血液游离DNA提取试剂盒及核酸无醇提取方法与流程

血液游离dna提取试剂盒及核酸无醇提取方法
技术领域
1.本技术属于核酸提取技术领域，具体涉及一种血液游离dna提取试剂盒及核酸的无醇提取方法。


背景技术：

2.游离dna，(cell free dna，cfdna)存在于血液，它包含双链dna片段，绝大多数是短链，而且通常浓度很低。在健康人体中含有少量的血浆cfdna，其被认为来自于正常的造血细胞。cfdna的循环半衰期只有15分钟至几个小时，这提示它在细胞凋亡时被持续的释放。在特定的生理条件或疾病过程中，有相当一部分cfdna会与在健康的时候不同，基于这一结果，近年来cfdna已被用于无创诊断，尤其在产前筛查、免疫性疾病诊疗、癌症筛查与治疗等方面。在孕妇中，约有10％-15％的cfdna来自于胎盘滋养层，现在cfdna多用于在高危孕妇中筛查胎儿的遗传缺陷，例如无创唐氏筛查。在肿瘤病人中，通过cfdna的量化突变来检测肿瘤已被越来越多的人认可。
3.由于cfdna含量少，半衰期短等特点，cfdna的提取方法备受重视。在开展septin9结直肠癌筛查，胎儿遗传缺陷等项目中，均涉及到cfdna的提取技术。
4.游离dna提取的步骤主要分为样本裂解、游离dna与磁珠或者硅胶柱结合、清洗、洗脱。目前游离dna提取过程中最常用的清洗方法多为乙醇清洗，常见的提取试剂清洗液多为高浓度的胍盐和一定含量的乙醇，用于除去残留的蛋白质及部分盐类，然后用75％～85％乙醇溶液，对核酸进一步纯化。
5.在游离dna提取过程中使用乙醇会存在如下问题：1.乙醇残留：乙醇清洗后，若晾干时间不足，残留的乙醇对下游pcr反应将会有抑制作用；若晾干时间过长，游离dna的回收率大幅降低，出现无法检出的情况。2.开瓶稳定性：乙醇易挥发，添加过乙醇的提取试剂需即开即用，无封闭状态下乙醇挥发会造成提取效率降低。3.运输问题：乙醇属于易燃、易挥发的液体，清洗液中含有高浓度的乙醇，使核酸提取试剂的运输成为一大难题。现有技术中，例如中国专利cn 114350652a，在游离dna的提取方法中使用改良后的裂解液和蛋白酶k缓冲液结合，能够得到纯度更高的dna。但蛋白酶k裂解增加了提取步骤，且耗时较长。


技术实现要素：

6.基于现有技术中的不足，本技术的目的在于提供一种用于血液游离dna提取的试剂盒和游离dna无醇提取的方法，实现提取过程中裂解和结合同时进行，且操作过程中不加入乙醇或异丙醇，能够更高效快捷地得到高纯度游离dna。
7.本技术具体技术方案如下：
8.1.一种用于血液游离dna的裂解结合液，其包括助沉剂，所述助沉剂为polya和/或糖原，
9.优选在所述裂解结合液中所述polya的浓度为20mmol/l～50mmol/l，和/或，在所述裂解结合液中所述糖原的浓度为20mg/ml～100mg/ml。
10.2.根据项1所述的裂解结合液，其还包括异硫氰酸胍或盐酸胍、tris-hc1、乙二胺四乙酸缓冲液、十二烷基硫酸钠缓冲液、吐温20、氯化钠和peg，
11.优选的，在所述裂解结合液中所述异硫氰酸胍或盐酸胍的浓度为2mol/l～6mol/l，优选为5mol/l，
12.在所述裂解结合液中所述tris-hc1的浓度为10mmol/l～1mol/l，
13.在所述裂解结合液中所述乙二胺四乙酸缓冲液的浓度为1mmol/l～100mmol/l，
14.在所述裂解结合液中所述十二烷基硫酸钠缓冲液的浓度为0.01％-0.2％(w/v)，
15.在所述裂解结合液中所述吐温20的浓度为1％-10％(w/v)，
16.在所述裂解结合液中所述氯化钠的浓度为0.5～1mol/l，
17.在所述裂解结合液中所述peg的浓度为6％-20％(w/v)，优选为18％(w/v)。
18.3.一种血液游离dna提取试剂盒，包括：
19.裂解结合液；
20.无醇清洗液a；
21.无醇清洗液b；其中，
22.所述裂解结合液为项1或2所述的裂解结合液。
23.4.根据项3所述的试剂盒，其中，所述无醇清洗液a包括异硫氰酸胍、tris-hc1、乙二胺四乙酸缓冲液、吐温20、氯化钠和peg，
24.优选的，
25.在所述无醇清洗液a所述异硫氰酸胍的浓度为2mol/l～6mol/l，优选为3.5mol/l，
26.在所述无醇清洗液a中所述tris-hc1的浓度为10mmol/l～1mol/l，
27.在所述无醇清洗液a中所述乙二胺四乙酸缓冲液的浓度为1mmol/l～100mmol/l，
28.在所述无醇清洗液a中所述吐温20的浓度为1％-20％(w/v)，
29.在所述无醇清洗液a中所述氯化钠的浓度为0.5～1mol/l，
30.在所述无醇清洗液a中所述peg的浓度为3％-20％(w/v)，优选为10％(w/v)。
31.5.根据项3所述的试剂盒，其中，所述无醇清洗液b包括tris-hc1、氯化钠和peg，
32.优选的，
33.在所述无醇清洗液b中所述tris-hc1的浓度为10mmol/l～1mol/l，
34.在所述无醇清洗液b中所述氯化钠的浓度为0.5mol/l～1mol/l，
35.在所述无醇清洗液b中所述peg的浓度为3％-20％(w/v)，优选为10％(w/v)。
36.6.根据项3所述的试剂盒，其中还包括洗脱液和磁珠。
37.7.根据项6所述的试剂盒，其中，所述洗脱液含有0.01mmol/l～10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液，lmmol/l～100mmol/l的trizma base缓冲液。
38.8.根据项6所述的试剂盒，其中，所述磁珠选自硅羟基磁珠，平均粒径为300nm～500nm，浓度为20-50mg/ml。
39.9.根据项2所述的裂解结合液或项3～5任一项所述的试剂盒，其中，所述裂解结合液中的peg的分子量为6000-8000，优选为6000。
40.10.根据项4或5所述的试剂盒，其中，所述无醇清洗液a中的peg和/或无醇清洗液b中的peg的分子量为6000-8000，优选为6000。
41.11.一种提取血液中游离dna的方法，其中包括如下步骤：取血液样品加入离心管
中，并加入裂解结合液和磁珠，混匀后进行磁分离，吸弃上清液；
42.向离心管中加入无醇清洗液a，混匀后进行磁分离，吸弃上清液；
43.向进行了磁分离之后的样品中加入无醇清洗液b，混匀后再次进行磁分离，吸弃上清液；
