一种提高细胞活力的营养液及其制备方法、应用与流程

15μg/ml～25μg/ml， forskolin 10μg/ml～20μg/ml。
7.进一步地，该营养液包含以下组分：绿原酸 20μg/ml～25μg/ml，阿魏酸 25μg/ml～30μg/ml，二甲双胍 15μg/ml～20μg/ml， forskolin 15μg/ml～20μg/ml。
8.进一步地，该营养液包含以下组分：绿原酸 25μg/ml，阿魏酸 30μg/ml，二甲双胍 20μg/ml， forskolin 15μg/ml。
9.本发明还提供了一种提高细胞活力的营养液的制备方法，其包括以下步骤：称取适量绿原酸、阿魏酸、二甲双胍和 forskolin，加入ddh2o溶解，并调整ph至7.0～7.2，定容，再使用0.22μm过滤器过滤，即可使用。
10.本发明还提供了一种提高细胞活力的营养液在培养骨髓间充质干细胞中的应用。
11.进一步地，所述应用包含以下步骤：1）将营养液加入细胞培养基中，添加量为1～5%（v/v），得到复合培养液；2）将骨髓间充质干细胞接种至步骤1）得到的复合培养液中，然后置于37℃、5%co2培养箱中传代培养，每隔2-3天换液一次，更换的培养基为新鲜的复合培养液。
12.进一步地，所述骨髓间充质干细胞是冷冻保存后经复苏得到的或分离得到的。
13.进一步地，所述细胞培养基包括但不限于dmem、rpmi 1640、mem、dmem/f12。
14.进一步地，所述营养液的添加量为5%（v/v）。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果为：绿原酸及其衍生物具有明显的自由基清除效果，可有效清除dpph自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基，还可抑制低密度脂蛋白的氧化。绿原酸对有效地清除体内自由基、维持机体细胞正常的结构和功能、防止和延缓肿瘤突变和衰老等现象的发生具有重要作用。杜仲绿原酸含有一种可促进人体的皮肤、骨骼、肌肉中胶蛋白的合成与分解的特殊成分，具有促进代谢、防止衰退的功能，可用来预防宇航员因太空失重而引起的骨骼和肌肉衰退，同时发现杜仲绿原酸无论在体内还是体外，均有明显抗自由基作用。
16.有研究阿魏酸能消灭自由基，恢复生命体的正常机能，阿魏酸可使生命体产生自由基的酶受到抑制，在此基础上，还可使清除自由基的酶增加。同时阿魏酸能时大大增强还原酶、谷化甘化转硫酶的活性，控制活性酪氨酸酶的比例。研究表明阿魏酸的抗氧化作用显著，对过氧化氨、超氧自由基、羟自由基、过氧化硝基等都有良好的清除效果。
17.本技术的营养液包含绿原酸、阿魏酸、二甲双胍和forskolin，绿原酸、阿魏酸广泛来源于金银花、杜仲等植物，造价便宜，将其添加至细胞培养基中用于培养骨髓间充质干细胞时，传代15次之后，添加有营养液的实验组的细胞存活率仍可达到90%以上，比未添加营养液的空白组高出10.3%，传代20次后，实验组的细胞存活率比空白组高出22.9%，说明该营养液能够有效提高骨髓间充质干细胞在体外培养时的细胞活力，且经细胞毒性试验证明，本发明的营养液不会影响骨髓间充质干细胞的后续分化，无毒副影响，可有效改善骨髓间充质干细胞在体外经10次以上的传代之后细胞活力会大幅降低的问题，为骨髓间充质干细胞的体外培养提供了新思路。
附图说明
18.图1是不同绿原酸浓度下骨髓间充质干细胞细胞活力变化图。
19.图2是不同阿魏酸浓度下骨髓间充质干细胞细胞活力变化图。
20.图3是不同二甲双胍浓度下骨髓间充质干细胞细胞活力变化图。
21.图4是不同forskolin浓度下骨髓间充质干细胞细胞活力变化图。
22.图5是实验组的骨髓间充质干细胞成骨分化染色图。
23.图6是空白组的骨髓间充质干细胞成骨分化染色图。
具体实施方式
24.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
25.实施例1选取 spf 级，体重 100~150g 左右的sd 大鼠，断颈处死。将大鼠置于体积分数为75%的乙醇中浸泡 5 min。从关节处将大鼠大腿剪下。除去骨表面附着的软组织，置于另一无菌培养皿中。用无菌pbs 浸泡清洗。眼科剪剪断两端骨骺，显露骨髓腔，放置于 10ml 含体积分数为10%胎牛血清的新鲜dmem完全培养液的无菌培养皿中，取出 1ml 注射器，用镊子钳起骨头的一端，并用注射器吸取完全培养液冲洗骨髓腔至另一培养皿中，由一段骨髓腔冲出骨髓， 重复 3 次，再反方向冲出骨髓，重复 3 次。直至骨髓腔冲洗液变清亮后停止，收集冲洗液为骨髓液。
