一种无机/有机复合的微图案多细胞支架及其制备方法和应用

1.本发明涉及一种无机/有机复合的微图案多细胞支架及其制备方法和应用，具体涉及一种多种细胞在三维空间中分别呈现网络状和点状分布的复杂微图案支架及其制备方法和应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.毛囊缺失和退化导致的脱发严重影响个体的身心健康。作为皮肤组织的重要附属物，毛囊在毛发生长、体温调节、分泌和排泄等方面发挥着重要作用。此外，毛囊中的毛囊干细胞参与伤口收缩、血管生成和皮肤再上皮化过程。然而，成年人的毛囊在缺失或坏死后无法再生。因此，毛囊再生已经成为了皮肤组织工程发展的重要方向之一。有研究表明毛囊的生长活动与周围的真皮血管网络密切相关。由此，能够有效整合毛囊—血管的复杂结构和生物学功能的皮肤替代物对于毛发再生以及功能性皮肤再生具有重要意义。
3.近年来，细胞图案化的兴起是为了促进组织再生所必需的细胞行为和细胞通讯的发生。为了建立具有多种细胞类型空间图案的生物活性微环境，三维(3d)生物打印在仿生人造皮肤替代品的制备中展现出巨大的应用潜力。作为一种新兴的增材制造技术，生物3d打印技术能够精确调控生物材料、活细胞和生长因子的空间分布。然而，现有的生物3d打印皮肤组织工程支架难以整合毛囊和血管网络的仿生结构和生物学功能。因此，可用于诱导毛发再生和毛囊重建的仿生毛囊—血管生物3d打印皮肤替代品已经成为了实现功能性皮肤组织再生的迫切需求。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明提供一种无机/有机复合的微图案多细胞支架及其制备方法和应用。
5.一方面，本发明提供了一种无机/有机复合的微图案多细胞支架，包括：负载细胞a的无机/有机复合生物墨水排布而成的三维网络状支架框架，以及填充在三维网络状支架框架的孔结构中的负载细胞b的水凝胶生物墨水排布而成的散点状框架。
6.本发明中，所述无机/有机复合的微图案多细胞支架模拟人体皮肤组织中分布的密集血管网络和毛囊结构，能够诱导毛发再生和血管重建，对于皮肤组织修复、皮肤附属器再生和皮肤生理功能恢复具有重要意义。
7.较佳的，所述负载细胞a的无机/有机复合生物墨水排布而成的三维网络状支架框架的孔隙率为30～50％，孔结构的直径为800μm～2mm。
8.较佳的，所述三维网络状支架框架和散点状框架形成仿生化图案。
9.较佳的，所述负载细胞a的无机/有机复合生物墨水包含细胞a、生物活性无机材料和第一水凝胶基质；优选，所述细胞a为血管内皮细胞，优选为人脐静脉内皮细胞、人真皮微血管内皮
细胞中的一种；优选，所述生物活性无机材料为硅酸镁纳米空心球，更优选硅酸镁纳米空心球的粒径为400～600nm。
10.较佳的，所述负载细胞b的水凝胶生物墨水包含细胞b和第二水凝胶基质；优选，所述细胞b为真皮乳头细胞，优选为人真皮毛乳头细胞、人毛囊干细胞中的一种；所述负载细胞b的水凝胶生物墨水中细胞b的负载量为300～500万/ml。
11.较佳的，所述第一水凝胶基质包括甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸、胶原、甲基纤维素中的至少一种，优选为甲基丙烯酰化明胶与甲基纤维素的均匀混合物；更优选为甲基丙烯酰化明胶与甲基纤维素的均匀混合物中甲基丙烯酰化明胶与甲基纤维素的质量比为(100～150)：1。
12.较佳的，所述第二水凝胶基质包括甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸、胶原、甲基纤维素中的至少一种，优选为甲基丙烯酰化明胶。
13.较佳的，所述生物活性无机材料的质量不超过第一水凝胶基质质量的8wt％，优选为0.1～6wt％；所述负载细胞a的无机/有机复合生物墨水中细胞a的负载量为300～500万/ml。
