可重塑神经膜电特性的高导电纳米复合材料及其制备方法

1.本发明属于纳米生物医药技术领域，具体涉及可重塑神经元膜电特性的高导电纳米复合材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.神经系统是机体内调节生理功能活动起主导作用的系统，主要由神经组织构成。神经元作为神经组织的关键组分，其扮演着不可替代的角色，如感受刺激、传递兴奋、整合信息等。神经元异常活动时，机体的生理功能将发生紊乱，严重影响人体正常的生理及心理行为，临床上将此诊断为神经性疾病。阐明神经系统疾病发生和发展的生物学机制，探索神经系统疾病精准治疗新策略，研发疾病治疗新药物，一直是神经科学、材料化学及药学等多个领域研究者们关注的热点和重点。
3.随着对神经疾病探究的不断深入，越来越多的研究发现神经兴奋性中毒是一类由神经元异常兴奋引起并与神经疾病发生、发展密切相关的现象。通常，神经兴奋性中毒是指兴奋性神经递质受体，如谷氨酸受体，因持续过度激活而引发细胞内钙紊乱，神经元最终因氧化还原稳态失衡而走向死亡。自上世纪50年代神经兴奋性中毒现象被发现以来，关于谷氨酸释放、转运体功能改变、受体表达及其引发的下游细胞死亡信号通路等已成为此类疾病治疗研究的关键靶点。脊髓损伤(spinal cord injury，sci)作为神经兴奋性中毒的典型疾病，其病理过程包括由机械外力导致的直接性组织损伤(即原发性损伤)和组织病变所导致的继发性损伤(如活性氧累积、神经元兴奋性中毒等)，发生率居高不下，不仅对患者造成巨大的身心损伤，且对社会和家庭带来极大的经济和精神负担。因此，针对于神经损伤后的高效治疗研究具有重大意义。
4.然而，现有小分子治疗药物包括甘露醇、维生素等，其功能主要集中在自由基的清除，通过改善损伤区病理微环境以达到减缓损伤部位炎性反应、保护并修复受损神经的目的。但小分子药物普遍存在着功能单一、作用时间短、易耐受成瘾等问题。纳米医药的发展开创了利用材料自身物理特性(如：光电、光热、磁热、磁电等)或化学特性(如：催化、缓释药物、微环境响应等)调节组织微环境及神经生理特性(如：膜电位、电容、电阻、代谢等)的研究。针对神经疾病复杂的病理状态，发展功能集成化的纳米材料，调节神经可塑性以保护并修复受损神经，有望解决现有手段治疗神经疾病存在着的诸多瓶颈问题，为神经系统疾病治疗开辟新途径。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种可重塑神经膜电特性、用以精准调节神经生理功能的高导电纳米复合材料及其制备方法，用于解决目前神经疾病治疗用小分子药物存在的功能单一、作用时间短、易耐受成瘾等问题。
6.本发明提供的高导电纳米复合材料，可通过化学反应紧密贴附于神经元表面，从而改变神经膜电场分布以重塑神经膜电特性，进而影响神经电活动行为，实现对神经兴奋
性疾病的高效治疗，解决了小分子药物治疗该类疾病存在的诸多瓶颈问题。
7.具体地，本发明提供的高导电纳米复合材料，由具有超高电导率的金属纳米颗粒为内核，以具有细胞膜强贴附作用的有机材料为外壳层组成；其中：
8.所述金属纳米内核由贵金属材料金构成；所述有机外壳层由含酚羟基的有机分子或其聚合物构成。
9.所述贵金属选自金、银、铂；所述有机材料选自：多巴胺、绿原酸、没食子酸、及其聚合物。
