生物传感器及其制备方法、鼻分泌物细胞因子检测方法与流程

1.本公开实施例涉及医学分析仪器技术领域，尤其涉及一种用于鼻分泌物中细胞因子检测的电化学生物传感器及其制备方法，鼻分泌物细胞因子检测方法。


背景技术：

2.近年来环境问题日益严峻，大气污染所致的呼吸道疾病已成为科学家研究的热点。变应性鼻炎(allergic rhinitis，ar)，也称过敏性鼻炎，指接触过敏原后产生的，由免疫球蛋白e(immunoglobulin e，ige)介导的一种常年发病、无季节性的慢性鼻黏膜炎症性疾病，以鼻痒、鼻塞、喷嚏、清水样涕等症状中的一种或多种表现为主要特征，同时伴有或不伴有嗅觉和味觉改变，以及由其引发的一系列伴随疾病，如过敏性哮喘、鼻窦炎、鼻息肉、结膜炎、分泌性中耳炎等，发病人群广泛，严重影响患者的日常工作和生活质量。
3.目前针对过敏性鼻炎的鼻分泌物检测主要采用免疫方法，如免疫胶体金试条、免疫生化检测仪等方法。其中胶体金试条基于免疫层析的方法，结构简单，操作方便，价格低，但是采用显色方法，为定性或半定量检测，灵敏度不高，无法满足定量检测需求。而免疫生化检测仪可以实现多参数同时检测，检测灵敏度高，但是检测周期长，且免疫分析仪多为大型仪器，适于医院的检验科或中心实验室，难以满足家庭、个人、社区医院等基层的快速检测需求，从而限制了该方法的推广应用。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题或者至少部分地解决上述技术问题，本公开实施例提供了一种用于鼻分泌物中细胞因子检测的电化学生物传感器及其制备方法，鼻分泌物细胞因子检测方法。
5.第一方面，本公开实施例提供了一种用于鼻分泌物中细胞因子检测的电化学生物传感器，包括：
6.传感器基体，所述传感器基体的一端是样品采集端，另一端是电连接端；其中所述样品采集端的端面设置有作为液体样品容纳室的凹槽；
7.检测电极单元，所述检测电极单元位于所述传感器基体内部，且一端可与所述凹槽内的液体样品接触，另一端位于所述电连接端；其中，所述检测电极单元至少包括工作电极，所述工作电极是包被了目标细胞因子抗体的电极，所述目标细胞因子抗体包括th1细胞分泌的细胞因子抗体和/或th2细胞分泌的细胞因子抗体。
8.在一个实施例中，所述目标细胞因子抗体的包被浓度是100-500μg/ml。
9.在一个实施例中，所述传感器基体包括：
10.基板，所述基板上表面设置有所述检测电极单元，所述检测电极单元之上依次层叠设置有镂空反应层、吸样层和绝缘层；其中所述检测电极单元包括所述工作电极以及对电极、参比电极；
11.所述镂空反应层包括与所述工作电极、所述对电极、所述参比电极的位置相对应
的第一镂空槽、第二镂空槽和第三镂空槽；
12.所述吸样层位于所述样品采集端的一端具有缺口以形成所述凹槽，所述缺口在所述镂空反应层上的投影区域至少覆盖所述第一镂空槽、第二镂空槽和第三镂空槽所在位置。
13.在一个实施例中，所述凹槽的开口的长度大于预设值；或者，所述绝缘层的下表面与所述吸样层的缺口位置相对的区域涂覆有亲水材料的涂层，或，所述绝缘层的下表面整个表面涂覆有亲水材料的涂层；或者，所述第一镂空槽、第二镂空槽和第三镂空槽中的至少一个镂空槽内设置有聚合物、酶、表面活性剂、电子介体、缓冲液、稳定剂和粘合剂组成的混合物；或者，所述镂空反应层的下表面与所述凹槽的位置相对应的区域涂覆有可与所述凹槽内容纳的液体样品反应产生电化学信号的生物试剂。
14.在一个实施例中，所述工作电极的数量为至少一个，每个所述工作电极连接一个第一电极条，所述对电极连接第二电极条，所述参比电极连接第三电极条，每个所述第一电极条、所述第二电极条和所述第二电极条在所述基板上表面平行并延伸至所述电连接端。
15.第二方面，本公开实施例提供一种用于鼻分泌物中细胞因子检测的电化学生物传感器的制备方法，该方法包括：
16.提供一基板，在所述基板的上表面制备形成检测电极单元，所述检测电极单元包括工作电极以及对电极、参比电极；
17.制备金纳米探针，将所述金纳米探针自组装修饰到所述工作电极表面，以使所述工作电极包被目标细胞因子抗体；其中所述目标细胞因子抗体包括th1细胞分泌的细胞因子抗体和/或th2细胞分泌的细胞因子抗体；
18.在所述基板的上表面制备形成镂空反应层，所述镂空反应层位于所述检测电极单元上方，且包括与所述工作电极、所述对电极、所述参比电极的位置相对应的第一镂空槽、第二镂空槽和第三镂空槽；
19.在所述基板的上表面依次制备形成吸样层、绝缘层，所述吸样层位于所述镂空反应层上方，所述绝缘层位于所述吸样层上方，且所述吸样层的一端具有缺口以形成容纳液体样品的凹槽，所述缺口在所述镂空反应层上的投影区域至少覆盖所述第一镂空槽、第二镂空槽和第三镂空槽所在位置。
20.在一个实施例中，该方法采用丝网印刷工艺制备检测电极单元，包括以下步骤：
21.a)：将所述基板用清洗甩干后置于烘箱中于预设温度下烘烤预设时长，冷却后备用；所述预设温度大于或等于120℃；
22.b)：将丝网印刷设备的刮刀与网版的倾斜角度控制在60～80度，并调整网版至基底的距离h在2～3mm，将该网版固定；
23.c)：调制好第一导电浆料，用混匀器搅拌预设时长后放置在该网版上；其中所述第一导电浆料包括银/氯化银浆料，所述银/氯化银浆料中银与氯化银按重量份计包括：75-85份银、20-25份氯化银；
24.d)：基于所述第一导电浆料印刷形成参比电极后，在温度120～140℃下烘干30～60min，回收浆料，清洗该网版、刮刀；