14.较佳的，所述负载细胞a的无机/有机复合生物墨水排布而成的网络状支架框架和负载细胞b的水凝胶生物墨水排布而成的散点状框架的质量比为(1～3)：1。
15.另一方面，本发明提供了一种无机/有机复合的微图案多细胞支架的制备方法，包括：(1)利用生物3d打印技术逐层打印负载细胞a的无机/有机复合生物墨水，制备具有宏观孔结构的三维网络状支架框架；(2)将负载细胞b的水凝胶生物墨水填充至具有宏观孔结构的三维网络状支架框架的孔结构中，得到复合三维支架；(3)将所得复合三维支架进行交联固化，得到所述无机/有机复合的微图案多细胞支架；优选地，交联固化的温度为10～25℃，时间为30～60秒。
16.再一方面，本发明提供了一种无机/有机复合的微图案多细胞支架在制备皮肤组织工程材料中的应用，其特征在于，所述皮肤组织工程材料包括毛发再生材料、毛囊重建材料、治疗雄激素脱发材料。
17.有益效果：在本公开中，无机/有机复合微图案多细胞支架，两种细胞在三维空间中呈现仿生图案化分布，模拟皮肤组织中的毛囊和血管组织结构，可以促进毛囊和血管重建、诱导毛发再生以及皮肤组织修复。
附图说明
18.图1中(a)为硅酸镁纳米球(ms)的sem照片，(b)为硅酸镁纳米球(ms)的tem照片，(c)为ms纳米球中mg、si、o元素分布的eds图片，(d)为ms纳米球的xrd图谱；图2中(a)为gelma/甲基纤维素(gm)混合水凝胶基质内部的sem照片，(b)不同浓度ms复合的gm生物墨水基体水凝胶在剪切速率0.1-10s-1变化范围内的流变学性能；图3中(a)为生物3d打印的不同ms含量的微图案多细胞支架(co-gm，co-2ms-gm，
co-4ms-gm，co-6ms-gm)照片。(b)为微图案多细胞支架内部的sem以及c、o、mg、si元素的分布和合并后的eds图像；图4为生物3d打印ms复合微图案多细胞支架内的细胞分布(a)荧光显微照片及(b)3d立体图像，其中微图案由网格状分布的的huvecs细胞(红色)和点状分布的hhdpcs细胞(绿色)组成。图5为培养1、7、14、21天后生物3d打印ms复合微图案多细胞支架内的(a)细胞活死染色表征(活细胞：绿色，死细胞：红色)以及(b)细胞存活率统计；图6为培养1天和14天后co-gm、co-2ms-gm、co-4ms-gm微图案多细胞支架内hhdpcs的细胞形态变化；图7为生物3d打印co-gm、co-2ms-gm和co-4ms-gm微图案多细胞支架内成血管相关基因(ve-cad、kdr、hif-1α、enos-1和bfgf)和毛囊发育相关基因(c-myc、pdgf-α、pdgf-β、vegf)的表达(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，n＝4)；图8为ms复合多细胞支架(co-2ms-gm)和ms复合单细胞支架(ec-2ms-gm、dp-2ms-gm)内成血管相关基因和毛囊形成相关基因表达的对比(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，n＝3)；图9为生物3d打印微图案支架的体内移植实验，包括：经过blank，ec-2ms-gm(单细胞支架)，co-gm(多细胞支架)和co-2ms-gm(多细胞支架)处理后第0、8、10、12、14天的(a)皮肤创面照片以及(b)相对伤口面积的统计分析(**p＜0.01，***p＜0.001，n＝5)，(c)为第30天裸鼠新生皮肤中毛发生长情况(黄色箭头)，(d)为第14天和(e)为第30天各组皮肤样本的h&e染色图片显示co-gm和co-2ms-gm组中出现新生毛囊且co-2ms-gm组中毛囊再生数量最多；图10为裸鼠皮肤组织血管形成和毛囊再生的组织学分析，其中(a)为cd31免疫荧光染色结果显示，第14天时co-2ms-gm组皮肤组织中有最密集的血管生成(蓝色：细胞核，绿色：cd31)，(b)为第30天，co-2ms-gm组的免疫荧光染色结果中k5(绿色)和ae13(红色)蛋白的强阳