44.向再次进行磁分离之后样品中加入洗脱液，加热条件下混匀；
45.将离心管置于磁力架上进行磁分离，取上清液，完成游离dna的提取。
46.12.根据项11所述的方法，其中，所述裂解结合液包括助沉剂，优选所述助沉剂为polya和/或糖原。
47.13.根据项12所述的方法，其中，在所述裂解结合液中的所述polya为20mmol/l～50mmol/l，和/或，在所述裂解结合液中的所述糖原为20mg/ml～100mg/ml。
48.14.根据项11所述的方法，其中，所述裂解结合液还包括异硫氰酸胍或盐酸胍、tris-hc1、乙二胺四乙酸缓冲液、十二烷基硫酸钠缓冲液、吐温20、氯化钠和peg，
49.优选的，
50.在所述裂解结合液中所述异硫氰酸胍或盐酸胍为2mol/l～6mol/l，
51.在所述裂解结合液中所述tris-hc1为10mmol/l～1mol/l，
52.在所述裂解结合液中所述乙二胺四乙酸缓冲液为1mmol/l～100mmol/l，
53.在所述裂解结合液中所述十二烷基硫酸钠缓冲液为0.01％-0.2％(w/v)，
54.在所述裂解结合液中所述吐温20为1％-10％(w/v)，
55.在所述裂解结合液中所述氯化钠为0.5～1mol/l，
56.在所述裂解结合液中所述peg为6％-20％(w/v)。
57.15.根据项11所述的方法，其中，所述无醇清洗液a包括异硫氰酸胍、tris-hc1、乙二胺四乙酸缓冲液、吐温20、氯化钠和peg，
58.优选的，
59.在所述无醇清洗液a中所述异硫氰酸胍为2mol/l～6mol/l，
60.在所述无醇清洗液a中所述tris-hc1为10mmol/l～1mol/l，
61.在所述无醇清洗液a中所述乙二胺四乙酸缓冲液为1mmol/l～100mmol/l，
62.在所述无醇清洗液a中所述吐温20为1％-20％(w/v)，
63.在所述无醇清洗液a中所述氯化钠为0.5～1mol/l，
64.在所述无醇清洗液a中所述peg为3％-20％(w/v)。
65.16.根据项11所述的方法，其中，所述无醇清洗液b包括tris-hc1、氯化钠和peg，
66.优选的，
67.在所述无醇清洗液b中所述tris-hc1为10mmol/l～1mol/l，
68.在所述无醇清洗液b中所述氯化钠为0.5mol/l～1mol/l，
69.在所述无醇清洗液b中所述peg为3％-20％(w/v)。
70.17.根据项11所述的方法，其中，所述洗脱液含有0.01mmol/l～10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液和lmmol/l～100mmol/l的trizma base缓冲液。
71.18.根据项11所述的方法，其中，所述磁珠选自硅羟基磁珠，含量为0.01～0.1％(w/v)，平均粒径为300nm～500nm。
72.19.根据项11～18任一项所述的方法，其中，是采用项1或2的所述的裂解结合液或
项3～9中任一项所述的试剂盒进行游离dna的提取。
附图说明
73.图1为实施例1.1无醇提取cfdna片段分布示意图。
74.图2为实施例1.1无醇提取cfdna与参比有醇试剂盒提取回收率结果示意图。
75.图3a、3b为实施例1.2和对比例1.5～1.8的cfdna提取回收率结果示意图及局部放大图。
76.图4为实施例1.3和对比例1.9、1.10的cfdna提取回收率结果示意图。
77.图5为实施例1.1提取cfdna与参比有醇试剂盒的cfdna提取回收率ct值结果示意图。
78.图6为实施例1.1、1.2和对比例1.5～1.8的cfdna提取回收率ct值结果示意图。
79.图7为实施例1.1、1.3和对比例1.9、1.10的cfdna提取回收率ct值结果示意图。
80.图8为为实施例1.1、1.4和对比例1.11、1.12的cfdna提取回收率ct值结果示意图。
81.发明的效果
82.与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：
83.1.本技术提供一种用于血液游离dna提取的试剂盒和游离dna无醇提取的方法，在cfdna的提取中，可以避免乙醇对下游pcr反应的抑制作用，安全无污染，有效提升提取纯度及回收率。
84.2.提取中不需要单独的蛋白酶裂解过程，在cfdna的提取过程中实现裂解和结合同时进行，实验步骤简便，提高了提取效率。
85.3.通过对助沉剂、磁珠及peg的进一步优选，进一步提高了cfdna的回收率。
86.4.操作简便，既可以手工操作也可以用于自动化平台。
87.本技术的其他特点和优势将由下面的具体实施方式及实施例作详细的描述。
具体实施方式
88.下面对本技术做详细说明。虽然显示了本技术的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本技术，并且能够将本技术的范围完整的传达给本领域的技术人员。
89.本技术一方面提供了一种用于提取血液中游离dna的裂解结合液，其包括助沉剂。在本技术一个具体的实施方式中，所述助沉剂为polya和/或糖原。
90.在核酸提取纯化过程中，加入助沉剂可以提高核酸沉淀的得率，使痕量dna的回收率明显提升。
91.在一个优选的实施方式中，所述polya为20mmol/l～50mmol/l，例如可以为20、25、30、35、40、45、50mmol/l等。
92.在一个优选的实施方式中，所述糖原为20mg/ml～100mg/ml，例如可以为20、30、40、50、60、70、80、90、100mg/ml等。
93.在一些具体的实施方式中，所述裂解结合液中还含有异硫氰酸胍或盐酸胍、tris-hc1、乙二胺四乙酸缓冲液、十二烷基硫酸钠缓冲液、吐温20、氯化钠和peg。
94.在一个具体的实施方式中，所述裂解结合液中的所述异硫氰酸胍或盐酸胍为
2mol/l～6mol/l，例如可以为2、3、4、5、6mol/l等。
95.在一个具体的实施方式中，所述裂解结合液中的所述tris-hc1为10mmol/l～1mol/l，例如，可以为10、50、100、300、500、1000mmol/l，更优选的，为50mmol/l。
