一种磁性微球sumo酶切割的方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及使用固定化金属离子亲和层析联合通过磁性微球sumo酶切割移除标签获得融合蛋白的生物学方法。


背景技术：

2.蛋白在现今的新药开发、疾病检测、蛋白质组学研究和酶与底物反应等生命科学的多个领域广泛应用。
3.对于重组蛋白的生产所应用的表达系统可以为细菌、酵母、动物细胞、植物细胞等。有原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统，也是最经济实惠的蛋白表达系统。酵母蛋白表达系统以甲醇毕赤酵母为代表，具有表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物等优点。哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统主要优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，最容易保留生物活性。
4.当蛋白应用于人体时，为保证药物使用的安全性，每种药物必须满足相应的质量管理标准（sfda，state food and drug administration），例如会引起危害的宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、内毒素和病毒等必须被去除。一步或多步纯化步骤应用于蛋白的纯化，以满足产品的质量需求。
5.目前广泛应用于蛋白纯化的方法有：金属离子螯合亲和层析(例如ni亲和层析)，亲和层析(例如蛋白a亲和层析)，离子交换层析(例如阳离子交换，阴离子交换)和混合模式离子交换，疏水相互作用，尺寸排阻层析。
6.传统的酶切方法是先使用含咪唑、还原型谷胱甘肽的洗脱液洗脱结合在金属离子螯合亲和层析柱上带ni和gst标签的重组蛋白，然后将洗脱的带ni和gst标签的重组蛋白样品置换到适合酶切的缓冲溶液中，再加入sumo酶进行酶切反应，最后再将进一步将酶切后的融合蛋白和标签通过金属离子螯合亲和层析柱进行分离。所以需要一种能够减少环境污染，操作简单、经济高效的的融合蛋白纯化和生产的操作方法。


技术实现要素：

7.本发明旨在解决上述缺陷，提供一种磁性微球进行sumo酶切割的方法，利用sumo酶直接在磁性微球上酶切的方法，将融合蛋白从连接的标签上切除，然后回收融合蛋白的方法。
8.为了克服背景技术中存在的缺陷，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：这种磁性微球进行sumo酶切割的方法，通过在磁性微球上，从介于所述标签和所述融合蛋白之间的蛋白酶切割位点进行磁性微球sumo酶切割生产融合蛋白的方法，该方法包括：s1、his标签蛋白纯化磁性微球和带标签的融合蛋白置于反应容器内，得到结合了带his标签的融合蛋白的磁性微球；s2、用10倍his标签蛋白纯化磁性微球体积的洗杂缓冲液充分清洗步骤s1得到的结合了带his标签的融合蛋白的磁性微球；
s3、配制每40ng的sumo酶需要用1ml酶切缓冲液溶解，把配制好的sumo酶加到步骤s2得到的清洗完的结合了带his标签的融合蛋白的磁性微球中，轻轻混匀、并轻轻震荡反应过夜；s4、用磁棒吸附步骤s3中的结合了带his标签的融合蛋白的磁性微球10min后，收集含酶切去除了标签的融合蛋白液；s5、将步骤s4中用磁棒吸附的磁性微球再次通过少量缓冲液进行冲洗，获得更多的融合蛋白液。
9.根据本发明的另一个实施例，进一步包括所示步骤s1中带标签的融合蛋白与磁性微球的结合时间为5-15分钟。
10.根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述步骤s2中洗杂缓冲液选自磷酸或其盐或三（羟基甲）氨基甲烷（tris）或其盐。
11.根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述步骤s3中轻轻震荡反应过夜的反应条件为在2-50℃温度下酶切10-16小时。
12.根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述步骤s3中sumo蛋白酶指源自大肠杆菌的蛋白酶。
13.根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述带标签的融合蛋白内含有未加抑制剂、1 mm edta、10 mm edta、50 mm edta、100 mm edta、1 mm pmsf、5 mm pmsf或者10 mm pmsf不同浓度抑制剂。