性表达证明了ms无机/有机复合微图案多细胞支架对于毛囊重建的效果最好；图11为雄激素性脱发(aga)c57bl/6小鼠体内皮肤修复和毛发再生实验，其中(a)为治疗0、7、15、25和40天后，blank、gm和co-2ms-gm组中小鼠皮肤损伤部位的代表性照片，第0、7、15、25和40天的相对伤口面积(c)和毛发覆盖率的统计(d)，结果显示co-2ms-gm微图案多细胞支架促进皮肤再生和毛发的突出效果，(b)为空白组、gm组和co-2ms-gm组中新生毛发的sem图像和毛发直径统计分析；图12为第25天小鼠皮肤样本的h&e染色照片。将黑框放大后能够清楚观察到co-ms-gm组的新生毛囊；图13为ki67的免疫组化染色照片显示co-2ms-gm组的皮肤组织中密集分布着具有高活性的毛囊。
具体实施方式
19.以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
20.本公开中，无机/有机复合的微图案多细胞支架能够模拟皮肤组织中分布着毛囊
和血管网络的结构，诱导皮肤组织修复过程中的毛发和血管再生。在可选的实施方式中，无机/有机复合的微图案多细胞支架中所含的生物活性无机材料为可对细胞活动产生积极调控作用的纳米颗粒优选为硅酸镁纳米空心球。
21.在本发明一实施方式中，无机/有机复合的微图案多细胞支架利用血管内皮细胞和真皮乳头细胞组成的三维仿生微图案，模拟皮肤中的点状分布毛囊和网状分布血管。
22.以下示例性地说明无机/有机复合的微图案多细胞支架的制备方法。
23.采用硬模板法，以sio2纳米球作为模板，水热处理，制备得到硅酸镁纳米空心球。
24.sio2纳米球的合成方法如下：称取一定量的无水乙醇和浓氨水，将二者混合后放置于30℃水浴锅中搅拌。称取少量正硅酸乙酯，快速倒入乙醇—氨水混合溶液中，封住杯口，继续搅拌1h。将混合物离心得到下层白色沉淀，将其超声水洗、醇洗各三次后放入烘箱中至完全干燥，得到白色粉体即为sio2纳米球。上述称取的无水乙醇和浓氨水质量比为8:3，混合溶液与正硅酸乙酯的体积比为25:1。
25.硅酸镁纳米空心球的制备方法为：称取一定量的sio2纳米球模板，加入一定量去离子水后超声分散30min。称取mg源和铵盐粉体，加入溶剂搅拌至两种粉体完全溶解混合。所述mg源为mgcl2、mg(no3)2、mgso4中的至少一种，所述铵盐为nh4cl、nh4no3、(nh4)2so4中的至少一种，所述溶剂为去离子水、纯水、超纯水中的至少一种。用注射器吸取少量浓氨水，缓慢逐滴加入镁盐—铵盐混合溶液中，滴加完毕后继续搅拌30min。迅速倒入超声后的sio2分散液以及无水乙醇，继续搅拌。最后将混合物装入聚四氟乙烯水热反应釜，140℃下水热反应12h。反应结束后收集反应釜底层白色沉淀，将其超声水洗、醇洗各三次，放入60℃烘箱至完全干燥，得到硅酸镁纳米空心球。上述称取的mg源和铵盐摩尔比范围为1:10至1:20。镁盐—铵盐混合溶液、sio2分散液以及无水乙醇的体积比为3:2:2。
26.负载huvecs的无机/有机复合生物墨水的制备：称取少量苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰次膦酸锂(lap)光引发剂溶解于一定量pbs缓冲溶液中，向其中加入甲基丙烯酰化明胶(gelma)，避光置于65℃水浴锅中溶解，配制成gelma溶液。向其中加入极少量甲基纤维素(mc)，待其完全溶解后得到gelma-mc(gm)基体材料。用0.22μm滤菌膜过滤除菌后，在37℃水浴锅中保温待用。称取一定量硅酸镁纳米球，放入紫外交联仪中紫外光照1h以上进行灭菌。之后向硅酸镁纳米球中加无菌pbs缓冲溶液，超声分散2h后与gelma-mc溶液进行充分混合，得到硅酸镁复合的基体水凝胶材料。使用胰蛋白酶将培养并扩增到第六代的人脐静脉内皮细胞(huvecs)消化下来，离心后，混入复合水凝胶基体中，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。即得到负载huvecs的无机/有机复合生物墨水。