96.在一个具体的实施方式中，所述裂解结合液中的所述乙二胺四乙酸缓冲液为1mmol/l～100mmol/l，例如，可以为1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mmol/l。
97.在一个具体的实施方式中，所述裂解结合液中的所述十二烷基硫酸钠缓冲液为0.01％-0.2％(w/v)，例如，可以为0.01、0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18、0.2％(w/v)。
98.在一个具体的实施方式中，所述裂解结合液中的所述吐温20为1％-10％(w/v)，例如，可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10％(w/v)。
99.在一个具体的实施方式中，所述裂解结合液中的所述氯化钠为0.5～1mol/l，例如，可以为0.5、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、1.0mol/l。
100.在一个具体的实施方式中，所述裂解结合液中的所述peg含量为6％-20％(w/v)，例如可以为6％(w/v)、8％(w/v)、10％(w/v)、12％(w/v)、15％(w/v)、16％(w/v)、17％(w/v)、18％(w/v)、19％(w/v)、20％(w/v)。在一个更优选的实施方式中，所述peg为18％(w/v)。
101.在一个具体的实施方式中，所述peg的分子量为6000～8000，例如，可以为6000,6500,7000,7500,8000。在一个优选的实施方式中，所述peg分子量为6000。
102.先用异硫氰酸胍和十二烷基硫酸钠裂解血浆或血清释放cfdna，异硫氰酸胍是强的变性剂，能快速破碎细胞释放核酸，而十二烷基硫酸钠可溶解脂蛋白，解聚核蛋白，有助于核酸的释放并降低异硫氰酸胍用量。peg6000作为结合液，可破坏核酸分子外面水化层使核酸聚集沉淀，并可很大程度上减少磁珠对蛋白质等杂质的吸附，助沉剂polya和糖原有助于提高cfdna沉淀的得率。
103.采用本技术中提供的裂解结合液不需要单独的蛋白酶裂解过程，在cfdna的提取过程中实现裂解和结合同时进行，实验步骤简便，提高了提取效率。
104.本技术的另一方面提供了一种用于提取血液中游离dna试剂盒，其中包括：裂解结合液；无醇清洗液a；无醇清洗液b。
105.在一些具体的实施方式中，所述裂解结合液为本技术上述提供的所述裂解结合液。
106.在一些具体的实施方式中，所述无醇清洗液a中含有异硫氰酸胍、tris-hc1、乙二胺四乙酸缓冲液、吐温20、氯化钠和peg。
107.在一个具体的实施方式中，所述无醇清洗液a中的所述异硫氰酸胍为2mol/l～6mol/l，例如可以为2、3、3.5、4、4.5、5、6mol/l等。
108.在一个具体的实施方式中，所述无醇清洗液a中的所述tris-hc1为10mmol/l～1mol/l，例如，可以为10、50、100、300、500、1000mmol/l。
109.在一个具体的实施方式中，所述无醇清洗液a中的所述乙二胺四乙酸缓冲液为1mmol/l～100mmol/l，例如，可以为1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mmol/l。
110.在一个具体的实施方式中，所述无醇清洗液a中的所述吐温20为1％-20％(w/v)，例如，可以为1、5、10、15、20％(w/v)。
111.在一个具体的实施方式中，所述无醇清洗液a中的所述氯化钠为0.5～1mol/l，例如，可以为0.5、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、1.0mol/l。
112.在一个具体的实施方式中，所述无醇清洗液a中的所述peg为3％-20％(w/v)，例如可以为3、5、8、10、12、14、16、18、20％(w/v)等。
113.在一个优选的实施方式中，所述无醇清洗液a中的所述peg的分子量为6000～8000，例如，可以为6000,6500,7000,7500,8000。在一个优选的实施方式中，所述peg分子量为6000。
114.在一些具体的实施方式中，所述无醇清洗液b中含有tris-hc1、氯化钠和peg。
115.在一个优选的实施方式中，所述tris-hc1为10mmol/l～1mol/l，例如，可以为10、50、100、300、500、1000mmol/l。
116.在一个优选的实施方式中，所述氯化钠为0.5mol/l～1mol/l，例如，可以为0.5、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、1.0mol/l。
117.在一个优选的实施方式中，所述peg为3％-20％(w/v)，例如可以为3、5、8、10、12、14、16、18、20％(w/v)等。
118.在一个优选的实施方式中，所述peg的分子量为6000～8000，例如，可以为6000,6500,7000,7500,8000。在一个优选的实施方式中，所述peg分子量为6000。
119.在一些具体的实施方式中，所述试剂盒中还包括洗脱液和磁珠。
120.在一个优选的实施方式中，所述洗脱液含有0.01mmol/l～10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液，lmmol/l～100mmol/l的trizma base缓冲液。
121.本技术提供的cfdna提取试剂盒中的清洗液a和清洗液b均不含有乙醇，可以有效避免乙醇对下游pcr反应的抑制作用，提升提取纯度及回收率。
122.在一个具体的实施方式中，所述磁珠为硅羟基磁珠。
123.磁珠表面的性质对于核酸提取至关重要。使用硅羟基磁珠提取核酸时，通常需要高浓度的离液盐(nai、naclo4、guhcl、guscn等)。
124.对于磁珠的筛选指标为：能更好的结合血浆样本游离dna，考虑磁珠沉降速度和磁响应速度两个指标。
125.磁珠沉降速度过快减少了磁珠碰撞效率，连续加样过程中增加了操作步骤的繁琐。
126.沉降时间越长，磁珠的悬浮性越好，连续加样的稳定性就越高。
127.磁珠法提取的核心是磁珠吸附核酸的效率，无法保证磁珠碰撞效率和吸附核酸的稳定性是不能保证核酸提取效率的。