26.取骨髓液5ml，用等体积pbs稀释混匀，室温下1500 rpm离心10分钟；弃去脂肪层，将稀释骨髓液沿离心管壁缓慢加到等体积ficoll分离液（1.077g/ml）上面，室温2500 rpm离心30分钟；吸取界面白膜状层的单个核细胞，用pbs混悬后，室温1500 rpm离心10分钟；弃上清并重复洗涤2次。用含10%fbs的lg-dmem培养液（或骨髓间充质干细胞专用培养基）重悬细胞，调整细胞密度为2x105/ml，接种于底面积为25cm2培养瓶中置于37℃、5%co2培养箱中进行培养；于3天后首次换液，弃去悬浮细胞后，每2-3天换液一次；每日镜下观察细胞形态及生长变化，待细胞生长达80%-90%融合时，用胰蛋白酶-edta溶液（0.25%：0.02%）进行消化，按1：2比例进行传代培养2次。
27.称取适量绿原酸、阿魏酸、二甲双胍和 forskolin，加入ddh2o溶解，并调整ph至7.0～7.2，定容，再使用0.22μm过滤器过滤，使营养液中各成分的浓度为：绿原酸 25μg/ml，阿魏酸 30μg/ml，二甲双胍 20μg/ml， forskolin 15μg/ml。将营养液按照5%（v/v）的量加入含10%fbs的dmem培养液中，得到复合培养液。
28.将前述分离得到的骨髓间充质干细胞调整细胞密度为2x105/ml，并分为两组，一组接种至前述复合培养液中，为实验组，一组接种于不含营养液的含10％fbs的dmem培养液中，为空白组，然后置于37℃、5%co2培养箱中培养，每隔2-3天换液一次，更换的培养基为新鲜的复合培养液。待细胞生长达80%-90%融合时，用胰蛋白酶-edta溶液（0.25%：0.02%）进行消化，按1：2比例进行传代培养，分别于传代5、10、15、20代时测定细胞存活率。
29.实验组和空白组均使用mtt法检测细胞存活情况。具体步骤为：设计对照孔和调零孔的位置和数量，为了避免因为水分蒸发造成浓度改变后影响实验结果，在96孔板外缘一周每孔加入200μl无菌pbs。将上述培养的骨髓间充质干细胞分别分散对应的培养基中制成
单细胞悬液，在显微镜下进行细胞计数，以每孔5000左右个细胞将骨髓间充质干细胞接种到96孔板上，每孔体积200μl，放入37℃，含5％co2及饱和湿度的培养箱中培养24h；细胞培养24h后用移液枪将每孔旧培养基吸出，分别再加入对应的培养基，对照孔和调零孔加新鲜培养基；小心称取mtt用无菌pbs配制成浓度为5mg/ml的溶液，24h后取出96孔板，每孔加入20μl mtt溶液，在培养箱中孵育4h，用无菌注射器将旧培养基吸出，再每孔加入150μl dmso，孵育10min。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。
30.检测结果如表1所示，骨髓间充质干细胞在传代次数少于10代时，添加有营养液的实验组的细胞存活率与未添加营养液的空白组的细胞存活率相差并不大。当传代次数超过10代后，空白组的细胞存活率急速下降，当传代15代时，细胞存活率只有80.2%，传代20代时，细胞存活率只有63.5%，而实验组在传代15代时，细胞存活率仍可在90%以上，比空白组高出10.3%，当传代20代时，细胞存活率为86.4%，比空白组高出22.9%。可见，营养液的添加可以有效提高骨髓间充质干细胞的细胞存活率，使其在高频次的连续传代中保持较高的细胞活力。
31.表1：不同传代次数的骨髓间充质干细胞存活率组别5代10代15代20代实验组95.4%92.1%90.5%86.4%空白组94.3%90.6%80.2%63.5%
32.实施例2采用单因素对照实验，分别调整营养液中绿原酸、阿魏酸、二甲双胍和 forskolin的浓度，将各组分的浓度分别设置为：0、5、10、15、20、25、30、35、40、45μg/ml，得到不同的营养液，再将其添加含10%fbs的dmem培养液中用于培养骨髓间充质干细胞，传代20次后，使用mtt法检测细胞活力，具体方法步骤参照实施例1，以此探究营养液中各组分的浓度对骨髓干细胞细胞活力的影响。
33.结果如图1～4所示，营养液中各组分的浓度均对骨髓间充质干细胞的浓度有所影响，当绿原酸的浓度为25μg/ml，阿魏酸的浓度为30μg/ml，二甲双胍的浓度为20μg/ml以及forskolin的浓度为15μg/ml时，骨髓间充质干细胞的细胞活力最佳；当绿原酸、阿魏酸、二甲双胍和 forskolin的浓度分别为0时，当骨髓间充质干细胞的细胞活力分别为70.6%、69.4%、67.1%和73.5%，其细胞存活率相较于最佳浓度时显著下降，说明只有在特定的浓度范围内，才能更好的提高骨髓间充质干细胞的细胞活力，任意调整组分的浓度或者删减组分，均会降低营养液的功效。
34.实施例3srt 1720为常用的细胞激活剂，将实施例1制备得到的营养液中的forskolin替换为等浓度的srt 1720，其他成分均相同，作为对照组，然后按照实施例1的方法培养骨髓间充质干细胞，传代20代后测定骨髓间充质干细胞的细胞存活率。以添加实施例1中营养液的组别为实验组，以不添加营养液的组别为空白组。