25.e)：调制好第二导电浆料，放置在该网版上；其中所述第二导电浆料包括碳浆；
26.f)：基于所述第二导电浆料印刷形成工作电极、对电极后，在温度120～140℃下烘
干30～60min，回收浆料，清洗该网版、刮刀。
27.在一个实施例中，所述制备金纳米探针，包括：采用交联法制备金纳米探针：在胶体半导体纳米材料表面修饰巯基丙酸、巯基乙胺或半胱氨酸形成羧基或氨基封端的亲水配体，然后使用戊二醛、琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯(smcc)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)作为交联剂将所述目标细胞因子抗体包被在胶体半导体纳米材料表面；或者，采用配体交换法制备金纳米探针：将目标细胞因子抗体溶液直接与氧化还原电子介体在溶液中混合进行置换反应，使所述目标细胞因子抗体直接取代所述氧化还原电子介体表面的有机配体从而包被在所述氧化还原电子介体表面。
28.在一个实施例中，所述氧化还原电子介体包括纳米颗粒类标记物、胶体、硫堇、二茂铁；其中，所述纳米颗粒类标记物包括乳胶微球、树脂微球、磁性微球、胶体金颗粒、量子点、石墨烯；所述胶体包括胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶；并且其中，所述胶体金属包括胶体金、胶体银、胶体碳或胶体硒；或者，采用惰性蛋白或高分子聚合物将所述氧化还原电子介体表面或者所述交联剂表面的非特异性蛋白质结合位点进行封闭。
29.第三方面，本公开实施例提供一种一种鼻分泌物中细胞因子检测方法，包括：
30.通过吸样器从鼻分泌物的液体样品中吸取待测液体；
31.将所述待测液体滴入上述任一实施例所述的电化学生物传感器的样品采集端的凹槽内；
32.获取所述电化学生物传感器的检测电极单元输出的电信号，基于所述电信号分析处理得到鼻分泌物中的细胞因子的含量。
33.本公开实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
34.本公开实施例提供的用于鼻分泌物中细胞因子检测的电化学生物传感器及其制备方法，传感器包括：传感器基体，所述传感器基体的一端是样品采集端，另一端是电连接端；其中所述样品采集端的端面设置有作为液体样品容纳室的凹槽；检测电极单元，所述检测电极单元位于所述传感器基体内部，且一端可与所述凹槽内的液体样品接触，另一端位于所述电连接端；其中，所述检测电极单元至少包括工作电极，所述工作电极是包被了目标细胞因子抗体的电极，所述目标细胞因子抗体包括th1细胞分泌的细胞因子抗体和/或th2细胞分泌的细胞因子抗体。这样，本实施例的方案替代了现有的免疫胶体金试条、免疫生化检测仪，填补了目前鼻分泌物中细胞因子检测电化学生物传感器的空白，可实现对鼻分泌物中细胞因子的快速检测，且操作简单，可以批量生产，实现小型化，可用于例如家庭快速检测，推广应用范围广泛。另外，本实施例中该电化学生物传感器的制备方法制备的电化学生物传感器可以准确检测鼻分泌物中细胞因子如th1细胞和/或th2细胞主要分泌的细胞因子的含量，检测灵敏度高、稳定性好。
附图说明
35.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。
36.为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
37.图1为本公开实施例用于鼻分泌物中细胞因子检测的电化学生物传感器的爆炸结构示意图；
38.图2为本公开实施例中加入硫堇前金纳米粒子的形貌和相应的尺寸分布示意图；
39.图3为本公开实施例中加入硫堇后金纳米粒子的形貌和相应的尺寸分布示意图；
40.图4为本公开实施例的电化学生物传感器的测试结果示意图；
41.图5为图4所示测试结果的线性拟合曲线示意图。
具体实施方式
42.为了能够更清楚地理解本公开的上述目的、特征和优点，下面将对本公开的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
43.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本公开，但本公开还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本公开的一部分实施例，而不是全部的实施例。
44.应当理解，在下文中，“至少一个(项)”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“和/或”用于描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，“a和/或b”可以表示：只存在a，只存在b以及同时存在a和b三种情况，其中a，b可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。
45.如背景技术部分所述，ar是遗传因素与环境因素共同作用的疾病，其免疫学机制复杂。传统观念下，th1与th2细胞通过特定规则维持相对平衡，保证机体正常的细胞和体液免疫功能。当某种因素破坏了动态平衡，如th2亚群、th1亚群功能失衡，机体会产生异常的免疫应答反应。目前传统的th1/th2失衡理论已经不能完全解释ar的发病。
