一种由DNA连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜及其制备方法和应用

一种由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于酶工程领域，具体涉及一种由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜及其制备方法和应用。


背景技术：

2.酶是一类具有生物催化功能的生物大分子，其催化效率、特异性和选择性远远超过人工催化剂，作为生物催化剂，优点非常鲜明，活性高、特异性好、反应条件温和；基于酶的生物催化在可持续合成、药物设计、生物工程以及传感等研究中异常活跃，并得到迅速发展。然而，酶易受温度、ph、大部分有机溶剂和抑制剂等外界因素的影响，化学稳定性及热稳定性差、容易失活、分离纯化困难、成本高、普适性差，这些脆弱性也严重阻碍酶催化体系的大规模应用。基于此，越来越多的研究者致力于酶固定化的研究，在提高生物酶的稳定性的同时，也能增强其回收利用的性能。目前，壳聚糖，琼脂糖，纤维素，mof(metal organic framework)材料等被应用于酶的固定化，其中，由有机配体与金属离子合成的多孔mof材料在近年来受到广泛关注。mof材料具有连接剂多样性，官能团可调节，高比表面积，化学稳定性强等特点，可为生物酶提供良好的保护，也可以通过后续的离心等操作实现生物酶的回收利用，使用mof材料对游离酶进行固定化逐步成为一项热门研究。
3.然而随着研究的不断深入，研究者发现在通过离心回收利用酶-mof复合材料的过程中，mof材料会出现一定程度的崩解，从而导致酶-mof复合材料被破坏，酶结构受到影响，mof材料的碎片也会对接下来的催化反应造成一定影响。因此，急需一种新型复合催化材料，在保持高效催化活性的同时，增强酶-mof复合催化材料的高稳定性，简化下游回收利用的步骤，避免复合材料的崩解，从而维持酶的结构，提高其催化效率和回收利用率。同时，该复合材料还需普适性，可应用于多种酶的催化反应场所。


技术实现要素：

4.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜，其中新型酶-金属有机框架复合材料是由ni合成的酶-金属有机框架复合催化材料(enzyme@metal organic framework)，这是有报道以来首次将ni用于mof材料的合成过程中。本发明中的dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜，具有生物酶绿色环保，高效催化的特点；还继承了酶-mof材料比表面积大，拥有良好的化学稳定性等优点；相较于传统的mof材料，酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜系统能简化后续的分离回收操作，同时能减少mof材料因离心分离造成的崩解，保证酶的结构稳定性，实现后续的循环利用，进而降低成本。
5.本发明还提供所述由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜的制备方法和应用。
6.本发明酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜可用于多种酶的催化体系。例如，将
其应用于产自假丝酵母的脂肪酶(crl)的水解反应及在油水混合体系下催化植物甾醇酯的酯化合成；壳聚糖酶(csn)和猪胰脂肪酶(ppl)水解大分子聚合物——壳聚糖；肝素合酶(pmhs2)合成肝素；天然酶葡萄糖氧化酶(gox)与纳米酶磁性纳米粒(mnp)的级联反应；蔗糖合酶(susy)与二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶溶液(udh)的双天然酶级联反应；n-乙酰氨基己糖1-位激酶(nahk)，尿苷转移酶(glmu)的双天然酶级联反应，具备可操作性，连续性，实际应用便捷性，同时优化了后续循环利用的操作步骤，进而实现成本的降低。
7.技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜，包括载体细菌纤维素膜，由金属ni合成的酶-金属有机框架复合催化材料，连接剂dna，由dna将ni合成的酶-金属有机框架复合催化材料固定在细菌纤维素膜上形成；所述ni合成的酶-金属有机框架复合催化材料以ni基于2-甲醛咪唑合成的mof材料作为载体，将酶包覆在其内部形成酶-金属有机框架复合催化材料。
8.作为优选，以预处理的细菌纤维素膜为载体，以一种由ni合成的酶-金属有机框架复合催化材料为原料；以dna为连接剂；在酸性环境下通过后组装合成酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜。
9.作为优选，所述由ni合成的酶-金属有机框架复合催化材料，是以ni基于2-甲醛咪唑合成的mof材料(metal organic framework)作为载体，通过共沉淀的方法将酶包覆在其内部形成酶-金属有机框架复合催化材料(enzyme@mof)。
10.其中，所载体细菌纤维素膜厚度为0.3～0.8cm；所述ni合成的酶-金属有机框架复合催化材料直径为50～500nm，所述由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜为麦穗状酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜。
11.其中，所述dna是长度为6～20个脱氧核糖核苷酸，碱基种类为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶组成的单链dna。
12.其中，所述酶包括产自假丝酵母的脂肪酶(crl)，壳聚糖酶(csn)，猪胰脂肪酶(ppl)，肝素合酶(pmhs2)，葡萄糖氧化酶(gox)，蔗糖合酶(susy)，二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶(udh)，n-乙酰氨基己糖1-位激酶(nahk)，尿苷转移酶(glmu)中的一种或者多种。
13.作为优选，所述酶溶液分别为产自假丝酵母的脂肪酶溶液(crl)，壳聚糖酶溶液(csn)，猪胰脂肪酶溶液(ppl)，肝素合酶溶液(pmhs2)，葡萄糖氧化酶溶液(gox)，蔗糖合酶溶液(susy)，二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶溶液(udh)，n-乙酰氨基己糖1-位激酶(nahk)，尿苷转移酶(glmu)。
14.本发明所述的由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜的制备方法，包括如下步骤：
15.(1)将细菌纤维素膜用碱溶液浸泡，再洗涤至中性，浸泡在含ni的水溶液中，形成含ni的纤维素膜；
16.(2)将2-甲醛咪唑溶液，酶溶液，硝酸镍溶液混合搅拌反应后得到含ni的酶-金属有机框架复合催化材料的反应液，离心后得到米粒状复合材料；
17.(3)将米粒状复合材料与含ni的纤维素膜材料，置于酸性环境中，并加入dna，经过自组装得到酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜。
18.其中，步骤(1)中所述碱溶液为氢氧化钠溶液ph为9～12，浓度为1～5mm，浸泡时间为10～15h。
19.作为优选，步骤(1)中裁成的纤维素膜大小为1cm
×
1cm
×
0.5cm的长方体。
20.其中，步骤(2)中2-甲醛咪唑与硝酸镍的摩尔浓度比为1:4～8:1，摩尔比为1:4～8:1，所述2-甲醛咪唑溶液，酶溶液和硝酸镍溶液总的体系中酶含量为1-4mg/ml；所述反应温度为40～50℃，搅拌为磁力搅拌器转速为200～400rpm，反应时间为10～15h。
21.作为优选，离心转速为8000rpm，时间为6min。
22.其中，步骤(3)中所述酸性环境为浓度为0.2～2m，ph为4～6的tris-hcl溶液、柠檬酸溶液或者pbs溶液；所述米粒状复合材料为60～100mg；所述含ni的纤维素膜材料为5～10mg；所述dna浓度为10-15mmol/l，体积为200～500μl；所述自组装时间为10～60min，温度为常温。