128.在一些优选的实施方式中，磁珠的平均粒径为300nm～500nm，例如，可以为300、350、400、450、500nm。
129.在一些优选的实施方式中，磁珠在试剂盒中的浓度为20-50mg/ml，例如，可以为20、25、30、35、40、45、50mg/ml。
130.磁珠的沉降速度较慢，可以有效地结合吸附核酸dna，且磁响应速度快，可提高核酸提取速度。
131.本技术的另一方面提供了一种提取血液中游离dna核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
132.步骤一，取血液样品加入离心管中，并加入裂解结合液和磁珠，混匀后进行磁分离，吸弃上清液；
133.步骤二，向离心管中加入无醇清洗液a，混匀后进行磁分离，吸弃上清液；
134.步骤三，向进行了磁分离之后的样品中加入无醇清洗液b，混匀后再次进行磁分离，吸弃上清液；
135.步骤四，向再次进行磁分离之后样品中加入洗脱液，加热条件下混匀；
136.步骤五，将离心管置于磁力架上进行磁分离，取上清液，完成游离dna的提取。
137.在一个具体的实施方式中，所述裂解结合液包括助沉剂。
138.在一个具体的实施方式中，，所述助沉剂为polya和/或糖原。
139.在一个优选的实施方式中，所述polya为20mmol/l～50mmol/l，和/或，所述糖原为20mg/ml～100mg/ml。
140.在一个具体的实施方式中，所述裂解结合液还包括异硫氰酸胍或盐酸胍、tris-hc1、乙二胺四乙酸缓冲液、十二烷基硫酸钠缓冲液、吐温20、氯化钠和peg。
141.在一个具体的实施方式中，所述异硫氰酸胍或盐酸胍为2mol/l～6mol/l，
142.在一个具体的实施方式中，所述tris-hc1为10mmol/l～1mol/l，
143.在一个具体的实施方式中，所述乙二胺四乙酸缓冲液为1mmol/l～100mmol/l，
144.在一个具体的实施方式中，所述十二烷基硫酸钠缓冲液为0.01％-0.2％(w/v)，
145.在一个具体的实施方式中，所述吐温20为1％-10％(w/v)，
146.在一个具体的实施方式中，所述氯化钠为0.5～1mol/l，
147.在一个具体的实施方式中，所述peg含量为6％-20％(w/v)，进一步优选的，所述peg的分子量为6000～8000。
148.在一个具体的实施方式中，所述无醇清洗液a包括异硫氰酸胍、tris-hc1、乙二胺四乙酸缓冲液、吐温20、氯化钠和peg。
149.在一个具体的实施方式中，所述异硫氰酸胍为2mol/l～6mol/l，
150.在一个具体的实施方式中，所述tris-hc1为10mmol/l～1mol/l，
151.在一个具体的实施方式中，所述乙二胺四乙酸缓冲液为1mmol/l～100mmol/l，
152.在一个具体的实施方式中，所述吐温20为1％-20％(w/v)，
153.在一个具体的实施方式中，所述氯化钠为0.5～1mol/l，
154.在一个具体的实施方式中，所述peg的含量为3％-20％(w/v)，进一步优选的，所述peg的分子量为6000～8000。
155.在一个具体的实施方式中，所述无醇清洗液b包括tris-hc1、氯化钠和peg。
156.在一个具体的实施方式中，所述tris-hc1为10mmol/l～1mol/l，
157.在一个具体的实施方式中，所述氯化钠为0.5mol/l～1mol/l，
158.在一个具体的实施方式中，所述peg为3％-20％(w/v)，进一步优选的，所述peg的分子量为6000～8000。
159.在一个具体的实施方式中，所述洗脱液含有0.01mmol/l～10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液和lmmol/l～100mmol/l的trizma base缓冲液。
160.在一个具体的实施方式中，所述磁珠选自硅羟基磁珠。
161.在一些优选的实施方式中，磁珠的平均粒径为300nm～500nm。
162.在一些优选的实施方式中，磁珠在试剂盒中的浓度为20-50mg/ml。。
163.在本技术一些具体的实施方式中，所述提取方式是采用本技术中所提供的试剂盒
进行游离dna的提取。
164.在一个具体的实施方式中，所述提取血液中游离dna核酸的方法包括如下步骤：
165.(1)在15ml离心管加入1ml血浆样品，1ml裂解结合液，30μl磁珠，颠倒混匀数次，震荡混匀结合20-40分钟；
166.(2)将15ml离心管置于磁力架上，磁分离，吸弃废液；
167.(3)将离心管磁力架上取下，加入500μl清洗液a，震荡混匀，将清洗液和磁珠转移至2ml离心管，置于磁力架上，磁分离，吸弃废液：
168.(4)将离心管从磁力架上取下，加入500μl清洗液b，震荡混匀，将离心管置于磁力架上，磁分离，吸弃废液；
169.(5)将离心管从磁力架上取下，加入250μl清洗液b，震荡混匀，将离心管置于磁力架上，磁分离，吸弃废液：
170.(6)将离心管从磁力架上取下，室温下开盖静置晾干，加入30-60μl洗脱液，置于恒温震荡仪中，55-80℃水浴5-10min；
171.(7)将离心管置于磁力架上，磁分离，小心吸取上清至新的离心管中，获得cfdna提取样品，进行下游实验或-20℃保存备用；
172.其中，所述裂解结合液为：5mol/l的异硫氰酸胍、20mmol/l的polya、20mg/ml的糖原、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、0.1％(w/v)的十二烷基硫酸钠缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、18％(w/v)的分子量为6000的peg；
173.所述磁珠为：0.05％(w/v)，平均粒径为300nm。
174.所述清洗液a为：3.5mol/l的异硫氰酸胍、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、10％(w/v)的分子量为6000的peg；
175.所述清洗液b为：50mmol/l的tris-hc1、0.5mol/l的氯化钠和10％(w/v)的分子量为6000的peg；
