一种包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德纳米前药的制备方法

hypothermia[j].journal of neurochemistry.2022,160(1):128-144.
[0009]
[4]feil k,matusevicius m,herzberg m,et al.minor stroke in large vessel occlusion:a matched analysis of patients from the german stroke registry
–
endovascular treatment(gsr-et)and patients from the safe implementation of treatments in stroke
–
international stroke thrombolysis register(sits-istr)[j].european journal of neurology.2022,29(6):1619-1629.
[0010]
[5]kong j,chu r,wang y.neuroprotective treatments for ischemic stroke:opportunities fornanotechnology[j].advanced functional materials.2022,32(52):2209405.
[0011]
[6]陈玮，徐钲沛，苏刚，等.缺血性脑卒中后m1表型小胶质细胞激活相关信号通路的研究进展[j].山东医药.2022,62(13):85-90.
[0012]
[7]zhang l j,zhou h s,wang s y,et al.changes in microglia during drug treatment of stroke[j].ibrain.2022,8(2):227-240.
[0013]
[8]nishihara h,maeda t,sano y,et al.fingolimod promotes blood
–
nerve barrier properties in vitro[j].brain andbehavior.2018,8(4):e924.
[0014]
[9]egom e ea,ke y,musah,et al.fty720 prevents ischemia/reperfusion injury-associated arrhythmias in an ex vivo rat heart model via activation of pak1/akt signaling[j].journal of molecular and cellular cardiology.2010,48(2):406-414.


技术实现要素：

[0015]
本发明的目的是为了规避芬戈莫德的毒副作用，解决芬戈莫德靶向性不强的问题，提供一种包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德纳米前药的制备方法。
[0016]
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
[0017]
一种包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德纳米前药的制备方法，所述方法为：
[0018]
步骤一：制备活性氧响应的芬戈莫德单体
[0019]
(1)制备活性氧响应连接体：将3-巯基丙酸与三氟乙酸溶解于无水丙酮中，室温搅拌过夜，将白色沉淀过滤收集并用正己烷和冰水清洗即得到活性氧响应连接体；
[0020]
(2)将活性氧响应连接体连接到芬戈莫德分子上：活性氧响应连接体与n-羟基琥珀酰亚胺溶于n，n-二甲基甲酰胺中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)或n，n'-二环己基碳酰亚胺(dcc)，盐酸调节ph到4.3-4.5反应后逐滴加入盐酸芬戈莫德，随后加入三乙胺调节ph到7-7.4，室温搅拌12-24小时后加水沉淀并离心，弃掉上清收集沉淀干燥即得到活性氧响应的芬戈莫德；
[0021]
(3)制备活性氧响应的芬戈莫德单体：活性氧响应的芬戈莫德与nhs溶于dmf中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)或n，n'-二环己基碳酰亚胺(dcc)，调节ph到4.3-4.5反应30min后逐滴加入2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐，随后加入三乙胺调节ph到7-7.4，室温搅拌12-24小时后加水沉淀并离心，弃掉上清收集沉淀干燥即得到活性氧响应的芬戈莫德单体；
[0022]
步骤二：制备peg-polyfingolimod两亲聚合物
[0023]
聚乙二醇-4-氰基-4-(苯基羰基硫代硫基硫代)戊酸酯，活性氧响应的芬戈莫德单体和aibn溶解于二氧六环溶液中75-85℃反应24h，透析后去离子水沉淀冻干即得到聚合物；
[0024]
步骤三：制备包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德前药纳米粒子