23.作为优选，将复合催化材料颗粒与含ni的纤维素膜材料，置于酸性环境中，并加入dna，经过一段时间的后组装，使酶-金属有机框架复合催化材料固定在含ni的纤维素膜材料上，经超纯水三次洗涤后，得到酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜。
24.本发明所述由ni合成的酶-金属有机框架复合催化材料，以ni基于2-甲醛咪唑合成的mof材料作为载体，通过共沉淀的方法将酶包覆在其内部形成酶-金属有机框架复合催化材料，本发明首次将ni用于mof材料的合成过程。
25.本发明所述由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜在一种或多种生物酶的催化体系中的应用。
26.其中，所述应用包括用于产自假丝酵母的脂肪酶(crl)的水解反应及在油水混合体系下催化植物甾醇酯的酯化合成；壳聚糖酶(csn)和猪胰脂肪酶(ppl)水解大分子聚合物——壳聚糖；肝素合酶(pmhs2)合成肝素；天然酶葡萄糖氧化酶(gox)与纳米酶磁性纳米粒(mnp)的级联反应；蔗糖合酶(susy)与二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶溶液(udh)的双天然酶级联反应；n-乙酰氨基己糖1-位激酶(nahk)，尿苷转移酶(glmu)的双天然酶级联反应等；分别利用光谱，液质，核磁，液相，tlc点板等手段对酶活性测试结果进行表征，并计算出相对活性。
27.进一步地，所述的应用，包括如下步骤:
28.(1)将脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(crl-mof@bc)加入到棕榈酸对硝基苯酯溶液中进行脂肪酶的酯化水解反应，在金属浴中反应结束后离心取上清液，利用酶标仪在406nm处测定吸光度，并计算其相对活性。
29.(2)将脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(crl-mof@bc)加入到植物甾醇水溶液与酯化试剂油水混合溶液中进行酯化反应，在金属浴中反应结束后离心取上清液，通过液相定性定量检测生成的共轭亚油酸植物甾醇酯的含量，并计算其酯化效率和相对活性。
30.(3)将壳聚糖酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(csn-mof@bc)加入到壳聚糖反应液中进行壳聚糖的降解反应，在金属浴中反应结束后离心，在上清液中加入铁氰化钾溶液，在金属浴中反应结束后，立即用冰水浴冷却，离心后取上清液，利用酶标仪在420nm处测定吸光度，并计算其相对活性。
31.(4)将猪胰脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(ppl-mof@bc)加入到壳聚糖反应液中进行壳聚糖的降解反应，在金属浴中反应结束后离心，在上清液中加入铁氰化钾溶液，在金属浴中反应结束后，立即用冰水浴冷却，离心后取上清液，利用酶标仪在420nm处
测定吸光度，并计算其相对活性。
32.(5)将肝素合酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(pmhs2-mof@bc)加入到糖基供体(尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖)与糖基受体(对硝基苯基-β-d-葡萄糖醛酸)反应液中进行肝素二糖的合成反应，在金属浴中反应结束后离心取上清液，通过液相定性定量检测生成的肝素二糖的含量，并计算其相对活性。
33.(6)将葡萄糖氧化酶/磁性纳米粒-金属有机框架复合材料@纤维素膜(gox/mnp-mof@bc)加入到葡萄糖反应液中进行葡萄糖的检测反应，在金属浴中反应结束后离心取上清液，利用酶标仪在625nm处测定吸光度，并计算其相对活性。
34.(7)蔗糖合酶-二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(susy-udh-mof@bc)加入到合成糖基供体(尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖)的反应液中，所述反应液含atp、utp、单糖底物glcnac、mgcl2的tris-hcl缓冲液，在金属浴中反应结束后离心取上清液，通过液相定性定量检测生成的糖基供体的量，并计算其相对活性。
35.(8)n-乙酰氨基己糖1-位激酶-尿苷转移酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(nahk-glmu-mof@bc)加入到含有atp、utp、单糖底物glcnac(10mm)、mgcl2的tris-hcl缓冲液中，在金属浴中反应结束后离心取上清液，通过液相定性定量检测生成的糖核苷酸udp-glcnac，并计算其相对活性。
36.其中，步骤(1)中所述脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(crl-mof@bc)的质量为底物棕榈酸对硝基苯酯质量的10％，所述棕榈酸对硝基苯酯溶液的体积为0.8ml，浓度为200mm，所述金属浴温度为25～45℃，反应时间为15min，转速为600～800rpm，离心转速为8000rpm，时间为6min。
37.其中，步骤(2)中所述脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(crl-mof@bc)的质量为底物植物甾醇酯质量的10％，反应体系为0.5ml，含1mm的底物植物甾醇酯溶液与0.5ml的酯化试剂，金属浴温度为37～60℃，反应时间为36～50h，转速为600～800rpm。所述植物甾醇为豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇；酯化试剂为共轭亚油酸、亚麻酸、油酸，离心转速为8000rpm，时间为6min。所述液相反应中毛细管柱的型号为30cm
×
0.25mm
×
0.25μm，db-5，安捷伦)；注入色谱柱的样品为1μl，分流比为1:8～1:12；氦气流速为1.2～1.5ml/min；烘箱温度40～60℃加热1～4min，然后以10～18℃/min升至300～350℃并恒温保持2～4min；注射器温度，240～260℃；传输线温度，250℃；离子源温度240℃。
38.其中，步骤(3)中所述壳聚糖酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(csn-mof@bc)为底物壳聚糖质量的10％，所述壳聚糖反应液为1ml，0.3mm，壳聚糖降解的金属浴温度为40～60℃，反应时间为2～5h，加入铁氰化钾溶液后，反应温度为80～100℃，反应时间为10～30min，离心转速为8000rpm，时间为6min。
39.其中，步骤(4)中所述猪胰脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(ppl-mof@bc)为底物壳聚糖质量的10％，所述壳聚糖反应液为1ml，0.3mm，壳聚糖降解的金属浴温度为40～60℃，反应时间为2～5h，加入铁氰化钾溶液后，反应温度为80～100℃，反应时间为10～30min，离心转速为8000rpm，时间为6min。
40.其中，步骤(5)中所述肝素合酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(pmhs2-mof@bc)为底物糖基供体和受体质量的10％，所述底物为0.2ml，1mm糖基供体(尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖)，0.2ml，1mm糖基受体(对硝基苯基-β-d-葡萄糖醛酸)，金属浴温度为30～50
℃，反应时间为20～30h，转速为600～800rpm，离心转速为8000rpm，时间为6min。高效液相色谱条件：inertsil ods-3色谱柱(150mm
×
4.6mm，5μm)。流动相a为35mmol/l磷酸二氢钠缓冲液(磷酸调节ph至6.8)，流动相b为纯甲醇。样品盘温度25℃，色谱温度25℃。检测波长234nm，进样体积20μl。