46.研究发现，细胞因子在气道变态反应中起着重要作用，呼吸道上皮细胞接受外界刺激后产生参与变态反应的炎症介质，对免疫细胞及细胞因子的认识使得人们进一步了解了过敏性鼻炎的特点，以此为基础的特异性免疫治疗为单一药物治疗提供了良好的补充。其中，th1细胞主要分泌il-2、il-12、γ干扰素、α干扰素、β干扰素等，其特征因子是γ干扰素，主要是活化巨噬细胞，介导与细胞毒和局部炎症反应有关的免疫应答，辅助抗体生成，是ⅳ型变态反应关键的效应细胞。th2细胞主要分泌il-3、il-4、il-5、il-6、il-9、il-10、il-13以及粒细胞集落刺激因子，其特征因子是il-4。th2细胞能诱导b细胞产生igg和ige抗体，在体液免疫中影响速发型(ⅰ型)变态反应的发生。因此检测鼻分泌物中的细胞因子对于过敏性鼻炎的判断意义重大。而上述细胞因子在鼻分泌物中含量极低，需要较高的检测灵敏度，目前还缺乏相应的解决方案。
47.图1为本公开实施例的用于鼻分泌物中细胞因子检测的电化学生物传感器的爆炸结构示意图，包括传感器基体和检测电极单元，所述传感器基体的一端是样品采集端，另一端是电连接端；其中所述样品采集端的端面设置有作为液体样品容纳室的凹槽。所述检测电极单元位于所述传感器基体内部，且一端可与所述凹槽内的液体样品接触，另一端位于所述电连接端；其中，所述检测电极单元至少包括工作电极22，所述工作电极22是包被了目标细胞因子抗体的电极，所述目标细胞因子抗体包括th1细胞分泌的细胞因子抗体和/或
th2细胞分泌的细胞因子抗体。
48.示例性的，检测电极单元可以是两电极结构或者三电极结构，本实施例中为三电极结构，对此不作限制。th1细胞主要分泌的细胞因子抗体是比如il-2、il-12、γ干扰素、α干扰素、β干扰素等抗体。th2细胞主要分泌的细胞因子抗体是比如il-3、il-4、il-5、il-6、il-9、il-10、il-13以及粒细胞集落刺激因子等抗体。本实施例中目标细胞因子抗体包被在工作电极表面的过程可以参考现有技术理解，此处不再赘述。
49.本实施例的上述方案替代了现有的免疫胶体金试条、免疫生化检测仪，填补了目前鼻分泌物中细胞因子检测电化学生物传感器的空白，可实现对鼻分泌物中细胞因子的快速检测，且操作简单，可以批量生产，实现小型化，可用于例如家庭快速检测，推广应用范围广泛。
50.在上述实施例的基础上，于一个实施例中，所述目标细胞因子抗体的包被浓度可以是100-500μg/ml。具体的，包被是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程；通常，包被用抗原或抗体的浓度即包被浓度可以根据试验的特点和材料的性质而选定。本实施例中，针对目标细胞因子抗体如th1细胞分泌的细胞因子抗体或th2细胞分泌的细胞因子抗体，将其包被浓度控制在100-500μg/ml之间，经试验该电化学生物传感器可以准确检测鼻分泌物中细胞因子如th1细胞或th2细胞主要分泌的细胞因子的含量，检测灵敏度高、稳定性好。
51.在上述任意一个实施例的基础上，于一个实施例中，参考图1所示，所述传感器基体包括基板200，所述基板200上表面设置有所述检测电极单元，所述检测电极单元之上依次层叠设置有镂空反应层300、吸样层400和绝缘层500；其中所述检测电极单元包括工作电极22以及对电极24、参比电极23；所述镂空反应层300包括与所述工作电极22、所述对电极24、所述参比电极23的位置相对应的第一镂空槽31、第二镂空槽33和第三镂空槽32；所述吸样层400位于所述样品采集端的一端具有缺口41以形成所述凹槽，所述缺口41在所述镂空反应层300上的投影区域至少覆盖所述第一镂空槽31、第二镂空槽33和第三镂空槽32所在位置。
52.示例性的，所述基板200的材质可以为聚苯乙烯ps,聚碳酸酯pc,聚氯乙烯pvc,聚甲基丙烯酸甲酯pmma或其他同类型材料。所述基板200也可为由多种材料制得，例如高分子聚合物等，可用作基板200的聚合物包括但不限于聚碳酸酯、聚酯、聚乙烯苯二甲酸盐、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚酰亚胺及其组合物，或陶瓷板、玻璃板、铝片等硬性基板。基板200上可以涂覆形成工作电极22、参比电极23以及对电极24。参比电极23用于控制工作电极的电位，所述对电极24用于与工作电极形成回路，这些原理可以参考现有技术理解，此处不再赘述。各电极的导电浆料可以包括但不限于：各种各样的碳材料；各种各样的金属如金、铂、钯、铱、铑、钌等；各种各样的金属氧化物如氧化铟，氧化锡以及它们的组合物。可通过行业内熟知的各种方法制得各电极，包括但不限于印刷(如丝网印刷)、涂布(如逆转辊涂布)、气相沉积、溅射、化学沉积、电化学沉积等工艺方法。
53.示例性的，镂空反应层300固定在基板200的上表面上，镂空反应层300具体可以为电绝缘材料制成涂层或膜。在镂空反应层300可设置镂空槽如圆孔的第一镂空槽31、第二镂空槽32和第三镂空槽33，并且三者的位置分别与工作电极22、参考电极23及对电极24相对应。
54.吸样层400可以是绝缘材料如塑料制成，其上下两面可以涂有胶水或胶粘剂，分别
用于与镂空反应层300和绝缘层500相固定；也可将获得的双面的压敏胶粘带可以直接用作吸样层400。吸样层400的的缺口41可以有不同的形状，包括但不限于圆弧形，正方形，长方形，三角形，梯形，倒梯形等。