10.所述纳米金属内核的形状和尺寸等参数均为特殊设计，即控制其为一定长径比的棒状结构，例如长径比为8-12：1，优选长径比为10：1。
11.本发明中，所述有机外壳层优选由含酚羟基的多巴胺分子或其聚合物。
12.本发明的高导电纳米复合材料，优选为聚多巴胺(pda)包裹金(au)纳米棒形成的复合材料，记为au@pda。
13.所述金属内核的制备方式为晶种法。
14.本发明还提供上述高导电纳米复合材料的制备方法，使用comsol模拟软件设计金纳米内核及聚多巴胺纳米外壳的尺寸和厚度，优化材料参数以实现对神经元膜电特性的精准调节；利用晶种法制备金纳米棒，然后加入三羟甲基氨基甲烷调节溶液ph，利用多巴胺在碱性溶液中的聚合反应，在金纳米棒表面原位包覆聚多巴胺层；具体步骤如下：
15.(1)金纳米种子的合成：将1.0-5.0ml氯金酸溶液和1-5ml十六烷基三甲基溴化铵溶液混合均匀；随后，在剧烈搅拌下加入预冷的0.5-2.0ml硼氢化钠至上述溶液中；剧烈搅拌后，溶液由黄色变为棕黄色，反应停止；在室温下陈化。
16.(2)金纳米棒的合成：将2.0-10.0g十六烷基三甲基溴化铵和0.5-1.5g油酸钠溶于水中，加热，保持15-30min，制备生长液；溶液冷却，加入10-30ml硝酸银溶液，静置，然后依次加入下列试剂：100-300ml氯金酸溶液，搅拌至溶液无色，1-5ml浓盐酸，搅拌10-20min；1-5ml抗坏血酸溶液，搅拌0.5-1min；步骤(1)得到的金纳米种子，搅拌后静置过夜。
17.(3)金纳米棒表面包覆聚多巴胺：向金纳米棒溶液中加入三羟甲基氨基甲烷调节溶液ph为8-9，加入多巴胺溶液，超声后离心，即得到au@pda纳米颗粒。
18.本发明还提供上述高导电纳米复合材料在制备生物电调节神经兴奋性疾病的药物中的用途。
19.优选地，所述高导电纳米复合材料，是聚多巴胺(pda)包裹金(au)纳米棒形成的复合材料，记为au@pda。
20.pda表面具有丰富的羟基和亚胺基等还原性基团，能够清除多种活性氧自由基；更为重要的是，酚羟基被氧化生成醌基，更利于材料与神经元膜表面氨基发生席夫碱反应，提高材料在神经元表面的贴附能力。高导电率的金纳米棒置于神经膜电场后，即与神经膜间构建起一感生电场，其场强与二者间距离密切相关。感生电场的存在改变了神经膜电场分布，进而抑制神经元动作电位的产生，最终高效阻止受损神经因兴奋性中毒而发生死亡。具体来讲，由于神经元的电学特性受细胞膜内外离子浓度调控，其静息膜电势是由于膜内外离子梯度化分布而产生的浓差电势，动作电位的发生和传递也是通过局域电场驱动下的离子运动而实现的。所以，当高电导率的au@pda紧密贴附于神经元外表面之后，au@pda可将驱动离子交互运动的部分电能导出，降低局域电场对离子运动的驱动力，使得神经动作电位
的发生和传导变得愈发困难，由此降低神经兴奋性中毒死亡发生的概率。相应地，本发明提出au@pda作为生物电调节神经疾病物理疗法的药物，可在有效清除自由基的同时，长效持久地重塑神经膜电特性，以降低神经兴奋性中毒死亡的发生概率，解决了现有小分子药物存在的诸多瓶颈问题，为神经性疾病治疗研究提供的新思想和新策略。
附图说明
21.图1为实施例1制得au@pda纳米颗粒的透射电镜(tem)照片。
22.图2为实施例1制得的au、pda和au@pda纳米颗粒的红外光谱图。
23.图3为实施例1制得的au@pda纳米颗粒清除自由基的水溶液层面效果图。
