细胞、乳房、皮肤、脑、卵巢、肺、骨、神经、肌肉、心脏、结直肠、胰腺、免疫(例如，b细胞)、血液等组织类型。在一些实施方式中，所述细胞培养物是活细胞培养物。在一些实施方式中，细胞培养物是由人原代肝细胞(phh)制备的肝脏球体。但是应理解，考虑了其他类型的细胞培养物并且它们是可能的。
[0083]
可以使用能够支持细胞生长的任何细胞培养基。细胞培养基可以例如但不限于糖、盐、氨基酸、血清(例如胎牛血清)、抗生素、生长因子、分化因子、着色剂或其他所需因子。示例性的细胞培养基包括达氏修正依氏培养基(dmem)、汉氏f12营养混合物、最低必需培养基(mem)、rpmi培养基、伊思考夫改良杜尔贝可培养基(imdm)mesencult-xf培养基等。另外，可以根据任何预定的计划移除和替换细胞培养基。例如，可以每一小时，或者每12小时，或者每24小时，或者每2天，或者每3天，或者每4天，或者每5天等移除和替换至少一些细胞培养基。
[0084]
在一些实施方式中，如本文所用的细胞培养制品包括1至约2000个孔，其中每个孔与任何其他孔物理分离。在实施方式中，所述孔是多孔板的孔。例如，细胞培养装置可以是具有单个孔或室的烧瓶，其在细胞培养表面或底表面上具有微腔阵列。细胞培养装置可以是具有1、6、12、24、96、384或1536个孔的多孔板。在一些实施方式中，每个孔包括约25至约
1,000个微腔。
[0085]
在一些实施方式中，如本文所用的“孔”是以多孔板形式提供的独立的细胞培养环境。在实施方式中，孔可以是4孔板、6孔板、12孔板、24孔板、96孔板、538孔板、1536孔板或任何其他多孔板构造的孔。在一些实施方式中，多孔板的孔可以被结构化以约束关注的细胞在该单个孔中作为单个3d细胞团块生长。例如，96孔板的孔(传统96孔板的孔)为约10.67mm深，具有约6.86mm的顶部孔口和约6.35mm的孔底部直径。在实施方式中，3d细胞培养板意为具有单个3d细胞培养室或孔的阵列的多孔板。也就是说，在实施方式中，多孔板可以具有多个室或孔，其中，每个室或孔被构造用于容纳单个3d细胞培养物或3d细胞团块。
[0086]
如本文所用的“微孔”或“微腔”被结构化以约束关注的细胞以3d构象生长，该微孔或微腔的尺寸或处理或尺寸和处理的组合促进培养中的细胞以3d构象而不是二维细胞片生长。处理例如包括用低结合溶液处理，使表面疏水性降低的处理，或者灭菌处理。
[0087]
在一些实施方式中，如本文所用的孔可以具有微腔阵列或多个微腔。在实施方式中，微腔或微孔例如可以是限定了上部孔口和最低点，上部孔口的中心以及最低点与上部孔口的中心之间的中心轴线的微孔。在实施方式中，微腔或微孔的孔围绕轴线旋转对称(即，侧壁是圆柱形的)。在一些实施方式中，上部孔口限定了跨越上部孔口的距离在250μm至1mm之间，或者这些测量值内的任何范围。在一些实施方式中，从上部孔口到最低点的距离(深度“d”)在200μm至900μm之间。在一些实施方式中，从上部孔口到最低点的距离(深度“d”)在400μm至600μm之间。在一些实施方式中，从上部孔口到最低点的距离(深度“d”)为至少200μm。在一些实施方式中，从上部孔口到最低点的距离(深度“d”)为至少2500μm。在一些实施方式中，从上部孔口到最低点的距离(深度“d”)为至少400μm。在一些实施方式中，从上部孔口到最低点的距离(深度“d”)不超过1mm。在一些实施方式中，从上部孔口到最低点的距离(深度“d”)不超过900μm。在一些实施方式中，从上部孔口到最低点的距离(深度“d”)不超过600μm。微腔阵列可具有不同的几何结构，例如，抛物线形，双曲线形，v形和横截面几何结构，或其组合。
[0088]
在实施方式中，如本文所用的孔或微腔的孔的圆形底部例如可以是半球，或者半球的一部分，例如，构成孔或微腔的底部的半球的水平截面或切片。
[0089]
在实施方式中，如本文所用的微腔板意为具有孔阵列，并且每个孔具有微腔阵列的多孔板。本文所用的插入件意为适合放入板或微腔板的孔中的细胞培养孔。插入件具有侧壁和底表面，其限定了用于培养细胞的腔体。如本文所用的插入板意为含有插入件阵列的插入板，所述插入件被结构化以适于放入多孔板的孔阵列。如本文所用的微腔插入板意为插入件阵列中的每个插入件的底表面具有微腔阵列的插入板。
[0090]