176.所述洗脱液为：0.1mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液，l0mmol/l的trizma base缓冲液。
177.本技术的技术方案中，提供了用于血液游离dna提取的裂解结合液和包含所述裂解结合液的试剂盒。采用所述裂解结合液无需进行单独的蛋白酶裂解；同时对裂解结合液中的助沉剂进行了优化筛选，选取线性丙烯酰胺、carrier rna、polya和糖元四种助沉剂，其中丙烯酰胺和carrier rna均未能提高cfdna的回收率，而polya、糖元或其组合可有效提高cfdna的回收率。对磁珠的粒径范围进行优化筛选，选择使用沉降速度较慢且磁响应速度快的粒径范围在300～500nm的硅羟基磁珠进行cfdna提取，其回收率更高。进一步确定了peg的选择浓度及分子量，采用加入2％-20％的peg(分子量6000和8000)溶液和0.5m-1m nacl溶液可以得到更高的cfdna回收率。本试剂盒用无醇去蛋白液和洗涤液去除蛋白质、盐离子等杂质，可得到高质量的cfdna。
178.实施例
179.本技术对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。在本技术的说明书及下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％(w/v)表示质量体积百分浓度，即100毫升溶液中含有溶质的克数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过
市购获得的常规试剂产品。
180.实施例1对血浆样本游离dna的无醇提取
181.1.分别配置如下配方的试剂样品。
182.(1)实施例1.1
183.裂解结合液：5mol/l的异硫氰酸胍、20mmol/l的polya、20mg/ml的糖原、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、0.1％(w/v)的十二烷基硫酸钠缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、18％(w/v)的分子量为6000的peg；
184.清洗液a：3.5mol/l的异硫氰酸胍、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、10％(w/v)的分子量为6000的peg；
185.清洗液b：50mmol/l的tris-hc1、0.5mol/l的氯化钠和10％(w/v)的分子量为6000的peg；
186.洗脱液：0.1mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液，l0mmol/l的trizma base缓冲液；
187.磁珠：0.05％(w/v)，平均粒径为300nm。
188.(2)实施例1.2
189.裂解结合液：5mol/l的异硫氰酸胍、50mmol/l的polya、100mg/ml的糖原、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、0.1％(w/v)的十二烷基硫酸钠缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、12％(w/v)的分子量为6000的peg；
190.清洗液a：3.5mol/l的异硫氰酸胍、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、6％(w/v)的分子量为6000的peg；
191.清洗液b：50mmol/l的tris-hc1、0.5mol/l的氯化钠和6％(w/v)的分子量为6000的peg；
192.洗脱液：0.1mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液，l0mmol/l的trizma base缓冲液；
193.磁珠：0.05％(w/v)，平均粒径为300nm。
194.(3)实施例1.3
195.裂解结合液：2mol/l的异硫氰酸胍、20mmol/l的polya、20mg/ml的糖原、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、0.1％(w/v)的十二烷基硫酸钠缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、18％(w/v)的分子量为6000的peg；
196.清洗液a：3.5mol/l的异硫氰酸胍、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、10％(w/v)的分子量为6000的peg；
197.清洗液b：50mmol/l的tris-hc1、0.5mol/l的氯化钠和10％(w/v)的分子量为6000的peg；
198.洗脱液：0.1mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液，l0mmol/l的trizma base缓冲液；
199.磁珠：0.05％(w/v)，平均粒径为500nm。
200.(4)实施例1.4
201.裂解结合液：6mol/l的异硫氰酸胍、50mmol/l的polya、20mg/ml的糖原、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、0.1％(w/v)的十二烷基硫酸钠缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、6％(w/v)的分子量为8000的peg；
202.清洗液a：3.5mol/l的异硫氰酸胍、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、3％(w/v)的分子量为8000的peg；
203.清洗液b：50mmol/l的tris-hc1、0.5mol/l的氯化钠和3％(w/v)的分子量为8000的peg；
204.洗脱液：0.1mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液，l0mmol/l的trizma base缓冲液；