55.绝缘层500可以由塑料或聚合物材料得到，例如高分子聚合物，可用来制备绝缘层500的聚合物材料包括但不限于聚乙烯，聚对苯二甲酸乙二酯、聚萘二甲酸乙二酯、聚酰亚胺或其组合物。
56.在一个实施例中，所述凹槽的开口的长度大于预设值。具体的，吸样层400的缺口41可以形成容纳液体样品的凹槽，凹槽的开口的长度大于预设值，该预设值可以是样品采集端的端面长度的四分之三或以上。该凹槽作为液体样品容纳室，并且凹槽的开口的长度大于预设值，进而无需设置额外的空气逸出口，在使用时，待检测的液体样品可以由凹槽开口内通过毛细作用直接进入到凹槽内，可以使得位于凹槽开口任何位置的液体样本基本均可以进入到凹槽内，进而可以解决目前由于入口封堵而导致液体样品进入液体样品室困难的问题。同时，由于省去了目前需要额外设置的空气逸出口，因此在生产时更简单，更方便操作。
57.在一个实施例中，所述绝缘层500的下表面与所述吸样层400的缺口41位置相对的区域涂覆有亲水材料的涂层，或，所述绝缘层500的下表面整个表面涂覆有亲水材料的涂层。
58.具体的，绝缘层500下表面且与吸样层400的缺口41位置相对的区域可以涂覆有亲水材料的亲水涂层，以促进取样时的毛细管作用，提高检测灵敏度。在具体生产时，绝缘层500的一整个下表面可以都涂有亲水物质的涂层，再与吸样层400固定如粘合等，同样可促进取样时的毛细管作用，提高检测灵敏度。
59.在一个实施例中，所述第一镂空槽、第二镂空槽和第三镂空槽中的至少一个镂空槽内设置有聚合物、酶、表面活性剂、电子介体、缓冲液、稳定剂和粘合剂组成的混合物。
60.具体的，为使该传感器有效的工作以提高检测灵敏度，各镂空槽内还可包含聚合物、酶、表面活性剂、电子介体(电子受体或电子给予体)、缓冲液、稳定剂和粘合剂的混合物。电子介体可以是处于氧化态或还原态的氧化还原化学物质，可包括但不限于各种金属或贵金属化合物如铁氰化钾，亚铁氰化钾，酞菁钴，各种二茂铁和各种有机氧化还原介质如亚甲基蓝，亚甲蓝绿色，麦尔多拉蓝，n-甲基吩嗪，甲基硫酸盐，苯二胺，7,7,8,8-四氰基二甲烷，四硫富瓦烯，苯醌，邻二氮杂菲-5,6,二酮，甲苯胺蓝，tmb，焦酚等。
61.在一个实施例中，所述镂空反应层300的下表面与所述凹槽的位置相对应的区域涂覆有可与所述凹槽内容纳的液体样品反应产生电化学信号的生物试剂。
62.具体的，为使该传感器有效的工作以提高检测灵敏度，在电极的上表面即镂空反应层300的下表面与凹槽的位置相对应的位置区域可以涂覆有生物试剂。该生物试剂可以是酶、抗体、抗原、络合试剂、底物或其组合。选择合适的生物试剂与被检测的分析物反应，以便准确确定液体样品中被分析物的浓度，可以提高检测灵敏度和检测结果的准确性。
63.在一个实施例中，所述工作电极22的数量为至少一个，每个工作电极22连接一个第一电极条，所述对电极连接第二电极条，所述参比电极连接第三电极条，每个所述第一电极条、所述第二电极条和所述第二电极条在基板200上表面平行并延伸至电连接端。
64.示例性的，工作电极的数量为至少一个(图未示)，每个工作电极如工作电极22连
接一个第一电极条212，对电极24连接第二电极条213，所述参比电极23连接第三电极条211。电极条(211/212/213)是将导电浆料通过上述各种方法附着到所述基板200上的供电流行走的电流通道，其在基板200上表面平行并延伸至电连接端，该电连接端可以接入电化学工作站。
65.第二方面，本公开实施例提供一种用于鼻分泌物中细胞因子检测的电化学生物传感器的制备方法，该方法包括以下步骤：
66.1)提供一基板，在所述基板的上表面制备形成检测电极单元，所述检测电极单元包括工作电极以及对电极、参比电极。
67.示例性的，参考图1所示，基板200的材质可以为聚苯乙烯ps,聚碳酸酯pc,聚氯乙烯pvc,聚甲基丙烯酸甲酯pmma或其他同类型材料。所述基板200也可为由多种材料制得，例如高分子聚合物等，可用作基板200的聚合物包括但不限于聚碳酸酯、聚酯、聚乙烯苯二甲酸盐、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚酰亚胺及其组合物，或陶瓷板、玻璃板、铝片等硬性基板。基板200上可以涂覆导电浆料制备形成工作电极22、参比电极23以及对电极24，但是制备工艺也不限于此。
68.2)制备金纳米探针，将所述金纳米探针自组装修饰到所述工作电极表面，以使所述工作电极包被目标细胞因子抗体；其中所述目标细胞因子抗体包括th1细胞分泌的细胞因子抗体和/或th2细胞分泌的细胞因子抗体。
69.示例性的，可以采用滴涂、旋涂、或喷涂打印等成膜工艺将金纳米探针自组装修饰到工作电极表面，以保证目标细胞因子抗体在固定到工作电极表面后的稳定性，在固定后能长期保存或者在修饰了化学基团(如-cooh、-nh2、-oh、-sh等)后仍然有活性。
70.3)在所述基板的上表面制备形成镂空反应层，所述镂空反应层位于所述检测电极单元上方，且包括与所述工作电极、所述对电极、所述参比电极的位置相对应的第一镂空槽、第二镂空槽和第三镂空槽。
71.示例性的，镂空反应层300具体可以为电绝缘材料制成涂层或膜，具体可以采用印刷或者其它现有工艺制成。在镂空反应层300可设置镂空槽如圆孔的第一镂空槽31、第二镂空槽32和第三镂空槽33，并且三者的位置分别与工作电极22、参考电极23及对电极24相对应。
72.4)在所述基板的上表面依次制备形成吸样层、绝缘层，所述吸样层位于所述镂空反应层上方，所述绝缘层位于所述吸样层上方，且所述吸样层的一端具有缺口以形成容纳液体样品的凹槽，所述缺口在所述镂空反应层上的投影区域至少覆盖所述第一镂空槽、第二镂空槽和第三镂空槽所在位置。