[0025]
(1)组装：取0.1-10mg的peg-polyfingolimod两亲聚合物溶于900μl的四氢呋喃(thf)中，并在磁力搅拌器搅拌过程中逐滴加入100-1000μl去离子水，并将其置于室温下持续搅拌，鉴于thf具有挥发性，故随着thf的挥发，溶液中的peg-polyfingolimod两亲聚合物发生自组装，得到球状的纳米前药粒子；
[0026]
(2)中性粒细胞膜的提取：将细胞悬浮在预冷的低渗裂解缓冲液(提前4℃预冷30min)中，使用带有紧杵的杜恩斯匀浆机将细胞打乱(50-100次)，匀浆在20000
×
g，4℃离心25min，丢弃颗粒，上清再次在100000
×
g，4℃下离心35min，收集颗粒，使用含有0.2mm edta洗涤两遍，使用bca试剂盒(pierce)参照牛血清白蛋白(bsa)标准定量膜含量：大约1.25亿个人中性粒细胞或2亿个小鼠中性粒细胞能够产生1毫克的膜材料(蛋白质重量)，用0.2mm edta将膜悬浮到4mg/ml，并在80℃下保存以备后续研究；
[0027]
(3)纳米粒子包膜：在室温下，将1mg以上的细胞膜悬浮在1ml水中，在有盖的离心管中超声，超声给予能量能促使二者实现包覆，将10-20mg/ml中性粒细胞膜与10-20mg/ml纳米粒按膜芯重量比1：1混合，然后在冰上再次超声，为了去除多余的细胞膜，离心去上清，收集沉淀即为包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德前药纳米粒子。
[0028]
进一步地，步骤一(1)中，所述3-巯基丙酸与三氟乙酸的混合比例为2-6g：10-50μl，所述无水丙酮的纯度为99.5vol.％。
[0029]
进一步地，步骤一(2)中，所述活性氧响应连接体的分子量为252，添加量为200-800mg；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)的分子量为191.7，添加量为200-800mg；所述n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的分子量为115，添加量为100-400mg；所述盐酸芬戈莫德的分子量为344，添加量为100-200mg；所述三乙胺的分子量为101，添加量10-20mg。
[0030]
进一步地，步骤一(3)中，所述活性氧响应的芬戈莫德的分子量为578，添加量为200-800mg；所述edc
·
hcl的分子量为191.7，添加量为200-800mg；所述nhs的分子量为115，添加量为100-400mg；所述2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐的分子量为165.62，添加量为100-500mg；所述三乙胺的分子量为101，添加量为10-20mg。
[0031]
进一步地，步骤二中，所述聚乙二醇-4-氰基-4-(苯基羰基硫代硫基硫代)戊酸酯(peg-cta)的添加量为100-200mg；所述活性氧响应的芬戈莫德单体的分子量为743，添加量为10-80mg；所述aibn的添加量为1-10mg。
[0032]
进一步地，步骤三(2)中，所述低渗裂解缓冲液为225mm d-甘露醇、75mm蔗糖、0.5％(w/v)bsa、0.5mm乙二胺四乙酸(edta)、30mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl，ph 7.5)和蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液。
[0033]
进一步地，步骤三(3)中，所述超声的具体条件为：以100w在冰上超声30秒(超声1秒，间隔2秒)；所述离心的具体条件为：温度为4℃，转速为14500r/min，时间为50min。
[0034]
一种上述制备方法制备的包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德纳米前药。
[0035]
本发明相对于现有技术的有益效果为：本发明设计了一种响应脑卒中组织微环境
中活性氧的，由芬戈莫德聚合物“内核”和中性粒细胞膜“外壳”组成的聚合前药纳米载体用于特异性递送芬戈莫德，以对抗缺血性脑卒中局部炎症对神经系统的损伤。该纳米药物递送平台可以通过中性粒细胞膜的炎症趋向作用极大地提高药物分子芬戈莫德的卒中部位靶向效率和局部浓度。此外，通过靶向给药和响应性释放等性质，该纳米载体可以显著降低芬戈莫德的毒副作用。本发明的药物芬戈莫德会介导小胶质细胞由促炎症的m1型向抑炎症的m2型转化，从而减轻脑卒中部位脑实质的炎症，改善卒中部位神经系统损伤，促进神经功能缺损的恢复等。
附图说明
[0036]
图1为包覆中性粒细胞膜的芬戈莫德前药纳米载体用于脑卒中治疗的示意图。
具体实施方式
[0037]
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。
[0038]
本发明对于芬戈莫德治疗脑卒中的方式方法积极创新，采用了合成纳米前药的模式，提高纳米药物的载药量的同时，可使得聚芬戈莫德前药纳米粒子通过包覆的中性粒细胞膜靶向定位于脑卒中炎症部位，随后纳米载体可响应卒中部位上调的活性氧迅速释放芬戈莫德，促进小胶质细胞由m1促炎型向m2抑炎型转化，从而保护神经细胞，修复脑卒中炎症部位的神经损伤。