205.磁珠：0.05％(w/v)，平均粒径为300nm。
206.(5)对比例1.5：
207.裂解结合液：5mol/l的异硫氰酸胍、3μg/μl的线性丙烯酰胺、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、0.1％(w/v)的十二烷基硫酸钠缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、12％(w/v)的分子量为6000的peg；
208.清洗液a：3.5mol/l的异硫氰酸胍、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、6％(w/v)的分子量为6000的peg；
209.清洗液b：50mmol/l的tris-hc1、0.5mol/l的氯化钠和6％(w/v)的分子量为6000的peg；
210.洗脱液：0.1mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液，l0mmol/l的trizma base缓冲液；
211.磁珠：0.05％(w/v)，平均粒径为300nm。
212.(6)对比例1.6：
213.裂解结合液：5mol/l的异硫氰酸胍、6μg/μl的线性丙烯酰胺、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、0.1％(w/v)的十二烷基硫酸钠缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、12％(w/v)的分子量为6000的peg；
214.清洗液a：3.5mol/l的异硫氰酸胍、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、6％(w/v)的分子量为6000的peg；
215.清洗液b：50mmol/l的tris-hc1、0.5mol/l的氯化钠和6％(w/v)的分子量为6000的peg；
216.洗脱液：0.1mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液，l0mmol/l的trizma base缓冲液；
217.磁珠：0.05％(w/v)，平均粒径为300nm。
218.(7)对比例1.7：
219.裂解结合液：5mol/l的异硫氰酸胍、3μg/μl的carrier rna、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、0.1％(w/v)的十二烷基硫酸钠缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、12％(w/v)的分子量为6000的peg；
220.清洗液a：3.5mol/l的异硫氰酸胍、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、6％(w/v)的分子量为6000的peg；
221.清洗液b：50mmol/l的tris-hc1、0.5mol/l的氯化钠和6％(w/v)的分子量为6000的peg；
222.洗脱液：0.1mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液，l0mmol/l的trizma base缓冲液；
223.磁珠：0.05％(w/v)，平均粒径为300nm。
224.(8)对比例1.8：
225.裂解结合液：5mol/l的异硫氰酸胍、6μg/μl的carrier rna、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、0.1％(w/v)的十二烷基硫酸钠缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、12％(w/v)的分子量为6000的peg；
226.清洗液a：3.5mol/l的异硫氰酸胍、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙
酸缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、6％(w/v)的分子量为6000的peg；
227.清洗液b：50mmol/l的tris-hc1、0.5mol/l的氯化钠和6％(w/v)的分子量为6000的peg；
228.洗脱液：0.1mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液，l0mmol/l的trizma base缓冲液；
229.磁珠：0.05％(w/v)，平均粒径为300nm。
230.(9)对比例1.9：
231.裂解结合液：2mol/l的异硫氰酸胍、20mmol/l的polya、20mg/ml的糖原、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、0.1％(w/v)的十二烷基硫酸钠缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、18％(w/v)的分子量为6000的peg；
232.清洗液a：3.5mol/l的异硫氰酸胍、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、10％(w/v)的分子量为6000的peg；
233.清洗液b：50mmol/l的tris-hc1、0.5mol/l的氯化钠和10％(w/v)的分子量为6000的peg；
234.洗脱液：0.1mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液，l0mmol/l的trizma base缓冲液；
235.磁珠：0.05％(w/v)，平均粒径为100nm。
236.(10)对比例1.10：