41.其中，步骤(6)中所述葡萄糖氧化酶/磁性纳米粒-金属有机框架复合材料@纤维素膜(gox/mnp-mof@bc)为底物葡萄糖浓度的10％，所述葡萄糖反应液为0.4ml，10mm，金属浴温度为30～50℃，反应时间为10～30min，转速为600～800rpm，离心转速为8000rpm，时间为6min。
42.其中，步骤(7)中所述蔗糖合酶-二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(susy-udh-mof@bc)的质量为底物单糖质量的10％，反应液atp浓度为5～12mm，utp浓度为5～15mm，单糖底物glcnac浓度为10～15mm，所述溶剂为ph 7.5的100mm tris-hcl缓冲液，金属浴温度为20～40℃，反应时间为20～30h，转速为600～800rpm，离心转速为8000rpm，时间为6min。所述高效液相色谱条件：inertsil ods-3色谱柱(150mm
×
4.6mm，5μm)。流动相a为23mmol/l磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲液(磷酸调节ph至7.5)，流动相b为纯甲醇。样品盘温度25℃，色谱温度25℃。检测波长254nm，进样体积20μl。
43.其中，步骤(8)中所述n-乙酰氨基己糖1-位激酶-尿苷转移酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(nahk-glmu-mof@bc)的质量为底物单糖质量的10％，整个反应液中atp浓度为5～12mm，utp浓度为5～15mm，单糖底物glcnac浓度为10～15mm，溶剂为ph 7.5的100mm tris-hcl缓冲液，金属浴温度为20～40℃，反应时间为24～48h，转速为600～800rpm，离心转速为8000rpm，时间为2min。高效液相色谱条件：inertsil ods-3色谱柱(150mm
×
4.6mm，5μm)。流动相a为18mmol/l磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲液(磷酸调节ph至6.8)，流动相b为纯甲醇。样品盘温度25℃，色谱温度25℃。检测波长254nm，进样体积20μl。质谱检测糖核苷酸使用负离子模式。
44.具体地，本发明的制备优选包括四个部分：
45.第一部分:预处理的细菌纤维素膜
46.将购买的细菌纤维素膜用氢氧化钠溶液浸泡过夜，再用超纯水洗涤，直至纤维素膜的ph呈中性，并将其裁成长方体，浸泡在含ni的水溶液人中，形成含ni的纤维素膜。所述氢氧化钠溶液ph为9～12，浓度为1～5mm，所述反应时间为10～15h；所述裁成的纤维素膜大小为1cm
×
1cm
×
0.5cm的长方体。所述浸泡ni溶液的时间为10～15h。
47.第二部分:合成含ni的酶-金属有机框架复合催化材料(enzyme@mof)
48.将2-甲醛咪唑溶液，酶溶液，硝酸镍溶液混合，并置于磁力搅拌器上搅拌均匀，反应后得到含ni的酶-金属有机框架复合催化材料的反应液，离心后得到米粒状复合材料。所述2-甲醛咪唑溶液与硝酸镍溶液的浓度比为1:4～8:1，所述酶溶液分别为产自假丝酵母的脂肪酶溶液(crl)，壳聚糖酶溶液(csn)，猪胰脂肪酶溶液(ppl)，肝素合酶溶液(pmhs2)，葡萄糖氧化酶溶液(gox)，蔗糖合酶溶液(susy)，二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶溶液(udh)，n-乙酰氨基己糖1-位激酶(nahk)，尿苷转移酶(glmu)，所述反应温度为40～50℃，反应时间为10～15h，磁力搅拌器转速为200～400rpm。
49.第三部分:通过后处理合成由dna连接的麦穗状新型酶-金属有机框架复合材料@
纤维素膜
50.将所述含ni的细菌纤维素膜与含ni的酶-金属有机框架复合催化材料(enzyme@mof)置于酸性溶液中所述酸性环境为浓度为0.2～2mm，ph为2～7的tris-hcl溶液，柠檬酸溶液，pbs溶液，加入dna，所述dna是长度为6～20个脱氧核糖核苷酸，碱基种类为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶组成的单链dna，通过10～60min的后组装合成麦穗状酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜。
51.第四部分:酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜的实际应用。
52.将质量为底物质量10％所述酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜应用于产自假丝酵母的脂肪酶(crl)的水解反应及在油水混合体系下催化植物甾醇酯的酯化合成；壳聚糖酶(csn)和猪胰脂肪酶(ppl)水解大分子聚合物——壳聚糖；肝素合酶(pmhs2)合成肝素；天然酶葡萄糖氧化酶(gox)与纳米酶磁性纳米粒(mnp)的级联反应；蔗糖合酶(susy)与二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶溶液(udh)的双天然酶级联反应；n-乙酰氨基己糖1-位激酶(nahk)，尿苷转移酶(glmu)的双天然酶级联反应。
53.(1)将质量为底物质量10％的所述脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(crl@mof-bc)加入到棕榈酸对硝基苯酯溶液(0.8ml，200mm)中进行脂肪酶的酯化水解反应，在金属浴中反应，金属浴温度为25～45℃，反应时间为15min，转速为600～800rpm，待结束后离心取上清液，离心转速为8000rpm，时间为6min，利用酶标仪在406nm处测定吸光度，进而计算相对活性。
54.(2)将质量为底物质量10％的所述脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(crl@mof-bc)加入到0.5ml，1mm植物甾醇水溶液与0.5ml酯化试剂油水混合溶液中进行酯化反应，所述植物甾醇为豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇；酯化试剂为共轭亚油酸、亚麻酸、油酸。在金属浴中反应，金属浴温度为37～60℃，反应时间为36～50h，转速为600～800rpm。待结束后离心取上清液，离心转速为8000rpm，时间为6min。通过液相定性定量检测生成的共轭亚油酸植物甾醇酯的含量。进而计算酯化效率和相对活性。所述液相反应中毛细管柱的型号为30m
×
0.25mm
×
0.25μm，db-5，安捷伦)；注入色谱柱的样品为1μl，分流比为1:8～1:12；氦气流速为1.2～1.5ml/min；烘箱温度40～60℃加热1～4min，然后以10～18℃/min升至300～350℃并恒温保持2～4min；注射器温度，240～260℃；传输线温度，250℃；离子源温度240℃。
55.(3)将质量为底物质量10％所述壳聚糖酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(csn@mof-bc)加入到1ml，0.3mm壳聚糖反应液中进行壳聚糖的降解反应，在金属浴中反应，金属浴温度为40～60℃，反应时间为2～5h。待反应结束后离心，离心转速为8000rpm，时间为6min。在上清液中加入铁氰化钾溶液，在金属浴中反应，反应温度为80～100℃，反应时间为10～30min，待反应结束后，立即用冰水浴冷却，离心取上清液，离心转速为8000rpm，时间为6min，利用酶标仪在420nm处测定吸光度，进而计算相对活性。
56.(4)将质量为底物质量10％的所述猪胰脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(ppl@mof-bc)加入到1ml，0.3mm壳聚糖反应液中进行壳聚糖的降解反应，在金属浴中反应，金属浴温度为40～60℃，反应时间为2～5h。待结束后离心，离心转速为8000rpm，时间为6min。在上清液中加入铁氰化钾溶液，在金属浴中反应，反应温度为80～100℃，反应时间为10～30min，待反应结束后，立即用冰水浴冷却，离心取上清液，离心转速为8000rpm，时间为