14.根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述步骤s5中少量缓冲液为带咪唑的洗脱液。
15.根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述步骤s1中的反应容器为通量纯化仪内的深孔板孔或者离心管磁力架。
16.根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述步骤s4中的磁棒上套设磁棒套，磁性微球通过磁棒的吸力使其吸附于磁棒套的下顶端。在使用过程中，首先在磁棒上套设磁棒套，磁棒和磁棒套在深孔板中缓慢地上下移动，将磁珠收集到磁棒套的下顶端。磁棒和磁棒套结合磁珠后，从深孔板中提起，然后转移到下一个深孔板中，磁棒脱离磁棒套，随后磁珠掉落。
17.本发明的有益效果是：这种磁性微球进行sumo酶切割纯化融合蛋白的方法能够快速的去除标签，获得融合蛋白；操作简单，适合工业化大规模生产，减少了环境污染，适用于生物技术领域，用于标签蛋白的标签去除和融合蛋白的纯化；能够将纯化融合的蛋白的时间大大缩短，从原先的步骤：样品破碎、上样、洗杂、洗脱、透析、酶切、去除标签纯化，省去其中的洗脱、透析和去除标签纯化，总时长上可节约至少8 h。且省去的步骤中的洗脱和透析都需要试剂，这部分的试剂配制不仅节约了时间，更节约了成本。
附图说明
18.图1是本发明实施例中rn73d酶切前后的sds-page电泳分析图；图2是本发明实施例中twin strep tagⅱ蛋白在不同温度下酶切前后的sds-page电泳分析图；
图3是本发明实施例中twin strep tagⅱ蛋白在不同浓度抑制剂下酶切前后的sds-page电泳分析图。
具体实施方式
19.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.一种磁性微球sumo酶切割的方法，该方法包括：s1、his标签蛋白纯化磁性微球和带标签的融合蛋白置于反应容器内，得到结合了带标签的融合蛋白的磁性微球；s2、用10倍his标签蛋白纯化磁性微球体积的洗杂缓冲液充分清洗步骤s1得到的结合了带his标签的融合蛋白的磁性微球；s3、配制每40ng的sumo酶需要用1ml酶切缓冲液溶解，把配制好的sumo酶加到步骤s2得到的清洗完的结合了带his标签的融合蛋白的磁性微球中，轻轻混匀、并轻轻震荡反应过夜；s4、用磁棒吸附步骤s3中的结合了带his标签的融合蛋白的磁性微球10min后，收集含sumo酶切去除了标签的融合蛋白液；s5、将步骤s4中用磁棒套吸附的磁性微球再次通过少量缓冲液进行冲洗，获得更多的融合蛋白液。由于sumo蛋白酶上带his标签，sumo蛋白酶会结合在磁性微球上，可进一步去除sumo蛋白酶达到纯化效果。磁性微球上残余部分，可以使用带咪唑的洗脱液洗脱，根据洗脱样品的含量检测计算酶切效率。
21.其中，步骤s1中带标签的融合蛋白与磁性微球的结合时间为5-15分钟。
22.其中，步骤s2中洗杂缓冲液选自磷酸或其盐或三（羟基甲）氨基甲烷（tris）或其盐。
23.其中，步骤s3中轻轻震荡反应过夜的反应条件为在2-50℃温度下酶切10-16小时。
24.其中，步骤s3中sumo蛋白酶指源自大肠杆菌的蛋白酶。
25.其中，带标签的融合蛋白内含有未加抑制剂、1 mm edta、10 mm edta、50 mm edta、100mm edta、1 mm pmsf、5 mm pmsf或者10 mm pmsf不同浓度抑制剂。
26.其中，步骤s1中的反应容器为通量纯化仪内的深孔板孔或者离心管磁力架。当磁性微球当应用于小量的、高通量蛋白表达体系时，可采用磁珠介质结合p8、p16、p32和p24的通量纯化仪进行，将其放置于深孔板孔内；当磁性微球手动纯化需要大体积的样品，可以将其放置于50ml离心管磁力架进行手动纯化操作。
27.其中，步骤s4中的磁棒上套设磁棒套，磁性微球通过磁棒的吸力使其吸附于磁棒套的下顶端。在使用过程中，首先在磁棒上套设磁棒套，磁棒和磁棒套在深孔板中缓慢地上下移动，将磁珠收集到磁棒套的下顶端。磁棒和磁棒套结合磁珠后，从深孔板中提起，然后转移到下一个深孔板中，磁棒脱离磁棒套，随后磁珠掉落。
28.实施例一，his-标签标记的融合蛋白的磁性微球酶切和融合蛋白的洗脱：s1、10 ml ni smart magarose beads磁性微球置于50 ml离心管内，带his标签的