237.裂解结合液：2mol/l的异硫氰酸胍、20mmol/l的polya、20mg/ml的糖原、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、0.1％(w/v)的十二烷基硫酸钠缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、18％(w/v)的分子量为6000的peg；
238.清洗液a：3.5mol/l的异硫氰酸胍、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、10％(w/v)的分子量为6000的peg；
239.清洗液b：50mmol/l的tris-hc1、0.5mol/l的氯化钠和10％(w/v)的分子量为6000的peg；
240.洗脱液：0.1mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液，l0mmol/l的trizma base缓冲液；
241.磁珠：0.05％(w/v)，平均粒径为1μm。
242.(11)对比例1.11：
243.裂解结合液：5mol/l的异硫氰酸胍、20mmol/l的polya、20mg/ml的糖原、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、0.1％(w/v)的十二烷基硫酸钠缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、2％(w/v)的分子量为6000的peg；
244.清洗液a：3.5mol/l的异硫氰酸胍、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、10％(w/v)的分子量为6000的peg；
245.清洗液b：50mmol/l的tris-hc1、0.5mol/l的氯化钠和10％(w/v)的分子量为6000的peg；
246.洗脱液：0.1mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液，l0mmol/l的trizma base缓冲液；
247.磁珠：0.05％(w/v)，平均粒径为300nm。
248.(12)对比例1.12：
249.裂解结合液：5mol/l的异硫氰酸胍、20mmol/l的polya、20mg/ml的糖原、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、0.1％(w/v)的十二烷基硫酸钠缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、18％(w/v)的分子量为4000的peg；
250.清洗液a：3.5mol/l的异硫氰酸胍、50mmol/l的tris-hc1、10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液、1％(w/v)的吐温20、0.5mol/l的氯化钠、10％(w/v)的分子量为6000的peg；
251.清洗液b：50mmol/l的tris-hc1、0.5mol/l的氯化钠和10％(w/v)的分子量为6000的peg；
252.洗脱液：0.1mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液，l0mmol/l的trizma base缓冲液；
253.磁珠：0.05％(w/v)，平均粒径为300nm。
254.2.以上述实施例和对比例的试剂样品分别进行血浆样本中游离dna的提取，得到相应的cfdna提取样品。实验方法如下：
255.(1)在15ml离心管加入1ml血浆样品，1ml裂解结合液，30μl磁珠，颠倒混匀数次，震荡混匀结合20-40分钟；
256.(2)将15ml离心管置于磁力架上，磁分离，吸弃废液；
257.(3)将离心管磁力架上取下，加入500μl清洗液a，震荡混匀，将清洗液和磁珠转移至2ml离心管，置于磁力架上，磁分离，吸弃废液：
258.(4)将离心管从磁力架上取下，加入500μl清洗液b，震荡混匀，将离心管置于磁力架上，磁分离，吸弃废液；
259.(5)将离心管从磁力架上取下，加入250μl清洗液b，震荡混匀，将离心管置于磁力架上，磁分离，吸弃废液：
260.(6)将离心管从磁力架上取下，室温下开盖静置晾干，加入30-60μl洗脱液，置于恒温震荡仪中，55-80℃水浴5-10min；
261.(7)将离心管置于磁力架上，磁分离，小心吸取上清至新的离心管中，获得cfdna提取样品，进行下游实验或-20℃保存备用。
262.另外，以apostle minimaxtmhigh efficiency cfdna isolation kit磁珠法有醇提取试剂盒(货号a17622-250)作为参比例样品进行cfdna提取，提取方法如其说明书所示。
263.[0264][0265]
实施例2q-seq1毛细管电泳测定dna片段分布及提取回收率
[0266]
分别取2μl实施例1.1和参比例提取的游离dna样品做为模板，使用杭州厚泽生物
科技有限公司q-seq1毛细管电泳仪，进行dna片段分布测定和基因组dna残留测定。测定结果如图1和图2所示。
[0267]
图1中q-seq1毛细管电泳结果表明本技术无醇提取得到的为cfdna，且无基因组残留。
[0268]
图2中的对比结果表明，本技术实施例1.1无醇提取cfdna与参比例有醇试剂盒提取的回收率相比较，实施例1.1提取得到的cfdna略高于参比例的有醇试剂盒提取得到的cfdna。
[0269]
图3a、3b(局部放大图)中结合实施例1.2和对比例1.5、1.6、1.7、1.8的实验结果表明，polya多聚腺苷酸和糖原作为助沉剂，cfdna的回收率优于线性丙烯酰胺和carrier rna。
[0270]
图4中结合实施例1.3和对比例1.9、1.10的实验结果表明，磁珠选择粒径为300nm-500nm的硅羟基磁珠，回收率更高。
[0271]
实施例3提取回收率pcr检测
[0272]
分别取10μl实施例1中提取的游离dna样品做为模板进行q-pcr实验，进行血浆中actb基因检测。ntc：阴性对照，以水为模板，用于确认是否产生引物二聚体和体系中是否有模板污染。每个样本设置3个技术性重复，取平均ct值。采用如表2所示pcr扩增体系。
[0273]
表2
[0274][0275][0276]