24.图4为实施例1制得的au@pda纳米颗粒与背根神经节(drg)共定位结果图。
25.图5为实施例1制得的au@pda纳米颗粒不同处理下的drg神经元荧光图像。
26.图6为实施例1制得的au@pda纳米颗粒不同处理下drg神经元对于电刺激的响应。
27.图7为实施例1制得的au@pda纳米颗粒治疗脊髓损伤的大鼠的basso-beattie-bresnahan(bbb)评分。
28.图8为实施例1制得的au@pda纳米颗粒治疗脊髓损伤的大鼠的足迹实验。
29.图9为实施例1制得的au@pda纳米颗粒治疗脊髓损伤的大鼠的苏木精和曙红染色(h&e)切片。
30.图10为au@pda产生感应电场抑制神经兴奋性中毒示意图。
具体实施方式
31.下面通过具体实施例结合附图进一步介绍本发明。
32.实施例1，au@pda的制备、测试和评价。
33.(一)au@pda的制备
34.使用comsol模拟软件设计金纳米内核及聚多巴胺纳米外壳的尺寸和厚度，优化材料参数以实现对神经元膜电特性的精准调节；利用晶种法制备金纳米棒，然后加入三羟甲基氨基甲烷调节溶液ph，利用多巴胺在碱性溶液中的聚合反应，在金纳米棒表面原位包覆聚多巴胺层；具体步骤如下：
35.(1)金纳米种子的合成：将5ml氯金酸溶液和5ml十六烷基三甲基溴化铵溶液混合均匀；随后，在剧烈搅拌下加入预冷的1ml硼氢化钠至上述溶液中；剧烈搅拌2min后，溶液由黄色变为棕黄色，反应停止；在室温下陈化30min。
36.(2)金纳米棒的合成：将7.0g十六烷基三甲基溴化铵和1.234g油酸钠溶于水中，加热至50℃，保持30min，制备生长液；溶液冷却至30℃，加入24ml硝酸银溶液，在30℃静置保持15min，然后依次加入下列试剂：250ml氯金酸溶液，搅拌90min至溶液无色，3ml浓盐酸，搅拌15min；1ml抗坏血酸溶液，搅拌30s；0.4ml步骤(1)得到的金纳米种子，搅拌30s后静置12h。
37.(3)金纳米棒表面包覆聚多巴胺：向金纳米棒溶液中加入三羟甲基氨基甲烷调节溶液ph为8-9，加入多巴胺溶液，超声1h后，离心3次，即得到au@pda纳米颗粒。
38.图1为实施例1制得au@pda纳米颗粒的tem照片，由图可见：所制得的纳米材料长径比均一，分散性良好。
39.图2为实施例1制得的au、pda和au@pda纳米颗粒的红外光谱图，由图可见：pda成功包覆于au纳米棒表面。
40.(二)对制备的纳米复合材料au@pda进行自由基清除测试
41.(1)总自由基清除测试
42.7mm 2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(abts)原液与2.45mm过硫酸钾在黑暗中反应16h生成abts自由基。用pbs将abts自由基溶液稀释在734nm处达到合适的吸光值后。将不同浓度的材料与2ml含有abts自由基溶液在暗处反应10min，记录734nm处吸光值，计算自由基清除率。
43.(2)清除超氧阴离子
44.将材料与黄嘌呤(0.6mm)与黄嘌呤氧化酶(0.05u/ml)混合分散在缓冲液(ph＝7.52)中5min，加入氯化硝基四氮唑蓝(100μg/ml)混合均匀，记录550nm处吸光值，计算超氧阴离子清除率。
45.(3)清除
·
oh
46.将材料与过氧化氢(200μl)，硫酸亚铁(150μl)与自由基捕获剂(5μl)混匀，利用esr测试材料对于
·
oh的清除效果。