蛋白与10 ml ni smart magarose beads磁性微球结合，结合时间5 min；s2、用100 ml的0.1 mm tris，ph8.0缓冲液清洗步骤s1中的结合了带标签的融合蛋白的磁性微球；s3、使用400 ng的sumo酶，用10 ml进行酶切酶切缓冲液溶解，然后把配制好的sumo酶加到清洗完的结合了带标签的融合蛋白的磁性微球中轻轻混匀，并轻轻震荡，在4℃下反应至少12小时，以允许sumo酶切割结合的蛋白，即切除his-标签并从而从柱释放融合蛋白；s4、用磁棒吸附步骤s3中的结合了带his标签的融合蛋白的磁性微球10min后，收集含sumo酶切去除了标签的融合蛋白液；s5、收集酶切液后，通过0.1 mm tris，ph8.0缓冲液清洗磁棒套吸附的磁性微球，洗脱从his-标签切下的多肽，进行蛋白浓度检测；蛋白酶切前后各取10 ng，用水稀释至20 μl终体积，加入5 μl 5*loading buffer，进行sds-page分析。
29.酶切前后结果如图1所示，其中：m：蛋白质分子量标记；1：蛋白酶切前；2：蛋白酶切后；切下和回收的融合蛋白的产量为60％至75％。
30.步骤结合于微球的量（mg）酶切液回收的量（mg）回收率（%）加载530n/a100洗脱n/a37270.18
31.表中，n/a＝不适用。
32.实施例二，twin strep tagⅱ融合蛋白的磁性微球酶切和融合蛋白的洗脱：s1、10 ml ni smart magarose beads磁性微球置于50ml离心管内，带his标签的蛋白与10 ml ni smart magarose beads磁性微球结合，结合时间5 min；s2、用100 ml的0.1 mm tris，ph8.0缓冲液清洗步骤s1中的结合了带标签的融合蛋白的磁性微球；s3、使用400 ng的sumo酶，用10 ml进行酶切酶切缓冲液溶解，然后把配制好的sumo酶加到清洗完的磁性微球中轻轻混匀，并轻轻震荡分别在4℃、30℃、37℃、50℃反应至1小时，以允许sumo酶切割结合的蛋白，即切除his-标签并从而从柱释放融合蛋白；s4、用磁棒吸附步骤s3中的结合了带his标签的融合蛋白的磁性微球10min后，收集含sumo酶切去除了标签的融合蛋白液；s5、收集酶切液后，通过0.1 mm tris，ph8.0缓冲液清洗磁棒套吸附的磁性微球，洗脱从his-标签切下的多肽，进行蛋白浓度检测；蛋白酶切前后各取10ng，用水稀释至用水稀释至20 μl终体积，加入5 μl 5*loading buffer，进行sds-page分析。
33.酶切前后结果如图2所示，其中：m：蛋白质分子量标记；1：蛋白酶切前；
2：4℃蛋白酶切后；3：30℃蛋白酶切后；4：37℃蛋白酶切后；5：50℃蛋白酶切后；切下和回收的融合蛋白的产量为60％至75％。
34.步骤结合于柱上的量（mg）从柱上回收的量（mg）回收率（%）加载500n/a100洗脱（4℃）n/a34569洗脱（30℃）n/a33567洗脱（37℃）n/a32565洗脱（50℃）n/a30561
35.表中，n/a＝不适用。
36.实施例三，twin strep tagⅱ融合蛋白的柱上酶切和融合蛋白的洗脱：s1、10 ml ni smart magarose beads磁性微球置于50 ml离心管内，带his标签的蛋白与10 ml ni smart magarose beads磁性微球结合，每组蛋白中添加不同浓度抑制剂：未加抑制剂、1 mm edta、10 mm edta，50 mm edta，100mm edta，1 mm pmsf，5 mm pmsf，10 mm pmsf，结合时间5 min；s2、用100 ml的0.1mm tris，ph8.0缓冲液清洗步骤s1中的结合了带标签的融合蛋白的磁性微球；s3、使用400 ng的sumo蛋白酶，用10 ml进行酶切酶切缓冲液溶解，然后把配制好的酶加到清洗完的磁性微球中轻轻混匀，并轻轻震荡4℃反应至少12小时，以允许sumo酶切割结合的蛋白，即切除his-标签并从而从柱释放融合蛋白；s4、用磁棒吸附步骤s3中的结合了带his标签的融合蛋白的磁性微球10min后，收集含sumo酶切去除了标签的融合蛋白液；s5、收集酶切液后，通过0.1 mm tris，ph8.0缓冲液清洗磁棒套吸附的磁性微球，洗脱从his-标签切下的多肽，进行蛋白浓度检测；蛋白酶切前后各取10ng，用水稀释至20 μl终体积，加入5 μl 5*loading buffer，进行sds-page分析。
37.酶切前后结果如图3所示，其中：m：蛋白质分子量标记；1：蛋白酶切前；2：未加抑制剂蛋白酶切后；3：1 mm edta蛋白酶切后；4：10 mm edta蛋白酶切后；5：50 mm edta蛋白酶切后；6：100 mm edta蛋白酶切后；7：1 mm pmsf蛋白酶切后；8：5 mm pmsf蛋白酶切后；9：10 mm pmsf蛋白酶切后；
切下和回收的融合蛋白的产量为60％至75％。