在实施方式中，如本文所用的术语“3d细胞培养物”可以是例如培养中的细胞群，其不是平坦的二维(2d)细胞片。在一些实施方式中，3d细胞培养物可以类似于3d球体状的形状，或者类似于培养中的细胞的聚集体或球的形状，其不是平坦的二维细胞片。在实施方式中，3d细胞培养物包括单个细胞类型或多个细胞类型。在3d细胞培养物类似于3d球体状的形状的实施方式中，3d细胞培养物的直径为例如约100至约500微米，更优选约150至约400微米，甚至更优选约150至约300微米，最优选约200至约250微米，包括中间值和范围，这取决于例如3d细胞培养物中的细胞类型。
[0091]
在一方面中，一种细胞培养装置，其包括多孔细胞培养板和多个支架，所述多孔细
胞培养板包括多个孔，每个孔包括顶部孔口、底部和侧壁，所述侧壁被设置在顶部与底部之间，其中，每个孔被构造成具有包含细胞非粘附性表面的内表面；所述多个支架被设置在多孔细胞培养板的所述多个孔中，每个支架包括细胞粘附性表面。底部可以包括半球形状。在每个孔中可以设置至少一个支架。在每个孔中可以设置多个支架。所述多个孔中的至少一些孔可以具有设置在其中的支架。
[0092]
至少一部分的支架可以锚固到各个孔的底部，或底部的一部分。支架的至少一端可以锚固到各个孔的底部部分。
[0093]
所述底部可以包括多个微腔。在所述多个微腔的每个微腔中可以设置有支架。支架可以锚固到各个微腔的底部部分。
[0094]
支架可以具有约100μm至约1000μm的平均长度。支架可以具有约10μm至约100μm的平均宽度。
[0095]
所述多个支架中的支架可以包括纤维支架。纤维支架可以由聚乙烯基醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚半乳糖醛酸和/或其组合形成。纤维支架可以包括多根纤维。所述多根纤维中的每根纤维可以锚固到各个孔的底部部分。在每个孔中，各个纤维的锚固端可以彼此间隔约100μm至约200μm的距离。
[0096]
在一方面中，所述多个支架中的支架可以包括人工血管支架。所述人工血管支架可以包含水凝胶。所述人工血管支架可以包括中空纤维。所述人工血管支架可以包括多根中空纤维。各个中空纤维可以锚固到孔的底部，彼此相距约100μm至约200μm。中空纤维可以由非离子型聚合物形成。非离子型聚合物可以包括聚乙烯基醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚半乳糖醛酸和/或其组合。中空纤维还可包含水凝胶涂层。
[0097]
在一方面中，提供了一种培养三维(3d)细胞培养物的方法。所述方法包括：在根据本文所述任何方面的细胞培养装置中接种细胞，其中，所述细胞附着于设置在细胞培养装置中的支架的细胞粘附性表面；以及通过向细胞培养装置添加细胞培养基以提供营养物和氧气，将细胞培养成3d细胞培养物，其中，所述细胞在添加或更换细胞培养基期间保持附着于支架；以及任选地，消化所述支架。所述方法还可以包括：对附着于细胞培养装置的支架的3d细胞培养物进行成像。
[0098]
在一方面中，提供了一种互连式细胞培养装置。所述互连式细胞培养装置包括多孔细胞培养板和多个水凝胶支架，所述多孔细胞培养板包括多个孔，每个孔包括顶部、底部和侧壁，所述侧壁被设置在顶部与底部之间，其中，每个孔被构造成具有包含细胞非粘附性表面的内表面；所述多个水凝胶支架被设置在多孔细胞培养板中，所述多个水凝胶支架包括不同长度的水凝胶纤维，其中，水凝胶纤维的各相对端被设置在多孔细胞培养板中的不同孔中，以建立互连孔。底部可以包括半球形状。水凝胶纤维可以具有约100μm至约100mm的长度。水凝胶纤维可以具有约10μm的平均宽度。每根水凝胶纤维可以包括细胞粘附性表面。水凝胶纤维可以由细胞外基质(ecm)蛋白、脱细胞组织ecm支架、ecm肽结合序列、交联聚合物和/或其组合形成。水凝胶支架在孔内可以是未锚固或是自由漂浮。所述底部可以包括多个微腔。水凝胶纤维的各相对端部被设置在不同的微腔中，以建立互连微腔。
[0099]
在一方面中，提供了一种形成互连式细胞培养装置的方法。所述方法包括：用细胞接种细胞培养装置，所述细胞培养装置包括多孔细胞培养板，所述多孔细胞培养板包括多
个孔，每个孔包括顶部、底部和侧壁，所述侧壁被设置在顶部与底部之间，并具有包含超低附着表面的内表面；用多个水凝胶支架接种该细胞培养装置，所述水凝胶支架包括多根水凝胶纤维，其中，水凝胶纤维的各相对端部被设置在多孔细胞培养板中的不同孔中，以建立互连孔；以及提供细胞培养基以提供营养物和氧气供三维(3d)细胞培养物的细胞生长和形成。底部可以包括半球形状。所述底部可以包括多个微腔。