6min。利用酶标仪在420nm处测定吸光度，进而计算相对活性。
57.(5)将质量为底物质量10％的所述肝素合酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(pmhs2@mof-bc)加入到0.2ml，1mm糖基供体(尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖)，0.2ml，1mm糖基受体(对硝基苯基-β-d-葡萄糖醛酸)反应液中进行肝素二糖的合成反应，在金属浴中反应，金属浴温度为30～50℃，反应时间为20～30h，转速为600～800rpm。待反应结束后离心取上清液，离心转速为8000rpm，时间为6min，通过液相定性定量检测生成的肝素二糖的含量。高效液相色谱条件：inertsil ods-3色谱柱(150mm
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4.6mm，5μm)。流动相a为35mmol/l磷酸二氢钠缓冲液(磷酸调节ph至6.8)，流动相b为纯甲醇。样品盘温度25℃，色谱温度25℃。检测波长234nm，进样体积20μl。
58.(6)将质量为底物质量10％的所述葡萄糖氧化酶/磁性纳米粒-金属有机框架复合材料@纤维素膜(gox/mnp@mof-bc)加入到0.4ml，10mm葡萄糖反应液中进行葡萄糖的检测反应，在金属浴中反应，金属浴温度为30～50℃，反应时间为10～30min，转速为600～800rpm。待反应结束后离心取上清液，离心转速为8000rpm，时间为6min，利用酶标仪在625nm处测定吸光度，进而计算相对活性。
59.(7)将质量为底物质量10％的所述蔗糖合酶-二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(susy-udh-mof@bc)加入到0.2ml，1mm合成糖基供体(尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖)的反应液中，所述反应液为atp(10mm)、utp(10mm)、单糖底物glcnac(10mm)、mgcl2(2mm)溶剂ph为7.5的100mm tris-hcl缓冲液，在金属浴中反应，金属浴温度为20～40℃，反应时间为20～30h，转速为600～800rpm。待反应结束后离心取上清液，离心转速为8000rpm，时间为6min，通过液相定性定量检测生成的糖基供体的含量。所述高效液相色谱条件：inertsil ods-3色谱柱(150mm
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4.6mm，5μm)。流动相a为23mmol/l磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲液(磷酸调节ph至7.5)，流动相b为纯甲醇。样品盘温度25℃，色谱温度25℃。检测波长254nm，进样体积20μl。10～18℃/min升至300～350℃并恒温保持2～4min；注射器温度，240～260℃；传输线温度，250℃；离子源温度240℃。
60.(8)将质量为底物质量10％的n-乙酰氨基己糖1-位激酶-尿苷转移酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(nahk-glmu-mof@bc)加入到atp(10mm)、utp(10mm)、单糖底物glcnac(10mm)、mgcl2(2mm)溶剂ph为7.5的100mm tris-hcl缓冲液中，37℃反应36h。通过高效液相色谱和质谱对糖基供体(尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖)行检测。高效液相色谱条件：inertsil ods-3色谱柱(150mm
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4.6mm，5μm)。流动相a为18mmol/l磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲液(磷酸调节ph至6.8)，流动相b为纯甲醇。样品盘温度25℃，色谱温度25℃。检测波长254nm，进样体积20μl。质谱检测糖核苷酸使用负离子模式。
61.采用上述组合工艺，将酶固定在由ni合成的一种新型金属有机框架中，使得环境对酶的影响减小，增强了酶的机械性能，提高操作稳定性，同时，该由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜也可用于多种酶的催化体系。进而通过后处理的方式，利用dna将酶-金属有机框架复合催化材料固定在细菌纤维素膜上。本发明所制备的酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜能高效的发挥生物酶的活性；继承了酶-mof材料比表面积大，化学性质稳定等优点；简化了下游的分离回收步骤，降低了酶-金属有机框架崩解的概率，提高酶的催化效率和回收利用率，对环境的污染小，降低酶催化反应成本。该系统具有可操作性，连续性，实际应用便捷性。
62.本发明的创新点在于：1)以一种温和的方式合成了一种新型含ni的金属有机框架材料，并将其应用于酶的固定化中，发现其具有较高的酶催化活性，酶的机械性能，热稳定性，有机溶剂稳定性，储存稳定性都得到了提高，同时ni与dna的结合能力很强，并优于其他金属。2)以纤维素膜作为载体，原材料成本低，处理过程简单。3)以dna为连接剂，在酸性环境下通过后组装合成麦穗状酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜。处理过程简单，合成条件温和，原材料成本低，实现了在细菌纤维素中酶-金属有机框架复合催化材料的富集，简化了下游的分离回收步骤，降低了酶-金属有机框架崩解的几率，提高酶的催化效率和回收利用率，这也是本发明但首次实现dna作为连接剂，连接mof和另一个载体(纤维素膜)，并且效果显著。4)该dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜可适用于多种生物酶的催化体系，可提高酶的稳定性，重复利用率，可操作性，连续性，实际应用便捷性。5)将酶@mof固定在bc上，不需要离心就能分离回收利用，将mof大量均匀，分散地固定在膜上，减少mof聚集的可能；利用dna链接制备了新的含ni的mof。6)该体系(酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜)适用于多种酶反应体系。
63.本发明使用的含ni的金属有机框架材料(mof)，是一种以ni为连接点，有机配体为支撑，通过金属离子和有机配体之间通过自组装形成的具有二维或三维晶体结构。将其应用于酶的固定化中，合成酶-金属有机框架材料复合物(enzyme@mof)。通过后组装的方式利用dna将酶-金属有机框架复合催化材料与纤维素膜进行连接，形成酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜。该体系的优点在于:具有较高的酶催化活性，酶的机械性能，热稳定性，ph稳定性，有机溶剂稳定性，储存稳定性都得到了提高；酶-mof材料复合材料的比表面积大，有利于酶的催化反应；相较于传统的mof材料，酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜系统能简化后续的分离回收操作，同时能减少mof材料因离心分离造成的崩解，保证酶的结构稳定性，实现后续的循环利用，进而降低成本。此发明制备的复合膜可适用于多种生物酶的催化体系，从而提高系统的稳定性，重复利用率，可操作性，连续性，实际应用便捷性。