38.步骤结合于柱上的量（mg）从柱上回收的量（mg）回收率（%）加载500n/a100洗脱1（未加抑制剂）n/a357.471.48洗脱2（1mmedta）n/a351.770.34洗脱3（10mmedta）n/a35.8271.64洗脱4（50mmedta）n/a351.2570.25洗脱5（100mmedta）n/a349.269.84洗脱6（1mmpmsf）n/a342.968.58洗脱7（5mmpmsf）n/a346.769.34洗脱8（10mmpmsf）n/a356.2571.25
39.表中，n/a＝不适用。
40.磁性微球因为具有磁性，在磁场作用下可定向运动到特定部位，或迅速从周围介质中分离出来。这些性能使其具有极广阔的应用前景，因而在细胞分离、蛋白质分离和纯化、固定化酶、免疫分析测定、靶向药物、dna分离与核酸杂交等领域有着广泛的应用前景。
41.以磁性微球为固相介质对蛋白质进行提纯是一项新兴的蛋白质分离技术。传统的蛋白质分离方法如盐析、有机溶剂、膜分离技术、离子交换技术和层析技术等，通过改变ph值、温度、离子强度、介电常数等因素来达到分离的目的，分离过程繁杂，而且目标蛋白质的损失大。而蛋白质的磁分离是通过对磁性微球表面的改性，共价结合能被目标蛋白质识别和可逆结合的配基，然后进行目标蛋白质的分离。在磁分离过程中，将磁性微球直接放入含有目标蛋白质的混合溶液中，目标蛋白质与磁性微球紧密结合，然后利用外部磁场进行分离。整个分离过程不需对混合溶液的ph值、温度、离子强度和介电常数进行调整，从而避免了传统分离过程中蛋白质的损失。与传统分离方法相比较，蛋白质的磁分离技术具有快速、高纯、高收率等优点。
42.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种磁性微球进行sumo酶切割的方法，其特征在于，该方法包括：s1、his标签蛋白纯化磁性微球和带标签的融合蛋白置于反应容器内，得到结合了带his标签的融合蛋白的磁性微球；s2、用10倍his标签蛋白纯化磁性微球体积的洗杂缓冲液充分清洗步骤s1得到的结合了带his标签的融合蛋白的磁性微球；s3、配制每40ng的sumo酶需要用1ml酶切缓冲液溶解，把配制好的sumo酶加到步骤s2得到的清洗完的结合了带his标签的融合蛋白的磁性微球中，轻轻混匀、并轻轻震荡反应过夜；s4、用磁棒吸附步骤s3中的结合了带his标签的融合蛋白的磁性微球10min后，收集含酶切去除了标签的融合蛋白液；s5、将步骤s4中用磁棒吸附的磁性微球再次通过少量缓冲液进行冲洗，获得更多的融合蛋白液。2.如权利要求1所述的磁性微球进行sumo酶切割的方法，其特征在于：所示步骤s1中带标签的融合蛋白与磁性微球的结合时间为5-15分钟。3.如权利要求1所述的磁性微球进行sumo酶切割的方法，其特征在于：所述步骤s2中洗杂缓冲液选自磷酸或其盐或三（羟基甲）氨基甲烷（tris）或其盐。4.如权利要求1所述磁性微球进行sumo酶切割的方法，其特征在于：所述步骤s3中轻轻震荡反应过夜的反应条件为在2-50℃温度下酶切10-16小时。5.如权利要求1所述的磁性微球进行sumo酶切割的方法，其特征在于：所述步骤s3中sumo酶指源自大肠杆菌的蛋白酶。6.如权利要求1所述的磁性微球进行sumo酶切割的方法，其特征在于：所述带标签的融合蛋白内含有未加抑制剂、1 mm edta、10 mm edta、50 mm edta、100 mm edta、1 mm pmsf、5 mm pmsf或者10 mm pmsf的不同浓度抑制剂。7.如权利要求1所述的磁性微球进行sumo酶切割的方法，其特征在于：所述步骤s5中少量缓冲液为带咪唑的洗脱液。8.如权利要求1所述的磁性微球进行sumo酶切割的方法，其特征在于：所述步骤s1中的反应容器为通量纯化仪内的深孔板孔或者离心管磁力架。9.如权利要求1所述的磁性微球进行sumo酶切割的方法，其特征在于：所述步骤s4中的磁棒上套设磁棒套，磁性微球通过磁棒吸附于磁棒套下顶端。

技术总结
本发明属于生物技术领域，尤其涉及磁性微球进行sumo酶切割的方法。包括：S1、His标签蛋白纯化磁性微球材料置于反应容器内，结合于磁性微球的带标签的融合蛋白；S2、用上述10倍磁性微球体积的洗杂缓冲液充分清洗微球；S3、把配制好的酶加到清洗完的磁性微球中轻轻混匀，并轻轻震荡反应过夜；S4、用磁棒套吸附磁性微球10 min后，收集含酶切去除了标签的融合蛋白液。这种方法操作简单，适合工业化大规模生产，减少了环境污染，适用于生物技术领域，用于标签蛋白的标签去除和融合蛋白的纯化。签蛋白的标签去除和融合蛋白的纯化。


技术研发人员：单玉飞 张敏 奚学志 方利
受保护的技术使用者：常州伯仪生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/8/24