[0100]
对本领域的技术人员显而易见的是，可以对本文所述的实施方式进行各种修改和变动而不偏离要求保护的主题的精神和范围。因此，本说明书旨在覆盖本文所述的各个实施方式的修改和变动，只要这些修改和变动在所附权利要求书及其等同内容的范围之内。
[0101]
应理解，多个公开的实施方式可涉及与特定实施方式一起描述的特定特征、元素或步骤。还应理解，虽然以涉及一个特定实施方式的形式进行描述，但是特定特征、元素或步骤可以各个未例示的组合或排列方式中的替换性实施方式互换或组合。
[0102]
还应理解的是，本文所用术语“该”、“一个”或“一种”表示“至少一个(一种)”，不应局限为“仅一个(一种)”，除非明确有相反的说明。因此，例如，提到的“一种开口”包括具有两个或更多个这类“开口”的实例，除非文中另行明确指明。
[0103]
除非另外说明，本文中使用的所有科技术语的含义具有本领域通用的含义。本文提供的定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本公开的范围构成限制。
[0104]
如在本文中所使用的，“具有”、“具备”、“含有”、“包括”、“包含”、“含”等以其开放含义使用，通常表示“包括但不限于”。
[0105]
本文中，范围可以表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。当表述这种范围时，实例包括自某一具体值始和/或至另一具体值止。类似地，当用先行词“约”将数值表示为近似值时，应理解具体数值构成了另一个方面。还应理解，每个范围的端点在与另一个端点有关及独立于另一个端点时都是重要的。
[0106]
本文表示的所有数值应理解为包括“约”，无论是否如此陈述，除非另有明确指明。然而，还应当理解的是，所述的每个数值也可以考虑是精确值，无论其是否以“约”该数值表示。因此，“小于10mm的尺寸”和“小于约10mm的尺寸”都包括“小于约10mm的尺寸”和“小于10mm的尺寸”的实施方式。
[0107]
除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任何方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，当方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，都不旨在暗示该任意特定顺序。
[0108]
虽然使用过渡语“包含”可以公开特定实施方式的各个特征、元素或步骤，但是应理解的是，这暗示了包括可采用过渡语“由
……
构成”或“基本上由
……
构成”描述在内的替代性实施方式。因此，例如，包含a+b+c的方法的隐含的替代性实施方式包括其中方法由a+b+c组成的实施方式以及其中方法基本上由a+b+c组成的实施方式。
[0109]
虽然具体实施方式中已经描述了本公开的多个实施方式，但是应理解的是，本公开不限于所公开的实施方式，在不偏离由所附权利要求书列出和限定的本公开的情况下，能够进行各种重排、修改和替换。

技术特征：
1.一种细胞培养装置，其包含：多孔细胞培养板，所述多孔细胞培养板包括多个孔，每个孔包括顶部孔口、底部和设置在顶部与底部之间的侧壁，其中，每个孔被构造成具有包含细胞非粘附性表面的内表面；和设置在多孔细胞培养板的多个孔中的多个支架，每个支架包括细胞粘附性表面。2.如权利要求1所述的装置，其中，所述底部包括半球形状。3.如权利要求1或权利要求2所述的装置，其中，在每个孔中设置有至少一个支架。4.如权利要求3所述的装置，其中，支架的至少一端锚固到各个孔的底部部分。5.如权利要求1-4中任一项所述的装置，其中，所述底部包括多个微腔。6.如权利要求5所述的装置，其中，在所述多个微腔的每个微腔中设置有支架。7.如权利要求6所述的装置，其中，支架锚固到每个微腔的底部部分。8.如权利要求1-7中任一项所述的装置，其中，支架具有100μm至1000μm范围内的平均长度。9.如权利要求1-8中任一项所述的装置，其中，支架具有10μm至100μm范围内的平均宽度。10.如权利要求1-9中任一项所述的装置，其中，所述多个支架中的支架包括纤维支架。11.如权利要求10所述的装置，其中，纤维支架由聚乙烯基醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚半乳糖醛酸和/或其组合形成。