47.图3为实施例1制得的au@pda纳米颗粒清除自由基的水溶液层面效果图；
48.au@pda纳米复合材料用于脊髓损伤治疗。
49.(1)au@pda纳米颗粒与drg神经元共定位
50.提取sd大鼠原代背根神经节神经元，接种于共聚焦皿中，培养4-5天后，吸走培养液，用pbs洗涤细胞两次，加入1ml均匀分散在细胞培养液中的罗丹明标记的au@pda纳米材料，与细胞共孵育12h后，用pbs洗涤细胞两次，用钙黄绿素染色细胞，在激光共聚焦下观察细胞荧光。
51.图4为实施例1制得的au@pda纳米颗粒与drg神经元共定位结果图，由图可见：图中红色荧光代表罗丹明标记的au@pda纳米材料，绿色荧光代表神经元，共定位结果表明材料贴附在神经元表面。
52.提取sd大鼠drg神经元，将神经元接种于共聚焦皿中，培养4-5天后，吸走培养液，用pbs洗涤细胞两次，将细胞分为3组，分别为：未处理组作为阴性对照组；加入1ml含有rosup的细胞培养液，孵育半小时后，一组作为阳性对照组；一组加入au@pda，再孵育半小时后，利用活性氧检测探针dcfh-da进行染色。
53.图5为实施例1制得的au@pda纳米颗粒不同处理下的drg神经元荧光图像，由图可见：au@pda可以有效降低rosup导致的drg神经元氧化应激水平。
54.提取sd大鼠drg神经元，将神经元接种于共聚焦皿中，培养4-5天后，吸走培养液，pbs洗涤细胞两次，利用膜片钳记录au@pda对于神经元动作电位发放的影响。
55.图6为实施例1不同处理下drg神经元对于电刺激的响应，由图可见：制得的au@pda纳米颗粒降低了drg神经元的静息膜电位，且降低了其对于电刺激的响应。
56.(三)au@pda对于脊髓损伤的sd大鼠的治疗作用评价
57.随机选取sd大鼠15只，将其分为3组，每组各5只，分别为假手术组、模型组及au@pda组。动物经戊巴比妥钠麻醉后，固定于脑定位仪，于脊椎胸腰段手术区消毒，分离肌肉及咬除椎板后，使硬脊膜暴露并保持完整，确定t10硬脊膜表面以正中血管为中心的位置，移
动直径3mm颅脑损伤撞击器撞击头至其正上方，设定参数如下：打击深度1.0mm、撞击速度2.0m
·
s-1
和滞留时间200ms，撞击后造成脊椎t10脊髓挫伤，假手术组按照如上操作，但不进行撞击。au@pda组即造模完成后，原位滴加au@pda(10mg/ml，5μl)。
58.为了评估au@pda的治疗效果，首先采用bbb评分方法评价了三组大鼠的运动功能恢复程度。图7为实施例1制得的au@pda纳米颗粒治疗脊髓损伤的大鼠的bbb评分。由图可见：模型组和材料组两组动物在造模后表现为后肢完全瘫痪(bbb评分＝0)。术后两组大鼠的运动功能bbb评分均随时间的延长而增加，相对于模型组，材料组的bbb评分在相同时间点均有显著增加。
59.此外，使用足迹分析测试大鼠运动功能的恢复，图8为实施例1制得的au@pda纳米颗粒治疗脊髓损伤的大鼠的足迹实验。由图可见：足迹照片显示，假手术组大鼠具有良好的协调性，后肢与前肢的脚印几乎相互重叠。脊髓损伤组大鼠后肢与前肢的脚印不重叠，后肢没有支撑体重的能力，因此有明显的拖曳痕迹，表现出较差的运动功能。与模型组相比，材料组大鼠足迹可以有负重且更加伸展，表明材料组大鼠前后肢之间的协调性有所增强，运动功能有所恢复。