64.本发明是以由ni合成的一种新型金属有机框架作为固定化材料，分别将脂肪酶、葡萄糖氧化酶、糖酶等生物酶利用原位合成的固定化方式固定在其内部，制备得到酶-金属有机框架复合催化材料。再利用dna将酶-金属有机框架复合催化材料固定在细菌纤维素膜上，实现复合材料均匀、稳定、大量的富集在纤维素膜上，并将酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜应用于不同生物酶的催化反应中。本发明所制备的酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜能够控制纳米颗粒的生长、颗粒大小及分布的均匀性等，从而在保证酶活性的情况下实现膜上材料的富集。使用此发明制备的复合膜可适用于多种生物酶的催化体系，从而提高系统的稳定性，重复利用率，可操作性，连续性，实际应用便捷性。
65.本发明提供了一种由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜，其中新型酶-金属有机框架复合材料是由ni合成的酶-金属有机框架复合催化材料(enzyme@metal organic framework)，这是有报道以来首次将ni用于mof材料的合成过程中。本发明中的dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜，具有生物酶绿色环保，高效催化的特点；还继承了酶-mof材料比表面积大，拥有良好的化学稳定性等优点；相较于传统的mof材料，酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜系统能简化后续的分离回收操作，同时能减少mof材料因离心分离造成的崩解，保证酶的结构稳定性，实现后续的循环利用，进而降低成本。
66.生物酶是一种绿色高效的生物催化剂，但酶易受温度、ph、大部分有机溶剂和抑制剂等外界因素的影响，化学稳定性及热稳定性差、容易失活、分离纯化困难、成本高、普适性差。mof材料是一个理想的保护酶的材料，但酶@mof复合材料的分散性不高，易堆积，且需要通过离心才能进行回收利用。本发明中的酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜，可以实现酶@mof在纤维素膜上大量均匀的分布，复合材料之间不会产生堆积，且在分离纯化时只需将膜用镊子从反应液中取出，达到与底物分开的目的，就能实现材料的分离，有效方便了下游的分离回收，且避免了离心过程对酶造成的影响。此外，通过后续优化实验，如dna连接剂的长度，种类，浓度，后处理时间等，可以发现在非优化体系下，其整体活性不好，主要是由于颗粒堆积或者少量附着导致，影响了传质和酶活性。
67.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
68.1、本发明制备的含ni的金属有机框架材料，是首次发现将ni应用于mof材料的合成过程中，其具有高孔隙率、高比表面积、结构可调控。在对酶进行固定化之后，可极大程度的保持酶原有的高效、温和及专一的酶催化活性，同时克服了游离酶的不足，使酶的存储稳定性提高，易于后续回收，简化复合催化材料回收步骤、提高重复利用率，并且降低反应成本。
69.2、本发明通过后处理的方式，以dna为连接剂，酶-金属有机框架复合催化材料与纤维素膜进行连接，形成酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜。相较于传统的mof材料，酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜系统能简化后续的分离回收操作，同时能减少mof材料因离心分离造成的崩解，保证酶的结构稳定性，实现后续的循环利用，进而降低成本。
70.3、该dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜可以应用于多种酶催化系统，例如产自假丝酵母的脂肪酶溶液(crl)，壳聚糖酶溶液(csn)，猪胰脂肪酶溶液(ppl)，肝素合酶溶液(pmhs2)，葡萄糖氧化酶溶液(gox)，蔗糖合酶溶液(susy)，二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶溶液(udh)，n-乙酰氨基己糖1-位激酶(nahk)，尿苷转移酶(glmu)。表明该体系具有良好的生物适应性，可操作性，连续性。
71.4、本发明制备简单，实验条件温和，原料来源广泛，成本低，该dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜继承了良好的酶活性，环境友好性，同时也减少了下游的分离回收步骤，可广泛应用于工业生产。
附图说明
72.图1为不同比例框架(ni：ica)的酶-mof的相对催化活性示意图；
73.图2为不同酸溶液对后处理酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜影响的相对活性示意图；
74.图3为不同ph酸溶液对后处理酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜影响的相对活性示意图；
75.图4为不同长度dna对后处理酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜影响的相对活性示意图。
76.图5为不同dna种类对后处理酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜影响的相对活性示意图
77.图6为不同后处理时间对酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜的相对活性的影响
示意图；
78.图7为crl@mof-bc的温度稳定性测试示意图；
79.图8为crl@mof-bc的温度稳定性测试示意图；
80.图9为crl@mof-bc的循环利用稳定性测试示意图；
81.图10为实验过程中涉及到的反应的反应式；
82.图11为酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜中不同的酶的相对活性示意图；
83.图12为pmhs2@mof-bc反应的tlc点板图。
具体实施方式
84.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
85.下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。其中，产自假丝酵母的脂肪酶(crl)，壳聚糖酶(csn)，猪胰脂肪酶(ppl)，葡萄糖氧化酶(gox)(购买于sigma公司)；糖基转移酶pmhs2(购自青岛糖科学生物技术有限公司)，n-乙酰氨基己糖1-位激酶nahk(anc68241.1)、尿苷转移酶glmu(aco75977.1)，蔗糖合酶溶液susy(at5g20830)，二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶溶液udh(at3g29360)根据ncbi上序列人工合成或者市售获得；豆甾醇、b-谷甾醇、菜油甾醇，葡萄糖，糖基供体(尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖)，糖基受体(对硝基苯基-β-d-葡萄糖醛酸)，单糖底物glcnac，壳聚糖，atp、utp(购买于阿拉丁试剂有限公司)，共轭亚油酸、亚麻酸、油酸(购买于国药集团化学试剂有限公司)；咪唑-2-甲醛(2-甲醛咪唑，购买于阿拉丁试剂有限公司)、nickel nitrate hexahydrate(六水合硝酸镍，购买于阿拉丁试剂有限公司)；细菌纤维素膜为常规市售均可，本发明实施例采用32cm
×
23cm
×
0.3cm细菌纤维素膜(购买于海南亿德食品有限公司)。
86.实施例1
87.合成由dna连接的麦穗状新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜
88.1)细菌纤维素膜的预处理：将购买的细菌纤维素膜用ph 9，浓度为1mm的氢氧化钠溶液浸泡12h，再用超纯水洗涤，直至纤维素膜的ph呈中性，将其裁成大小为1cm
×
1cm
×
0.5cm的方体，并将其浸泡在浓度为1mol/ml，体积为10ml的六水合硝酸镍溶液中8h，形成含ni的纤维素膜。取出后水洗三次，冷冻干燥备用。
89.2)合成含ni的酶-金属有机框架复合催化材料(enzyme@mof)