73.示例性的，吸样层400可以是绝缘材料如塑料制成，其上下两面可以涂有胶水或胶粘剂，分别用于与镂空反应层300和绝缘层500相固定。吸样层400的的缺口41可以有不同的形状，包括但不限于圆弧形，正方形，长方形，三角形，梯形，倒梯形等。
74.绝缘层500可以由塑料或聚合物材料制备得到，例如高分子聚合物，可用来制备绝缘层500的聚合物材料包括但不限于聚乙烯，聚对苯二甲酸乙二酯、聚萘二甲酸乙二酯、聚酰亚胺或其组合物。
75.本实施例的上述方法制备的电化学生物传感器替代了现有的免疫胶体金试条、免疫生化检测仪，填补了目前鼻分泌物中细胞因子检测电化学生物传感器的空白，可实现对
鼻分泌物中细胞因子的快速检测，且操作简单，可以批量生产，实现小型化，可用于例如家庭快速检测，推广应用范围广泛。
76.在一个实施例中，为了提高制备的该电化学生物传感器检测鼻分泌物中细胞因子的检测灵敏度和稳定性，该方法采用丝网印刷工艺制备检测电极单元，具体可以包括以下步骤：
77.a)：将所述基板用清洗甩干后置于烘箱中于预设温度下烘烤预设时长，冷却后备用；所述预设温度大于或等于120
°
。
78.示例性的，基板选择主要考虑耐热度和平整度，浆料热固化温度达120℃以上，因此选择耐高温基材。示例性的，预设时长可以是15分钟，预设温度可以是120℃。在一个示例中，为了批次制备多个传感器，可将待印刷的大基板如pet聚酯膜切成大小为50*60cm的基板即小基板，用超纯水清洗。然后置于烘箱中于120℃下烘烤15分钟，以防止基板在后续高温加热工序中变形，冷却后备用。
79.b)：将丝网印刷设备的刮刀与网版的倾斜角度控制在60～80度，并调整网版至基底的距离h在2～3mm，将该网版固定。
80.c)：调制好第一导电浆料，用混匀器搅拌预设时长后放置在该网版上；其中所述第一导电浆料包括银/氯化银浆料，所述银/氯化银浆料中银与氯化银按重量份计包括：75-85份银、20-25份氯化银。
81.示例性的，银/氯化银浆料中银与氯化银按重量份计包括：80份银、20份氯化银，但也不限于此；搅拌预设时长如5分钟，第一导电浆料混合均匀后放置在该网版上。
82.d)：基于所述第一导电浆料印刷形成参比电极后，在温度120～140℃下烘干30～60min，回收浆料，清洗该网版、刮刀。
83.示例性的，启动丝网印刷设备开始印刷作业，基于所述第一导电浆料在小基板上印刷形成参比电极后，在温度120℃下烘干30min，回收浆料，清洗该网版、刮刀。
84.e)：调制好第二导电浆料，放置在该网版上；其中所述第二导电浆料包括碳浆；
85.示例性的，参比电极印制完成后，将碳浆放置在该网版上。
86.f)：基于所述第二导电浆料印刷形成工作电极、对电极后，在温度120～140℃下烘干30～60min，回收浆料，清洗该网版、刮刀。
87.示例性的，再次启动丝网印刷设备开始印刷作业，基于所述第二导电浆料即碳浆印刷形成工作电极、对电极后，在温度140℃下烘干60min，回收浆料，清洗该网版、刮刀。此时则基板200上的三电极结构印制完成，然后可以返回上述步骤2)完成其它层的制备。
88.可以理解的是，电极的结构、材料、制备工艺均会影响制备的传感器的检测灵敏度和稳定性。因此本实施例采用丝网印刷工艺制备三电极体系的电极结构，同时选择银/氯化银混合浆料印制参比电极，碳浆印制对电极、工作电极，且限定了银/氯化银的特定重量比例。其中该特定重量比例的银/氯化银混合浆料的半电池电位低、粘合力强、固化快，具有良好电流感知性能，电阻值小例如小于0.465ω/cm2。而碳浆低阻值如标识电阻为10ω/cm2，粘合力强，固化快，具有良好柔韧性，丝印性能优良。不同电极采用不同材料并结合设置了印刷参数(如刮刀与网版的倾斜角度、网版至基底的距离h)的丝网印刷工艺制备形成三电极体系的电极结构，这样制备的传感器后续检测鼻分泌物中细胞因子时，检测的灵敏度高，且检测稳定性好，使得检测结果较为准确。
89.其中，为了体现上述技术效果，本实施例中对该丝网印刷工艺批次制备的多个传感器的电极进行检测：随机抽取不同批次的具有丝网印刷电极(工作电极、对电极、参比电极)的基板进行电极的电阻测试，比较批内差异。通过循环伏安法研究丝网印刷电极在铁氰化钾溶液中电化学行为，扫描速度为100mv/s，结果显示批内差异sd小于5％。也即该设置了上述印刷参数的丝网印刷工艺以不同电极采用不同材料制备得到的电极结构质量较好，使得制备的传感器后续检测鼻分泌物中细胞因子时，检测的灵敏度高，且检测稳定性好。
90.在其它一些实施例中，绝缘层500、镂空反应层、吸样层也可以由丝网印刷工艺制备完成，绝缘层采用浆料可以是绝缘油墨，印刷形成绝缘层后，在温度120
°
下烘干30min，回收浆料，清洗该网版、刮刀，然后印制其它层。绝缘油墨具有电阻值高、附着力强、绿色表面、优越弯折性、固化快、优良丝印性能。
91.在一个实施例中，上述步骤2)中制备金纳米探针，具体可以包括：采用交联法制备金纳米探针：在胶体半导体纳米材料表面修饰巯基丙酸、巯基乙胺或半胱氨酸形成羧基或氨基封端的亲水配体，然后使用戊二醛、琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯(smcc)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)作为交联剂将所述目标细胞因子抗体包被在胶体半导体纳米材料表面；或者，采用配体交换法制备金纳米探针：将目标细胞因子抗体溶液直接与氧化还原电子介体在溶液中混合进行置换反应，使所述目标细胞因子抗体直接取代所述氧化还原电子介体表面的有机配体从而包被在所述氧化还原电子介体表面。采用这样的方式可以使得目标细胞因子抗体更好地包被在工作电极上，进而使得制备的传感器的检测灵敏度提高。