60.为了进一步分析脊髓损伤的大鼠的恢复情况，收集包含病变部位的脊髓阶段，进行h&e染色，图9为实施例1制得的au@pda纳米颗粒治疗脊髓损伤的大鼠的h&e切片；由图可见：au@pda治疗组脊髓空腔面积明显小于脊髓损伤组，表明au@pda在脊髓损伤修复中具备良好的效果。

技术特征：
1.一种高导电纳米复合材料，其特征在于，可通过化学反应紧密贴附于神经元表面，从而改变神经膜电场分布以重塑神经膜电特性，进而影响神经电活动行为，实现对神经兴奋性疾病的高效治疗；具体地，所述高导电纳米复合材料，由具有超高电导率的贵金属纳米颗粒为内核，以具有细胞膜强贴附作用的多酚材料为外壳层组成；其中：所述金属纳米内核由贵金属材料构成；所述有机外壳层由含酚羟基的有机分子或其聚合物构成。2.根据权利要求1所述的高导电纳米复合材料，其特征在于，所述贵金属选自金、银、铂等；所述有机材料选自：多巴胺、绿原酸、没食子酸、及其聚合物。3.根据权利要求2所述的高导电纳米复合材料，其特征在于，所述纳米金属内核为具有可设计长径比的棒状结构。4.根据权利要求3所述的高导电纳米复合材料，其特征在于，由聚多巴胺(pda)包裹金(au)纳米棒形成，记为au@pda。5.一种如权利要求4所述的高导电纳米复合材料的制备方法，其特征在于，使用comsol模拟软件设计金纳米内核及聚多巴胺纳米外壳的尺寸和厚度，优化材料参数以实现对神经元膜电特性的精准调节；利用晶种法制备金纳米棒，然后加入三羟甲基氨基甲烷调节溶液ph，利用多巴胺在碱性溶液中的聚合反应，在金纳米棒表面原位包覆聚多巴胺层；具体步骤如下：(1)金纳米种子的合成：将1-5ml氯金酸溶液和1-5ml十六烷基三甲基溴化铵溶液混合均匀；随后，在剧烈搅拌下加入预冷的0.5-2ml硼氢化钠至上述溶液中；剧烈搅拌后，溶液由黄色变为棕黄色，反应停止；在室温下陈化；(2)金纳米棒的合成：将2.0-10.0g十六烷基三甲基溴化铵和0.5-1.5g油酸钠溶于水中，加热，保持15-30min，制备生长液；溶液冷却，加入10-30ml硝酸银溶液，静置，然后依次加入下列试剂：100-300ml氯金酸溶液，搅拌至溶液无色，1-5ml浓盐酸，搅拌10-20min；1-5ml抗坏血酸溶液，搅拌0.5-1min；步骤(1)得到的金纳米种子，搅拌后静置过夜；(3)金纳米棒表面包覆聚多巴胺：向金纳米棒溶液中加入三羟甲基氨基甲烷调节溶液ph为8-9，加入多巴胺溶液，超声后离心，即得到au@pda纳米颗粒。6.如权利要求1-4之一所述的高导电纳米复合材料制备生物电调节神经兴奋性疾病的药物中的用途。

技术总结
本发明属于纳米生物医药技术领域，具体为一种可重塑神经膜电特性的高导电纳米复合材料及其制备方法。本发明的高导电纳米复合材料由具有超高电导率的金属纳米颗粒为内核，以具有细胞膜强贴附作用的有机材料为外壳层组成；金属纳米内核由贵金属材料构成，有机外壳层由含酚羟基的有机分子或其聚合物构成。典型的是聚多巴胺包裹金纳米棒形成的复合材料Au@PDA。该纳米复合材料具有神经膜表面贴附、神经膜电特性重塑、安全高效且作用持久等特点，可作为急慢性神经退行性疾病进行生物电调节的治疗药物，有效克服了小分子治疗药物功能单一、作用时间短、易耐受成瘾等不足，具有广阔临床应用前景。用前景。用前景。


技术研发人员：刘艳颜 陈飞翔 步文博
受保护的技术使用者：复旦大学
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/8/24