pcr扩增程序为：95℃，3min；(93℃，30s；59.7℃，30s；—读取荧光信号)40个循环；40℃，5s。阈值设定240。
[0277]
actb的引物和探针：
[0278]
actb_f：5
’‑
agatttggacctgcgagcg-3’[0279]
actb_r：5
’‑
gagcggctgtctccacaagt-3’[0280]
actb_p：5
’‑
ttctgacctgaaggctctgcgcg-3’[0281]
其中，actb_f的核苷酸序列(5
’‑3’
)如seq id no:1
[0282]
(agatttggacctgcgagcg)所示；actb_r的核苷酸序列(5
’‑3’
)如seq id no:2(gagcggctgtctccacaagt)；actb_p的核苷酸序列(5
’‑3’
)如seq id no:3(ttctgacctgaaggctctgcgcg)所示；
[0283]
产物大小为65bp。
[0284]
血浆游离dna的actb基因的pcr检测结果及平均ct值结果如图5-8及表3所示：
[0285]
表3
[0286][0287][0288]
上述实验结果显示，以实施例1.1的试剂样品进行actb基因无醇提取的游离dna，平均ct值为31.35，参比试剂盒有醇提取的游离dna的平均ct值为33.44。本技术的无醇提取方法比有醇提取提高约2个ct值，提取回收率高于参比有醇提取结果。
[0289]
以上所述，仅是本技术的较佳实施例而已，并非是对本技术作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本技术技术方案内容，依据本技术的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本技术技术方案的保护范围。

技术特征：
1.一种用于血液游离dna的裂解结合液，其包括助沉剂，所述助沉剂为polya和/或糖原，优选在所述裂解结合液中所述polya的浓度为20mmol/l～50mmol/l，和/或，在所述裂解结合液中所述糖原的浓度为20mg/ml～100mg/ml。2.根据权利要求1所述的裂解结合液，其还包括异硫氰酸胍或盐酸胍、tris-hc1、乙二胺四乙酸缓冲液、十二烷基硫酸钠缓冲液、吐温20、氯化钠和peg，优选的，在所述裂解结合液中所述异硫氰酸胍或盐酸胍的浓度为2mol/l～6mol/l，优选为5mol/l，在所述裂解结合液中所述tris-hc1的浓度为10mmol/l～1mol/l，在所述裂解结合液中所述乙二胺四乙酸缓冲液的浓度为1mmol/l～100mmol/l，在所述裂解结合液中所述十二烷基硫酸钠缓冲液的浓度为0.01％-0.2％(w/v)，在所述裂解结合液中所述吐温20的浓度为1％-10％(w/v)，在所述裂解结合液中所述氯化钠的浓度为0.5～1mol/l，在所述裂解结合液中所述peg的浓度为6％-20％(w/v)，优选为18％(w/v)。3.一种血液游离dna提取试剂盒，包括：裂解结合液；无醇清洗液a；无醇清洗液b；其中，所述裂解结合液为权利要求1或2所述的裂解结合液。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述无醇清洗液a包括异硫氰酸胍、tris-hc1、乙二胺四乙酸缓冲液、吐温20、氯化钠和peg，优选的，在所述无醇清洗液a所述异硫氰酸胍的浓度为2mol/l～6mol/l，优选为3.5mol/l，在所述无醇清洗液a中所述tris-hc1的浓度为10mmol/l～1mol/l，在所述无醇清洗液a中所述乙二胺四乙酸缓冲液的浓度为1mmol/l～100mmol/l，在所述无醇清洗液a中所述吐温20的浓度为1％-20％(w/v)，在所述无醇清洗液a中所述氯化钠的浓度为0.5～1mol/l，在所述无醇清洗液a中所述peg的浓度为3％-20％(w/v)，优选为10％(w/v)。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述无醇清洗液b包括tris-hc1、氯化钠和peg，优选的，在所述无醇清洗液b中所述tris-hc1的浓度为10mmol/l～1mol/l，在所述无醇清洗液b中所述氯化钠的浓度为0.5mol/l～1mol/l，在所述无醇清洗液b中所述peg的浓度为3％-20％(w/v)，优选为10％(w/v)。6.根据权利要求3所述的试剂盒，其中还包括洗脱液和磁珠。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述洗脱液含有0.01mmol/l～10mmol/l的乙二胺四乙酸缓冲液，lmmol/l～100mmol/l的trizma base缓冲液。8.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述磁珠选自硅羟基磁珠，平均粒径为300nm～500nm，浓度为20-50mg/ml。9.根据权利要求2所述的裂解结合液或权利要求3～5任一项所述的试剂盒，其中，所述
裂解结合液中的peg的分子量为6000-8000，优选为6000。10.一种提取血液中游离dna的方法，其中包括如下步骤：取血液样品加入离心管中，并加入裂解结合液和磁珠，混匀后进行磁分离，吸弃上清液；向离心管中加入无醇清洗液a，混匀后进行磁分离，吸弃上清液；向进行了磁分离之后的样品中加入无醇清洗液b，混匀后再次进行磁分离，吸弃上清液；向再次进行磁分离之后样品中加入洗脱液，加热条件下混匀；将离心管置于磁力架上进行磁分离，取上清液，完成游离dna的提取。

技术总结
本申请提供了一种用于血液游离DNA的裂解结合液，其包括助沉剂，所述助沉剂为polyA和/或糖原，优选在所述裂解结合液中所述polyA的浓度为20mmol/L～50mmol/L，和/或，在所述裂解结合液中所述糖原的浓度为20mg/mL～100mg/mL。本申请还提供了一种血液游离DNA提取试剂盒，包括：裂解结合液；无醇清洗液A；无醇清洗液B。B。


技术研发人员：陈丽娟 汪亚林
受保护的技术使用者：博尔诚（北京）科技有限公司
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/8/24