[0039]
图1是本发明设计并制备的包覆中性粒细胞膜的芬戈莫德前药纳米载体用于脑卒中治疗的示意图。通过两亲性聚合前药嵌段共聚物的组装和中性粒细胞膜的包覆可以得到具有活性氧响应性的智能纳米材料。利用中性粒细胞膜的炎症趋向能力提高该纳米载体在脑卒中部位的浓度，随后纳米载体可响应脑卒中部位上调的活性氧释放芬戈莫德药物，从而诱导小胶质细胞由促炎m1型向抑炎m2型转化，进而通过抑制炎症作用提高神经元活性，修复受损神经细胞，最终达到修复脑卒中炎症部位的神经损伤的目的。
[0040]
实施例1：
[0041]
(1)制备活性氧响应的芬戈莫德单体
[0042]
制备活性氧响应的连接体：将5g 3-巯基丙酸与20μl三氟乙酸溶解于1.3g无水丙酮中，室温搅拌过夜，将白色沉淀过滤收集并用正己烷和冰水清洗即可得到活性氧响应连接体。
[0043]
将活性氧响应连接体连接到芬戈莫德分子上：活性氧响应连接体(mw：252，504mg，2mmol)与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc.hcl mw：191.7，460mg，2.4mmol)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs mw：115，276mg，2.4mmol)溶于10mln，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，盐酸调节ph到4.5左右反应30min后逐滴加入盐酸芬戈莫德(mw：344，688mg，2mmol)，随后加入三乙胺(mw：101，1g，10mmol)调节ph到7左右，室温搅拌24小时后加水沉淀并离心(10000r，20min，4℃)，弃掉上清收集沉淀干燥即可得到活性氧响应的芬戈莫德。
[0044]
制备活性氧响应的芬戈莫德单体：活性氧响应的芬戈莫德(mw：578，578mg，1mmol)与edc.hcl(mw：191.7，383mg，2mmol)，nhs(mw：115，230mg，2mmol)溶于5mldmf中，ph到4.5左
右反应30min后逐滴加入2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐(mw：165.62，331mg，2mmol)，随后加入三乙胺(mw:101，1g，10mmol)调节ph到7左右，室温搅拌24小时后加水沉淀并离心(10000r，20min，4℃)，弃掉上清收集沉淀干燥即可得到活性氧响应的芬戈莫德单体。
[0045]
(2)制备peg-polyfingolimod两亲聚合物
[0046]
聚乙二醇-4-氰基-4-(苯基羰基硫代硫基硫代)戊酸酯(peg-cta20 mg，0.01mmol)，活性氧响应芬戈莫德单体(mw：743，372mg，0.5mmol)和aibn(0.33mg，0.002mmol)溶解于3ml二氧六环溶液中85摄氏度反应24小时，透析后去离子水沉淀冻干即可得到聚合物。
[0047]
(3)制备包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德前药纳米粒子
[0048]
组装：取0.9mg的peg-polyfingolimod两亲聚合物溶于900μl的四氢呋喃(thf)中，并在磁力搅拌器搅拌过程中逐滴加入300μl水溶液，并将其置于室温下持续搅拌，鉴于thf具有挥发性，故随着thf的挥发，溶液中的纳米粒发生自组装，形成球状的纳米前药粒子。
[0049]
中性粒细胞膜的提取：首先将细胞悬浮在含有225mm d-甘露醇、75mm蔗糖、0.5％(w/v)bsa、0.5mm乙二胺四乙酸(edta)、30mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl，ph 7.5)和蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液的低渗裂解缓冲液(提前预冷)中。使用带有紧杵的杜恩斯匀浆机将细胞打乱(50-100次)。匀浆在20000
×
g，4℃离心25min，丢弃颗粒。上清再次在100000
×
g，4℃下离心35min，收集颗粒。使用含有0.2mm edta洗涤两边。使用bca试剂盒(pierce)参照牛血清白蛋白(bsa)标准定量膜含量：大约1.25亿个人中性粒细胞或2亿个小鼠中性粒细胞能够产生1毫克的膜材料(蛋白质重量)。用0.2mm edta将膜悬浮到蛋白质浓度为4mg/ml，并在80℃下保存以备后续研究。
[0050]
纳米粒子包膜：在室温下，将1mg以上的细胞膜悬浮在1ml水中，在有盖的离心管中以100w进行超声，在冰上超声30秒(超声1秒，间隔2秒)。将中性粒细胞膜(1mg/ml)与纳米粒(1mg/ml)按膜芯重量比1：1混合，然后在冰上以100w超声30s(超声1s，间隔2s)。为了去除多余的细胞膜，在4℃下以14500r/min离心50min去掉上清，收集沉淀即为包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德前药纳米粒子。
[0051]