90.将1ml，1mmol/l的2-甲醛咪唑溶液，1ml，2mg/ml的酶溶液，1ml，1mmol/l六水合硝酸镍溶液混合混匀，酶溶液分别为产自假丝酵母的脂肪酶溶液(crl)，壳聚糖酶溶液(csn)，猪胰脂肪酶溶液(ppl)，肝素合酶溶液(pmhs2)，葡萄糖氧化酶溶液(gox)，蔗糖合酶溶液(susy)，二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶溶液(udh)，n-乙酰氨基己糖1-位激酶(nahk)，尿苷转移酶(glmu)中的一种或几种，并置于磁力搅拌器上搅拌均匀，温度为45℃，反应时间为12h，磁力搅拌器转速为300rpm。反应后得到含ni的酶-金属有机框架复合催化材料的反应液，离心并洗涤(8000rpm，6min)后得到米粒状复合材料。
91.按上述方法，调节2-甲醛咪唑与硝酸镍的摩尔比，分别测定，上述2-甲醛咪唑与硝酸镍的摩尔比为1:4～8:1的效果。
92.以产自假丝酵母的脂肪酶(crl)为模板酶对体系进行优化，将质量为底物质量10％的复合材料加入到棕榈酸对硝基苯酯溶液(0.8ml，200mm)中进行脂肪酶的酯化水解反应，在金属浴中反应，金属浴温度为30℃，反应时间为15min，转速为700rpm，待反应结束后离心(8 000rpm，2min)取上清液，利用酶标仪在406nm处测定吸光度，计算其相对活性。将同组别最佳活性组的相对活性设为100％。活性结果如图1所示，当2-甲醛咪唑与硝酸镍的摩尔比例为4:1时，合成的终产物crl@mof-bc具有最佳活性。以2-甲醛咪唑与硝酸镍的摩尔比例为4:1制备的含ni的酶-金属有机框架复合催化材料进行后续实验。
93.3)通过后处理合成由dna连接的麦穗状新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜，具体过程如下：
94.将步骤1)中的5mg含ni的细菌纤维素膜与步骤2)中的60mg含ni的酶-金属有机框架复合催化材料(enzyme@mof)置于酸性溶液中(含ni的酶-金属有机框架复合催化材料为步骤2)得到的最优crl@mof-bc)，加入dna，经过自组装，使酶-金属有机框架复合催化材料固定在含ni的纤维素膜材料上，经超纯水三次洗涤后，干燥得到酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜。以产自假丝酵母的脂肪酶(crl)为模板酶对体系进行优化，将同组别最佳活性组的相对活性设为100％。
95.首先对体系的后处理酸环境进行优化，在ph为4，浓度为1mol/l，体积为1ml三种溶液体系tris-hcl，柠檬酸溶液，pbs溶液进行优化，其中使用10mmol/l，500μl长度为12个腺嘌呤(12a)组成的单链dna作为连接剂；常温下后处理(即自组装)时间为30min，活性结果如图2，当酸环境为柠檬酸溶液时，体系出现最佳活性；
96.在浓度为1mol/l，体积为1ml的柠檬酸溶液中，对酸环境ph(2-7)进行优化，其中使用10mmol/l，500μl长度为12个腺嘌呤(12a)组成的单链dna作为连接剂；常温下后处理(即自组装)时间为30min，活性结果如图3，当酸环境ph为4时体系出现最佳活性。
97.再对dna和后处理时间进行优化，dna是长度为6～20个脱氧核糖核苷酸，碱基种类为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶组成的单链dna；室温自组装时间为10～60min的效果。在最适后处理酸环境(ph 4，浓度为1mol/l，体积为1ml的柠檬酸溶液)，常温下后处理时间为30min的条件下，优化dna的种类和长度，结果如图4，图5所示，当使用10mmol/l，500μl长度为12个腺嘌呤(12a)组成的单链dna作为连接剂时，体系展现出最佳活性，图4所示，当不加入dna时，体系的相对活性不足40％，说明dna充当了重要的连接作用。在最适后处理酸环境，最适dna的种类和长度的条件下，再优化了后处理时间，结果如图6的结果显示，当后处理(即自组装)时间为40min时，体系展现出最佳活性。
98.本发明采用脂肪酶为模板，均按上述最优参数合成脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(crl-mof@bc)，并进行酶的活性测试，即后处理酸环境为ph 4，浓度为1mol/l，体积为1ml的柠檬酸溶液，使用10mmol/l，500μl长度为12个腺嘌呤(12a)组成的单链dna作为连接剂；常温下后处理(即自组装)时间为40min时组成的脂肪酶@mof-bc体系。
99.其他材料均按上述最优条件合成：壳聚糖酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(csn-mof@bc)，猪胰脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(ppl-mof@bc)，肝素合酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(pmhs2-mof@bc)，葡萄糖氧化酶/磁性纳米粒-金属有机框架复合材料@纤维素膜(gox/mnp-mof@bc)，蔗糖合酶-二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(susy-udh-mof@bc)，n-乙酰氨基己糖1-位激酶-尿苷转移酶-金
属有机框架复合材料@纤维素膜(nahk-glmu-mof@bc)。
100.实施例2
101.酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(enzyme-mof@bc)的稳定性测试按实施例1中最优的方法制备酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(enzyme@mof-bc)，以产自假丝酵母的脂肪酶(crl)为模板酶对体系进行稳定性测试，将质量为底物(棕榈酸对硝基苯酯)质量10％的脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(crl@mof-bc)和游离脂肪酶(crl)分别加入到棕榈酸对硝基苯酯溶液(0.8ml，200mm)中进行脂肪酶的酯化水解反应，在金属浴中反应，金属浴温度为30℃，反应时间为15min，转速为700rpm，待反应结束后离心(8 000rpm，2min)取上清液，利用酶标仪在406nm处测定吸光度，计算其相对活性。将同组别最佳活性组的相对活性设为100％。分别测定脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(crl@mof-bc)在不同温度(30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，ph 7)，不同ph(ph 3，4，5，6，7，8，9，10，11，40℃)和循环利用稳定性(ph 7,40℃，利用镊子将脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(crl@mof-bc)从反应体系中取出，水洗三遍，投入新的反应液中，进行下一轮循环利用稳定性测试)。温度稳定性结果如图7所示，相比于游离脂肪酶，crl@mof-bc在30℃～80℃中均保持良好的稳定性，其中，当温度为40℃时展现出最佳活性，与游离酶最佳活性温度一致。ph稳定性结果如图8所示，相比于游离脂肪酶，crl@mof-bc在ph 3～ph 11中均保持良好的稳定性，其中，当ph为7时展现出最佳活性，与游离酶最佳活性ph一致。循环利用稳定性如图9所示，crl@mof-bc循环利用七次之后，仍保留高于80％的相对活性。
102.实施例3
103.脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(crl@mof-bc)的实际应用(水解反应)