92.在一个实施例中，所述氧化还原电子介体包括纳米颗粒类标记物、胶体、硫堇、二茂铁；其中，所述纳米颗粒类标记物包括乳胶微球、树脂微球、磁性微球、胶体金颗粒、量子点、石墨烯；所述胶体包括胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶；并且其中，所述胶体金属包括胶体金、胶体银、胶体碳或胶体硒。这样使得目标细胞因子抗体更好地包被在工作电极上，进而使得制备的传感器的检测灵敏度提高。
93.在上述实施例的基础上，于一个实施例中，还可以采用惰性蛋白或高分子聚合物将所述氧化还原电子介体表面或者所述交联剂表面的非特异性蛋白质结合位点进行封闭。
94.示例性的，所述表面的封闭步骤可以是采用牛血清白蛋白(bsa)等惰性蛋白或高分子聚合物将氧化还原电子介体表面或者交联剂表面的非特异性蛋白质结合位点进行封闭。这样使得检测细胞因子时细胞因子与相应的目标细胞因子抗体特异性结合的效果更好，进而使得制备的传感器的检测灵敏度进一步提高。
95.本实施例中上述方法制备的传感器，可以对氧化还原电子介体进行细胞因子抗体修饰并表征；以三电极系统为例，制作丝网印刷电极，对丝网印刷电极通过交联法或者配体交换法将电传感器探针自组装修饰到丝网印刷电极如工作电极表面，具体可以确定还原比例和自组装最佳条件；采用惰性蛋白或高分子聚合物将氧化还原电子介体表面、电极表面以及交联剂表面的空白活性位点进行封闭。这样便可将修饰的工作电极用于细胞因子检测，细胞因子与相应的细胞因子抗体特异性结合，形成复合物，阻碍工作电极表面电子的传递，通过外加例如交流阻抗法定量测量细胞因子的含量。本实施例中对修饰的工作电极进行线性、选择性、灵敏度、稳定性等试验考察，结果显示细胞因子与细胞因子抗体结合的特异性好，检测灵敏度高、稳定性好。
96.下面结合一个具体实施例对本公开实施例的方案进行示例性的详细说明，以下示例性方案仅为举例说明，不用于限制本公开实施例的方案。
97.1.制备电化学电极结构
98.1.1基板选择
99.基板选择主要考虑耐热度和平整度，浆料热固化温度达120℃，因此选择耐高温基材；本实施例优选pet材料作为基板。
100.1.2浆料选择
101.本实施例优选采用三电极体系，选择银/氯化银(重量份比例80/20)印制参比电极，碳浆印制对电极、工作电极和导线即电极条，绿色热固化绝缘油墨印制绝缘层。银与氯化银的重量比例为80:20，具有低半电池电位、粘合力强、固化快，良好电流感知性能，电阻:值小于0.465ω/cm2，固化条件：120℃固化30min。碳浆，低阻值(标识电阻为10ω/cm2)，粘合力强，固化快，具有良好柔韧性，优良丝印性能，固化条件：120℃固化30min。绝缘油墨，电阻值高、附着力强、绿色表面、优越弯折性、固化快、优良丝印性能，固化条件：120℃固化30min。
102.1.3、丝网印刷步骤
103.参见图1的电极体系结构组装示意图：
104.①
将基板如pet聚酯膜切成大小为50*60cm大小，用超纯水清洗，甩干后置烘箱中于120℃烘烤15min，以防止板在后续高温加热工序中变形，冷却后备用。
105.②
将丝网印刷设备的网版、刮刀用洗网水进行清洗，待自然挥干后备用。
106.③
印刷电极时，将刮刀与网版的倾斜角度调至控制在60～80度，并调整网距h为2～3mm，将网版固定。
107.④
按照产品说明书调制好第一导电浆料，用精密调速混匀器搅拌5min，放置在网版上。在基板上按图印刷导电银浆形成参比电极后，120℃烘干30min，回收浆料，清洗网版、刮胶和刮刀，按照同样的方法印刷其它电极，其中浆料采用碳浆。
108.⑤
检测：随机抽取不同批次的丝网印刷电极进行电阻的测试，比较批内差异。通过循环伏安法研究丝网印刷电极在铁氰化钾溶液中电化学行为，扫描速度为100mv/s，结果显示批内差异sd小于5％。
109.2.制备电传感探针
110.2.1制备胶体金探针
111.向0.5ml0.01mol柠檬酸三钠和18.5ml水所配成的混合溶液中加入0.5ml0.001mol/l的四氯合金酸hauci溶液，充分搅拌，然后置于圆底烧瓶回流至溶液颜色变为酒红色，此时即得到胶体金探针。基于透射电子显微镜tem测量所得粒子的尺寸小于20nm。在此种情形下，柠檬酸三钠充当还原剂。
112.2.2制备硫堇覆盖的金纳米探针
113.将一体积为20ml的上述胶体金探针与5ml饱和溶解硫堇的异丙醇溶液充分搅拌混合，搅拌持续24h直至酒红色变淡，所得的溶液离心后即可制得硫堇覆盖的金纳米探针即金纳米粒子。将所得的沉淀分别以异丙醇和二次水洗三次以去除未吸附的硫堇分子和未反应的柠檬酸三钠。洗净的沉淀用于红外测量，或可重新分散在异丙醇中进行电化学测量，该分散液能稳定数天。