12.如权利要求10或权利要求11所述的装置，其中，纤维支架包括多根纤维。13.如权利要求12所述的装置，其中，所述多根纤维中的每根纤维锚固到各个孔的底部部分。14.如权利要求13所述的装置，其中，在各个孔中，各个纤维的锚固端彼此间隔100μm至200μm的距离。15.如权利要求1所述的装置，其中，所述多个支架中的支架包括人工血管支架。16.如权利要求15所述的装置，其中，人工血管支架包含中空纤维。17.如权利要求15所述的装置，其中，人工血管支架包含多根中空纤维。18.如权利要求17所述的装置，其中，各个中空纤维彼此间隔100μm至200μm锚固到孔的底部。19.如权利要求16所述的装置，其中，中空纤维由非离子型聚合物形成。20.如权利要求19所述的装置，其中，非离子型聚合物包含聚乙烯基醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚苯乙烯、聚丙烯或聚半乳糖醛酸。21.如权利要求16所述的装置，其中，所述中空纤维还包括水凝胶涂层。22.如权利要求15所述的装置，其中，人工血管支架包含水凝胶。23.一种培养三维(3d)细胞培养物的方法，所述方法包括：在根据权利要求1-22中任一项所述的细胞培养装置中接种细胞，其中，细胞附着于设置在细胞培养装置中的支架的细胞粘附性表面；以及通过向细胞培养装置添加细胞培养基以提供营养物和氧气，将细胞培养成3d细胞培养物，其中，在细胞培养基的添加或交换期间，细胞保持附着于支架；和任选地，消化所述支架。24.如权利要求23所述的方法，其还包括：对附着于细胞培养装置的支架的3d细胞培养
物进行成像。25.一种互连式细胞培养装置，其包含：多孔细胞培养板，所述多孔细胞培养板包括多个孔，每个孔包括顶部、底部和设置在顶部与底部之间的侧壁，其中，每个孔被构造成具有包含细胞非粘附性表面的内表面；和设置在多孔细胞培养板中的多个水凝胶支架，所述多个水凝胶支架包括不同长度的水凝胶纤维，其中，水凝胶纤维的各相对端被设置在多孔细胞培养板中的不同孔中，以建立互连孔。26.如权利要求25所述的装置，其中，所述底部包括半球形状。27.如权利要求25或26所述的装置，其中，水凝胶纤维具有100μm至100mm范围内的长度。28.如权利要求25-27中任一项所述的装置，其中，水凝胶纤维具有10μm的平均宽度。29.如权利要求25-28中任一项所述的装置，其中，每根水凝胶纤维包含细胞粘附性表面。30.如权利要求25-29中任一项所述的装置，其中，水凝胶纤维由细胞外基质(ecm)蛋白、脱细胞组织ecm支架、ecm肽结合序列、交联聚合物和/或其组合形成。31.如权利要求25-30中任一项所述的装置，其中，水凝胶支架是未锚固的或在孔中自由漂浮。32.如权利要求25-31中任一项所述的装置，其中，所述底部包括多个微腔。33.如权利要求32所述的装置，其中，水凝胶纤维的相对端部被设置在不同的微腔中以建立互连微腔。34.一种形成互连式细胞培养装置的方法，所述方法包括：用细胞接种细胞培养装置，所述细胞培养装置包括多孔细胞培养板，其包括多个孔，每个孔包括顶部、底部和设置在顶部与底部之间的侧壁，并且具有包含超低附着表面的内表面；用多个水凝胶支架接种细胞培养装置，所述水凝胶支架包括多根水凝胶纤维，其中，水凝胶纤维的各相对端被设置在多孔细胞培养板中的不同孔中，以建立互连孔；和提供细胞培养基以为细胞生长和三维(3d)细胞培养物的形成提供营养物和氧气。35.如权利要求34所述的方法，其中，所述底部包括半球形状。36.如权利要求34或权利要求35所述的方法，其中，所述底部包括多个微腔。

技术总结
一种细胞培养装置，其包括多孔细胞培养板，所述多孔细胞培养板包括多个孔，每个孔包括顶部、底部和设置在顶部与底部之间的侧壁，并具有包含超低附着表面的内表面。设置在多孔细胞培养板的孔中的多个支架，每个支架包括细胞粘附性表面。在一些实施方式中，支架包含纤维支架。在一些实施方式中，支架包含人工血管支架。在一些实施方式中，细胞培养装置包括设置在多孔细胞培养板中的多个水凝胶支架，所述多个水凝胶支架包括不同长度的水凝胶纤维，其中，水凝胶纤维的各相对端被设置在多孔细胞培养板中的不同孔中，以建立互连孔。以建立互连孔。以建立互连孔。


技术研发人员：李锋 G
受保护的技术使用者：康宁股份有限公司
技术研发日：2021.09.29
技术公布日：2023/8/24