104.按实施例1中最优的方法制备脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(crl@mof-bc)，将质量为底物质量10％的脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(crl@mof-bc)和游离脂肪酶(crl)分别加入到棕榈酸对硝基苯酯溶液(0.8ml，200mm)中进行脂肪酶的酯化水解反应，在金属浴中反应，金属浴温度为30℃，反应时间为15min，转速为700rpm，待反应结束后离心(8000rpm，2min)取上清液，利用酶标仪在406nm处测定吸光度，计算其相对活性。以游离酶活性为100％计算其相对活性，具体反应过程如图10a所示，反应，结果如图11所示，crl@mof-bc保留了90％的游离酶活性。进一步证明本发明制备的复合材料不仅能为酶提供保护作用，也能很好的发挥酶活性，方便后期分离纯化，同时证明体系能很大程度的保留酶活性。
105.实施例4
106.脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(crl@mof-bc)的实际应用(酯化反应)
107.按实施例1中最优的方法制备脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(crl@mof-bc)，将质量为底物质量10％的脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(crl@mof-bc)和游离脂肪酶(crl)分别加入到0.5ml，1mm植物甾醇水溶液与0.5ml的酯化试剂油水混合溶液中进行酯化反应，所述植物甾醇为豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇；酯化试剂为共轭亚油酸、亚麻酸、油酸。在金属浴中反应，金属浴温度为60℃，反应时间为48h，转速为700rpm。待反应结束后离心(8000rpm，2min)取上清液，通过液相定性定量检测生成的共轭亚油酸植物甾醇酯的含量，计算酯化效率和相对活性，具体反应过程如图10b所示。液相反应中毛细管柱的型号为30m
×
0.25mm
×
0.25μm，db-5，安捷伦)；注入色谱柱的样品为1μl，分流比为1:
10；氦气流速为1.2ml/min；烘箱温度50℃加热4min，然后以15℃/min升至320℃并恒温保持3min；注射器温度为250℃；传输线温度，250℃；离子源温度240℃。
108.其中采用豆甾醇与共轭亚油酸，亚麻酸，油酸酯化反应的质谱结果显示，m/z为675，673，677时出峰，表明豆甾醇共轭亚油酸酯，豆甾醇亚麻酸酯，豆甾醇油酸酯的生成；β-谷甾醇与共轭亚油酸，亚麻酸，油酸酯化反应的质谱结果显示，m/z为677，675，679时出峰，表明β-谷甾醇共轭亚油酸酯，β-谷甾醇亚麻酸酯，β-谷甾醇油酸酯的生成；菜油甾醇与共轭亚油酸，亚麻酸，油酸酯化反应的质谱结果显示，m/z为663，661，665时出峰，表明菜油甾醇共轭亚油酸酯，菜油甾醇亚麻酸酯，菜油甾醇油酸酯的生成。
109.实施例5
110.壳聚糖酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(csn@mof-bc)的实际应用按实施例1中最优的方法制备壳聚糖酶-金属有机框架复合材料@纤维素(csn@mof-bc)，将质量为底物(壳聚糖)质量10％的壳聚糖酶-金属有机框架复合材料@纤维素(csn@mof-bc)加入到壳聚糖反应液(1ml，0.3mm)中进行壳聚糖的降解反应，在金属浴中反应，金属浴温度为50℃，反应时间为2h。结束后离心，在上清液中加入1m，500μl铁氰化钾溶液，在金属浴中反应，反应温度为90℃，反应时间为20min，待反应结束后，立即用冰水浴冷却，再离心(8000rpm，2min)取上清液，利用酶标仪在420nm处测定吸光度，进而计算相对活性。以游离酶活性为100％计算其相对活性，具体反应过程如图10c所示，反应结果如图11所示，csn@mof-bc保留了88％的游离酶活性。
111.实施例6
112.猪胰脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(ppl@mof-bc)的实际应用
113.按实施例1中最优的方法制备猪胰脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(ppl@mof-bc)，将质量为底物(壳聚糖)质量10％的猪胰脂肪酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(ppl@mof-bc)加入到壳聚糖反应液(1ml，0.3mm)中进行壳聚糖的降解反应，在金属浴中反应，金属浴温度为50℃，反应时间为2h。结束后离心，在上清液中加入1m，500μl铁氰化钾溶液，在金属浴中反应，反应温度为90℃，反应时间为20min，待反应结束后，立即用冰水浴冷却，再离心(8000rpm，2min)取上清液，利用酶标仪在420nm处测定吸光度，进而计算相对活性。以游离酶活性为100％计算其相对活性，具体反应过程如图10c所示，反应结果如图11所示，ppl@mof-bc保留了92％的游离酶活性。
114.实施例7
115.肝素合酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(pmhs2@mof-bc)的实际应用
116.按实施例1中最优的方法制备肝素合酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(pmhs2@mof-bc)，将质量为底物(糖基供体和受体)质量10％的肝素合酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(pmhs2@mof-bc)加入到0.2ml，1mm糖基供体(尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖)，0.2ml，1mm糖基受体(对硝基苯基-β-d-葡萄糖醛酸)中进行肝素二糖的合成反应，在金属浴中反应，金属浴温度为40℃，反应时间为25h，转速为700rpm。待反应结束后离心(8000rpm，2min)取上清液，通过液相定性定量检测生成的肝素的含量，具体反应过程如图10d。高效液相色谱条件：inertsil ods-3色谱柱(150mm
×
4.6mm，5μm)。流动相a为35mmol/l磷酸二氢钠缓冲液(磷酸调节ph至6.8)，流动相b为纯甲醇。样品盘温度25℃，色谱温度25℃。检测波长234nm，进样体积20μl。以游离酶活性为100％计算其相对活性，反应结果如图
11所示，pmhs2@mof-bc保留了96％的游离酶活性。其活性结果tlc点板如图9所示，反应进行24h后pmhs2游离酶，pmhs2@mof-bc的tlc板上出现明显的产物点，进一步证明本发明制备的材料和体系可以用于易失活的糖酶。
117.实施例8
118.葡萄糖氧化酶/磁性纳米粒-金属有机框架复合材料@纤维素膜(gox/mnp@mof-bc)的实际应用
119.按实施例1中最优的方法制备葡萄糖氧化酶/磁性纳米粒-金属有机框架复合材料@纤维素膜，将质量为底物(葡萄糖)质量10％的葡萄糖氧化酶/磁性纳米粒-金属有机框架复合材料@纤维素膜(gox/mnp@mof-bc)加入到葡萄糖反应液中进行葡萄糖(0.4ml，10mm)的检测反应，在金属浴中反应，金属浴温度为40℃，反应时间为15min，转速为700rpm。待反应结束后离心(8000rpm，2min)取上清液，利用酶标仪在625nm处测定吸光度，进而计算相对活性。以游离酶活性为100％计算其相对活性，具体反应过程如图10e所示，反应结果如图11所示，gox/mnp@mof-bc保留了89％的游离酶活性。
120.实施例9
121.蔗糖合酶-二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(susy-udh-mof@bc)的实际应用
122.按实施例1中最优的方法制备蔗糖合酶-二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(susy-udh-mof@bc)，将质量为底物(单糖)质量10％的蔗糖合酶-二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(susy-udh-mof@bc)加入到反应液中，反应液为atp(10mm)、utp(10mm)、单糖底物glcnac(10mm)、mgcl2(2mm)，溶剂ph为7.5的100mm tris-hcl缓冲液，在金属浴中反应，金属浴温度为30℃，反应时间为25h，转速为700rpm。待反应结束后离心(8000rpm，2min)取上清液，通过液相定性定量检测生成的糖基供体的含量。高效液相色谱条件：inertsil ods-3色谱柱(150mm