114.图2和图3表示加入硫堇前后金纳米粒子的形貌和相应的尺寸分布。由图2可见，所制的金纳米粒子几乎均为球形，且相互分离。图3的动态光散射测定表明粒子尺寸主要集中在12nm左右，统计平均尺寸为18nm。加入硫堇后，由图3可见，粒子尺寸基本不变，但部分金纳米粒子形成了密堆积的团簇，这是由硫堇在金纳米粒子表面的吸附诱导所产生。图3的动态光散射测定结果表明加入硫堇后出现了两个粒径分布峰，分别对应于12nm和84nm左右。该12nm处粒径分布峰可归于缔合了硫堇的单个金纳米粒子，而84nm处的粒径分布峰则对应于缔合了硫堇的金纳米团簇。
115.2.3制备抗体靶向的硫堇覆盖的金纳米探针
116.向2mg的人γ-干扰素抗体中加入1mlpbs缓冲液，涡旋混匀，配制成2mg/ml的抗体溶液；取配制好的2mg/ml的抗体溶液100μl，与上述硫堇覆盖的金纳米探针混合，室温(25℃)孵育进行自组装24h；吸取150μl的bsa溶液(10mg/ml)滴加到工作电极表面，室温孵育30min。所得的溶液离心后即可制得抗体靶向的硫堇覆盖的金纳米探针，将所得的沉淀用pbs洗三次以去除未与抗体结合的硫堇覆盖的金纳米探针，离心备用。
117.3.制备生物传感器及性能测试
118.使用移液枪取上述抗体靶向的硫堇覆盖的金纳米探针即混合溶液1μl滴到平面三电极的工作电极上，采用旋涂成膜的方式涂覆，重复上述步骤例如3次，室温下干燥后得到包被人γ-干扰素抗体的电化学生物传感器。
119.为验证该生物传感器的检测性能指标，对1～100miu/ml梯度浓度的人γ-干扰素抗原标准溶液分别利用同一γ-干扰素电化学生物传感器进行测试，测试结果如图4所示，随着抗原浓度的逐渐增大，dpv扫描得到的脉冲峰值逐渐降低，这与直接电化学检测的原理相符，检测过程中，由于直接免疫检测方法不需要进行抗原抗体的预处理，因此检测时间得到了缩减，整个检测过程控制在10min。图5是对图4的线性拟合曲线，线性良好，线性相关系数为0.991。
120.第三方面，本公开实施例提供一种鼻分泌物中细胞因子检测方法，包括：通过吸样器从鼻分泌物的液体样品中吸取待测液体；将所述待测液体滴入上述任一实施例所述的电化学生物传感器的样品采集端的凹槽内；获取所述电化学生物传感器的检测电极单元输出的电信号，基于所述电信号分析处理得到鼻分泌物中的细胞因子的含量。
121.示例性的，上述电化学生物传感器的电连接端可以接入电化学工作站，电化学工作站获取所述电化学生物传感器的检测电极单元输出的电信号，然后基于电信号分析处理得到鼻分泌物中的细胞因子的含量。关于电化学工作站的分析处理过程可以参考现有技术中的类似方案，对此不作赘述。本实施例的改进侧重点在于电化学生物传感器。
122.需要说明的是，尽管在上文以特定顺序描述了本公开中各方法的各个步骤，但是，这并非要求或者暗示必须按照该特定顺序来执行这些步骤，或是必须执行全部所示的步骤才能实现期望的结果。附加的或备选的，可以省略某些步骤，将多个步骤合并为一个步骤执行，以及/或者将一个步骤分解为多个步骤执行等。
123.需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些
要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
124.以上所述仅是本公开的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本公开。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本公开的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本公开将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种用于鼻分泌物中细胞因子检测的电化学生物传感器，其特征在于，包括：传感器基体，所述传感器基体的一端是样品采集端，另一端是电连接端；其中所述样品采集端的端面设置有作为液体样品容纳室的凹槽；检测电极单元，所述检测电极单元位于所述传感器基体内部，且一端可与所述凹槽内的液体样品接触，另一端位于所述电连接端；其中，所述检测电极单元至少包括工作电极，所述工作电极是包被了目标细胞因子抗体的电极，所述目标细胞因子抗体包括th1细胞分泌的细胞因子抗体和/或th2细胞分泌的细胞因子抗体。2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述目标细胞因子抗体的包被浓度是100-500μg/ml。3.根据权利要求1或2所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述传感器基体包括：基板，所述基板上表面设置有所述检测电极单元，所述检测电极单元之上依次层叠设置有镂空反应层、吸样层和绝缘层；其中所述检测电极单元包括所述工作电极以及对电极、参比电极；所述镂空反应层包括与所述工作电极、所述对电极、所述参比电极的位置相对应的第一镂空槽、第二镂空槽和第三镂空槽；所述吸样层位于所述样品采集端的一端具有缺口以形成所述凹槽，所述缺口在所述镂空反应层上的投影区域至少覆盖所述第一镂空槽、第二镂空槽和第三镂空槽所在位置。4.根据权利要求3所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述凹槽的开口的长度大于预设值；或者，所述绝缘层的下表面与所述吸样层的缺口位置相对的区域涂覆有亲水材料的涂层，或，所述绝缘层的下表面整个表面涂覆有亲水材料的涂层；或者，所述第一镂空槽、第二镂空槽和第三镂空槽中的至少一个镂空槽内设置有聚合物、酶、表面活性剂、电子介体、缓冲液、稳定剂和粘合剂组成的混合物；或者，所述镂空反应层的下表面与所述凹槽的位置相对应的区域涂覆有可与所述凹槽内容纳的液体样品反应产生电化学信号的生物试剂。