芬戈莫德游离药物在脑卒中治疗中显示出难以穿透血脑屏障到达脑组织以及心脏肝脏毒性较强等问题。本发明针对这些问题开发出了活性氧响应的包覆中性粒细胞膜的芬戈莫德前药纳米载体用于提高其对脑卒中受损神经组织的修复作用。实验建立小鼠脑卒中模型并通过静脉注射的方式将荧光标记的游离药物和实施例1制备的包膜芬戈莫德前药纳米载体分别注射进小鼠体内，通过检测卒中部位的荧光信号发现与游离药物相比，包膜芬戈莫德前药纳米载体穿越血脑屏障在卒中部位聚集的能力显著提高。此外，心电图和心脏彩超均发现游离芬戈莫德药物处理的小鼠出现心动过缓、心律不齐和心传导阻滞等现象，而包覆中性粒细胞膜的芬戈莫德前药纳米载体处理的小鼠心脏与静脉注射pbs的对照组小鼠相比无明显差异，表明包膜芬戈莫德前药纳米载体可以有效降低芬戈莫德药物的心脏毒性。通过水迷宫小鼠行为学实验评估不同组药物对脑卒中小鼠神经修复的影响。将pbs，游离芬戈莫德和包膜芬戈莫德前药纳米载体分别静脉注射进脑卒中小鼠体内，随后将卒中小鼠置于只有一个出口的水迷宫中，记录小鼠找到出口所用的时间。以2天为周期重复该实验，结果发现第3天开始包膜芬戈莫德前药纳米载体处理的卒中小鼠可以在30s内找到水迷宫出口，而且该时间随着治疗周期的延长可以进一步缩短。而pbs和游离芬戈莫德处理
的小鼠在观察期(7天)内均无法在60s找到水迷宫出口，表明包膜芬戈莫德前药纳米载体处理的脑卒中模型小鼠受损的神经系统显著恢复，而pbs或游离芬戈莫德药物组小鼠则仍表现出严重的行为学障碍。
[0052]
本发明设计并制备的包覆中性粒细胞膜的芬戈莫德前药纳米载体可用于治疗脑卒中患者受损的神经组织。建议卒中患者再灌注治疗后24小时静脉注射纳米药物，注射剂量为0.1mg/kg-0.5mg/kg，此后每天给药一次，每次给药0.1mg/kg-0.5mg/kg。通过观察患者行为认知能力的恢复情况判断停止给药时间。通过观察患者心电图和心脏彩超判断该纳米药物毒副作用的改善。小鼠实验发现与游离芬戈莫德药物相比，包覆中性粒细胞膜的芬戈莫德前药纳米载体可显著提高卒中部位的芬戈莫德递送效率，降低其潜在的心脏毒性，因而与芬戈莫德对照组小鼠相比，包覆中性粒细胞膜的芬戈莫德前药纳米载体处理的脑卒中模型小鼠显示出了明显的神经损伤修复效果。

技术特征：
800mg；所述edc
·
hcl的分子量为191.7，添加量为200-800mg；所述nhs的分子量为115，添加量为100-400mg；所述2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐的分子量为165.62，添加量为100-500mg；所述三乙胺的分子量为101，添加量为10-20mg。5.根据权利要求1所述的一种包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德纳米前药的制备方法，其特征在于：步骤二中，所述聚乙二醇-4-氰基-4-(苯基羰基硫代硫基硫代)戊酸酯(peg-cta)的添加量为100-200mg；所述活性氧响应的芬戈莫德单体的分子量为743，添加量为10-80mg；所述aibn的添加量为1-10mg。6.根据权利要求1所述的一种包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德纳米前药的制备方法，其特征在于：步骤三(2)中，所述低渗裂解缓冲液为225mmd-甘露醇、75mm蔗糖、0.5％(w/v)bsa、0.5mm乙二胺四乙酸(edta)、30mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-hcl，ph7.5)和蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液。7.根据权利要求1所述的一种包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德纳米前药的制备方法，其特征在于：步骤三(3)中，所述超声的具体条件为：以100w在冰上超声30秒(超声1秒，间隔2秒)；所述离心的具体条件为：温度为4℃，转速为14500r/min，时间为50min。8.一种权利要求1～7任一项制备方法制备的包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德纳米前药。

技术总结
一种包覆中性粒细胞膜的聚芬戈莫德纳米前药的制备方法，属于纳米药物制备领域。本发明设计了一种响应脑卒中组织微环境中活性氧的，由芬戈莫德聚合物“内核”和中性粒细胞膜“外壳”组成的聚合前药纳米载体用于特异性递送芬戈莫德，以对抗缺血性脑卒中局部炎症对神经系统的损伤。该纳米药物递送平台通过中性粒细胞膜的炎症趋向作用极大地提高药物分子芬戈莫德的卒中部位靶向效率和局部浓度。此外，通过靶向给药和响应性释放等性质，该纳米载体可以显著降低芬戈莫德的毒副作用。本发明的药物芬戈莫德会介导小胶质细胞由促炎症的M1型向抑炎症的M2型转化，从而减轻脑卒中部位脑实质的炎症，改善卒中部位神经系统损伤，促进神经功能缺损的恢复等。经功能缺损的恢复等。经功能缺损的恢复等。


技术研发人员：杨奎琨
受保护的技术使用者：哈尔滨工业大学
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/9/5