35.结果如表2所示，当细胞激活剂替换为srt 1720时，传代20代后的骨髓间充质干细胞的存活率为80.3%，虽然比不添加任何营养液的空白组的细胞存活率高出14.1%，但比实验组降低了6.5%，可见，并非任意的细胞激活剂均能大幅提高细胞活性，绿原酸、阿魏酸、二甲双胍和 forskolin的组合也并非随意组合，而是经过大量实验筛选得到的最佳组合，各
个成分之间具有协同增效的作用。
36.表2：不同激活剂对骨髓间充质干细胞存活率的影响组别20代实验组86.8%对照组80.3%空白组66.2%
37.实施例4分别取实施例1中实验组和空白组传代培养了20代的骨髓间充质干细胞进行成骨细胞诱导分化。具体步骤如下： 取骨髓间充质干细胞铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成骨诱导培养基（imdm 中加入 10% fbs，5 μg/ml 胰岛素，0.1 μm 地塞米松，0.2 mm 维生素 c 和 10 mm β-甘油磷酸盐）。3d换液1次，分化15d。待矿化结节形成后，进行硝酸银染色。pbs 缓冲液清洗3次，10％中性甲醛固定20 min，再用 pbs 缓冲液清洗2次，茜素红染液浸染，pbs缓冲液清洗2次，空气中晾干10 min，倒置显微镜下观察拍照。
38.结果如图5和6显示，实验组和空白组的细胞均可见矿化结节，呈现大面积红色，骨髓间充质干细胞成功诱导分化为成骨细胞，说明添加营养液并不会影响骨髓间充质干细胞后续的分化能力，营养液对骨髓间充质干细胞并无毒副作用。
39.以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种提高细胞活力的营养液，其特征在于，所述营养液包含以下组分：绿原酸20μg/ml～30μg/ml，阿魏酸25μg/ml～35μg/ml，二甲双胍15μg/ml～25μg/ml，forskolin10μg/ml～20μg/ml。2.如权利要求1所述的提高细胞活力的营养液，其特征在于，所述营养液包含以下组分：绿原酸20μg/ml～25μg/ml，阿魏酸25μg/ml～30μg/ml，二甲双胍15μg/ml～20μg/ml，forskolin15μg/ml～20μg/ml。3.如权利要求1或2所述的提高细胞活力的营养液，其特征在于，所述营养液包含以下组分：绿原酸25μg/ml，阿魏酸30μg/ml，二甲双胍20μg/ml，forskolin15μg/ml。4.如权利要求1～3任一所述的提高细胞活力的营养液的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：称取适量绿原酸、阿魏酸、二甲双胍和forskolin，加入ddh2o溶解，并调整ph至7.0～7.2，定容，再使用0.22μm过滤器过滤，即可使用。5.如权利要求1～3任一所述的提高细胞活力的营养液在培养骨髓间充质干细胞中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包含以下步骤：1）将营养液加入细胞培养基中，添加量为体积比1～5%，得到复合培养液；2）将骨髓间充质干细胞接种至步骤1）得到的复合培养液中，然后置于37℃、5%co2培养箱中传代培养，每隔2-3天换液一次，更换的培养基为新鲜的复合培养液。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞是冷冻保存后经复苏得到的或分离得到的。8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞培养基包括但不限于dmem、rpmi1640、mem、dmem/f12。9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述营养液的添加量为体积比5%。

技术总结
本发明公开了一种提高细胞活力的营养液及其制备方法、应用，属于细胞培养技术领域。营养液包含绿原酸、阿魏酸、二甲双胍和forskolin，将其添加至细胞培养基中用于培养骨髓间充质干细胞时，传代15次之后，细胞存活率仍可达到90%以上，说明该营养液能够有效提高骨髓间充质干细胞在体外培养时的细胞活力，且该营养液不会影响骨髓间充质干细胞的后续分化能力，没有毒副影响，可有效改善骨髓间充质干细胞在体外经10次以上的传代之后细胞活力会大幅降低的问题。力会大幅降低的问题。力会大幅降低的问题。


技术研发人员：田大禹
受保护的技术使用者：成都高新绮澳医疗美容诊所有限公司
技术研发日：2023.07.26
技术公布日：2023/8/28