5.根据权利要求3所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述工作电极的数量为至少一个，每个所述工作电极连接一个第一电极条，所述对电极连接第二电极条，所述参比电极连接第三电极条，每个所述第一电极条、所述第二电极条和所述第二电极条在所述基板上表面平行并延伸至所述电连接端。6.一种用于鼻分泌物中细胞因子检测的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，该方法包括：提供一基板，在所述基板的上表面制备形成检测电极单元，所述检测电极单元包括工作电极以及对电极、参比电极；制备金纳米探针，将所述金纳米探针自组装修饰到所述工作电极表面，以使所述工作电极包被目标细胞因子抗体；其中所述目标细胞因子抗体包括th1细胞分泌的细胞因子抗体和/或th2细胞分泌的细胞因子抗体；在所述基板的上表面制备形成镂空反应层，所述镂空反应层位于所述检测电极单元上方，且包括与所述工作电极、所述对电极、所述参比电极的位置相对应的第一镂空槽、第二镂空槽和第三镂空槽；在所述基板的上表面依次制备形成吸样层、绝缘层，所述吸样层位于所述镂空反应层
上方，所述绝缘层位于所述吸样层上方，且所述吸样层的一端具有缺口以形成容纳液体样品的凹槽，所述缺口在所述镂空反应层上的投影区域至少覆盖所述第一镂空槽、第二镂空槽和第三镂空槽所在位置。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，该方法采用丝网印刷工艺制备检测电极单元，包括以下步骤：a)：将所述基板用清洗甩干后置于烘箱中于预设温度下烘烤预设时长，冷却后备用；所述预设温度大于或等于120℃；b)：将丝网印刷设备的刮刀与网版的倾斜角度控制在60～80度，并调整网版至基底的距离h在2～3mm，将该网版固定；c)：调制好第一导电浆料，用混匀器搅拌预设时长后放置在该网版上；其中所述第一导电浆料包括银/氯化银浆料，所述银/氯化银浆料中银与氯化银按重量份计包括：75-85份银、20-25份氯化银；d)：基于所述第一导电浆料印刷形成参比电极后，在温度120～140℃下烘干30～60min，回收浆料，清洗该网版、刮刀；e)：调制好第二导电浆料，放置在该网版上；其中所述第二导电浆料包括碳浆；f)：基于所述第二导电浆料印刷形成工作电极、对电极后，在温度120～140℃下烘干30～60min，回收浆料，清洗该网版、刮刀。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述制备金纳米探针，包括：采用交联法制备金纳米探针：在胶体半导体纳米材料表面修饰巯基丙酸、巯基乙胺或半胱氨酸形成羧基或氨基封端的亲水配体，然后使用戊二醛、琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯(smcc)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)作为交联剂将所述目标细胞因子抗体包被在胶体半导体纳米材料表面；或者，采用配体交换法制备金纳米探针：将目标细胞因子抗体溶液直接与氧化还原电子介体在溶液中混合进行置换反应，使所述目标细胞因子抗体直接取代所述氧化还原电子介体表面的有机配体从而包被在所述氧化还原电子介体表面。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述氧化还原电子介体包括纳米颗粒类标记物、胶体、硫堇、二茂铁；其中，所述纳米颗粒类标记物包括乳胶微球、树脂微球、磁性微球、胶体金颗粒、量子点、石墨烯；所述胶体包括胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶；并且其中，所述胶体金属包括胶体金、胶体银、胶体碳或胶体硒；或者，采用惰性蛋白或高分子聚合物将所述氧化还原电子介体表面或者所述交联剂表面的非特异性蛋白质结合位点进行封闭。10.一种鼻分泌物中细胞因子检测方法，其特征在于，包括：通过吸样器从鼻分泌物的液体样品中吸取待测液体；将所述待测液体滴入权利要求1～5任一项所述的电化学生物传感器的样品采集端的凹槽内；获取所述电化学生物传感器的检测电极单元输出的电信号，基于所述电信号分析处理得到鼻分泌物中的细胞因子的含量。

技术总结
本公开涉及一种用于鼻分泌物中细胞因子检测的电化学生物传感器及其制备方法，鼻分泌物细胞因子检测方法，其中传感器包括：传感器基体，所述传感器基体的一端是样品采集端，另一端是电连接端；其中所述样品采集端的端面设置有作为液体样品容纳室的凹槽；检测电极单元，所述检测电极单元位于所述传感器基体内部，且一端可与所述凹槽内的液体样品接触，另一端位于所述电连接端；其中，所述检测电极单元至少包括工作电极，所述工作电极是包被了目标细胞因子抗体的电极，所述目标细胞因子抗体包括Th1细胞分泌的细胞因子抗体和/或Th2细胞分泌的细胞因子抗体。分泌的细胞因子抗体。分泌的细胞因子抗体。


技术研发人员：陈建军 陈琰 杜威
受保护的技术使用者：武汉大白小白科技有限公司
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/9/5