×
4.6mm，5μm)。流动相a为23mmol/l磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲液(磷酸调节ph至7.5)，流动相b为纯甲醇。样品盘温度25℃，色谱温度25℃。检测波长254nm，进样体积20μl。以游离酶活性为100％计算其相对活性，具体反应过程如图10f所示，反应结果如图11所示，susy-udh-mof@bc保留了88％的游离酶活性。
123.实施例10
124.n-乙酰氨基己糖1-位激酶-尿苷转移酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(nahk-glmu-mof@bc)的实际应用
125.按实施例1中最优的方法制备n-乙酰氨基己糖1-位激酶-尿苷转移酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(nahk-glmu-mof@bc)，将质量为底物(单糖)质量10％的n-乙酰氨基己糖1-位激酶-尿苷转移酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜(nahk-glmu-mof@bc)加入到含atp(10mm)、utp(10mm)、单糖底物glcnac(10mm)、mgcl2(2mm)溶剂ph为7.5的100mm tris-hcl缓冲液中(上述为整个反应液)，37℃反应36h。通过高效液相色谱和质谱对糖基供体行检测。高效液相色谱条件：inertsil ods-3色谱柱(150mm
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4.6mm，5μm)。流动相a为18mmol/l磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲液(磷酸调节ph至6.8)，流动相b为纯甲醇。样品盘温度25℃，色谱温度25℃。检测波长254nm，进样体积20μl。质谱检测糖核苷酸使用负离子模式。以游离酶活性为100％计算其相对活性，具体反应过程如图10e所示，生成了糖核苷
酸udp-glcnac，证明本发明制备的复合材料和体系可应用于双酶级联反应；反应结果如图11所示，nahk-glmu-mof@bc保留了86％的游离酶活性。
126.糖核苷酸udp-glcnac核磁共振氢谱结果：1h nmr(400mhz，d2o)δ7.97(d，j＝7.9hz，1h)，5.98(dd，j＝8.1，6.4hz，2h)，5.53(dd，j＝7.1，3.2hz，1h)，4.35-4.36(m，2h)，4.31-4.42(m，1h)，4.25(ddd，j＝11.5，4.4，2.3hz，1h)，4.20(ddd，j＝11.5，5.4，3.2hz，1h)，4.00(dt，j＝10.3，3.0hz，1h)，3.94(ddd，j＝10.7，4.4，2.3 hz，1h)，3.93-3.96(m，1h)，3.84
ꢀ‑
3.80(m，2h)，3.56(dd，j＝10.0，9.3 hz，1h)，2.09(s，3h)。

技术特征：
1.一种由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜，其特征在于，包括载体细菌纤维素膜，由ni合成的酶-金属有机框架复合催化材料，连接剂dna，由dna将ni合成的酶-金属有机框架复合催化材料固定在细菌纤维素膜上形成；所述ni合成的酶-金属有机框架复合催化材料是以ni基合成的mof材料作为载体，将酶包覆在其内部形成酶-金属有机框架复合催化材料。2.根据权利要求1所述的由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜，其特征在于，所述载体细菌纤维素膜厚度为0.3～0.8cm；所述ni合成的酶-金属有机框架复合催化材料直径为50～500nm，所述由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜为麦穗状酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜。3.根据权利要求1所述的由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜，其特征在于，所述dna是长度为6～20个脱氧核糖核苷酸，碱基种类为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶组成的单链dna。4.根据权利要求1所述的由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜，其特征在于，所述酶优选包括产自假丝酵母的脂肪酶(crl)，壳聚糖酶(csn)，猪胰脂肪酶(ppl)，肝素合酶(pmhs2)，葡萄糖氧化酶(gox)，蔗糖合酶(susy)，二磷酸尿苷-6-葡萄糖脱氢酶(udh)，n-乙酰氨基己糖1-位激酶(nahk)，尿苷转移酶(glmu)中的一种或者多种。5.一种权利要求1所述的由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将细菌纤维素膜用碱溶液浸泡，再洗涤至中性，浸泡在含ni的水溶液中，形成含ni的纤维素膜；(2)将2-甲醛咪唑溶液，酶溶液，硝酸镍溶液混合搅拌反应后得到含ni的酶-金属有机框架复合催化材料的反应液，离心后得到米粒状复合材料；(3)将米粒状复合材料与含ni的纤维素膜材料，置于酸性环境中，并加入dna，经过自组装得到酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述碱溶液为氢氧化钠溶液ph为9～12，浓度为1～5mm，浸泡时间为10～15h。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中2-甲醛咪唑与硝酸镍的摩尔比为1:4～8:1，所述2-甲醛咪唑溶液，酶溶液，硝酸镍溶液体系中酶含量为1～4mg/ml，所述反应温度为40～50℃，搅拌为磁力搅拌器转速为200～400rpm，反应时间为10～15h。8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述酸性环境为浓度为0.2～2m，ph为4～6的tris-hcl溶液、柠檬酸溶液或者pbs溶液所述米粒状复合材料为60～100mg；所述含ni的纤维素膜材料为5～10mg；所述dna浓度为10-15mmol/l，体积为200～500μl；所述自组装时间为10～60min，温度为常温。9.一种权利要求1所述由dna连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜在一种或多种生物酶的催化体系中的应用。10.一种由ni合成的酶-金属有机框架复合催化材料，其特征在于，以ni基于2-甲醛咪唑合成的mof材料作为载体，通过共沉淀的方法将酶包覆在其内部形成酶-金属有机框架复合催化材料。

技术总结
本发明公开了一种由DNA连接的新型酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜及其制备方法和应用，由Ni合成新型金属有机框架作为固定化材料，将生物酶利用原位合成的固定化方式固定在其内部，制备得到酶-金属有机框架复合催化材料，再利用DNA将酶-金属有机框架复合催化材料固定在细菌纤维素膜上，实现复合材料均匀、稳定、大量的富集在纤维素膜上，并将酶-金属有机框架复合材料@纤维素膜应用于不同生物酶的催化反应中。本发明所制备复合膜能够控制纳米颗粒的生长、颗粒大小及分布的均匀性等，从而在保证酶活性的情况下实现膜上材料的富集，并可适用于多种生物酶的催化体系，提高系统稳定性，重复利用率，可操作性，连续性，实际应用便捷性。捷性。捷性。


技术研发人员：张幸 高婉柠 郑洁 李昺之
受保护的技术使用者：南京师范大学
技术研发日：2023.06.13
技术公布日：2023/8/31