27.负载hhdpcs的生物墨水的制备：将配置好的gelma溶液用无菌pbs缓冲溶液进行稀释2倍。使用胰蛋白酶将培养并扩增到第三代的人真皮毛乳头细胞(hhdpcs)消化下来，离心后，混入稀释后的gelma溶液中，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。即得到负载hhdpcs的生物墨水。
28.生物3d打印过程：本制备过程采用挤出式打印，具体如下：
29.框架制备。负载huvecs的无机/有机复合生物墨水被封入金属料筒中，在4℃冰箱中放置约20min形成预凝胶。之后将料筒装入生物3d打印机的冷却打印通道，在无菌条件下进行打印。冷却通道和打印平台的设置温度为10℃，所使用的挤出式打印的气压约30-70kpa，打印针头型号为27g，针头内径约250μm。打印程序设置为层间旋转角度90
°
，制备具
有正方形大孔结构的三维支架框架。。
30.框架填充。huvecs细胞框架打印完成后，将负载hhdpcs细胞的生物墨水充分填充于框架的孔洞中。最终huvecs框架与hhdpcs填充部分形成一个整体。使用蓝光照射支架约1min，使其充分交联，即得到生物3d打印微图案多细胞支架。
31.支架被转移至12孔板中，以ecm:mscm＝1:1比例配制混合培养基，向每孔加入混合培养基后将孔板放入37℃培养箱中进行培养。每两天进行一次换液。
32.下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
33.实施例1硅酸镁纳米空心球的制备：称取64g无水乙醇和24g浓氨水于烧杯中，将其混合后放置于30℃℃水浴锅中搅拌10min。称取4.2ml正硅酸乙酯，快速倒入乙醇—氨水混合溶液中，封住杯口，继续搅拌1h。将混合物5000rpm/min离心5min，得到下层白色沉淀，将其超声水洗、醇洗各三次后放入60℃℃烘箱中至完全干燥，得到白色粉体即为sio2模板。
34.称取0.1g sio2模板，加入20ml去离子水后超声分散30min。称取0.15g六水合氯化镁和0.54g氯化铵于同一烧杯中，加入30ml去离子水搅拌至粉体完全溶解。用注射器吸取1ml浓氨水，缓慢逐滴加入氯化镁—氯化铵混合溶液中，滴加完毕后继续搅拌30min。迅速倒入超声后的sio2分散液以及25ml无水乙醇，继续搅拌1h。最后将混合物装入50ml聚四氟乙烯水热反应釜，140℃℃下水热反应12h。反应结束后收集反应釜底层白色沉淀，将其超声水洗、醇洗各三次，放入60℃℃烘箱至完全干燥，得到ms纳米空心球。
35.图1中a、b、c分别为按照上述方法制备出的硅酸镁纳米空心球的扫描电镜、透射电镜以及eds照片。ms内部中空，壳厚均匀，外部表面粗糙，覆盖着纳米薄片结构，mg、si、o元素均匀分布在ms纳米球中。图1中d为x射线衍射分析结果，证明制备出了形貌规整的硅酸镁纳米空心球，纳米球直径约400-500nm，为结晶度较低的mg3si4o
10
(oh)2相。
36.实施例2ms-gm无机/有机复合生物墨水的制备：称取0.05g lap光引发剂溶解于10ml pbs缓冲溶液中，向其中加入1.2g gelma，避光置于65℃水浴锅中溶解。待gelma完全溶解得到浓度为12％的gelma溶液。向其中加入0.01g甲基纤维素(mc)，待其完全溶解后得到gelma-mc(gm)基体材料用0.22μm滤菌膜过滤除菌后，在37℃水浴锅中保温待用。分别称取0.0048g，0.0096g，0.0144g ms粉体(2ml 12％ gelma质量的2％，4％，6％)，放入紫外交联仪中紫外光照1h以上进行灭菌。之后分别向ms中各加入2ml无菌pbs缓冲溶液，超声分散2h，再将不同浓度的2ml ms分散液分别与2ml gelma-mc溶液进行充分混合，得到gm，2ms-gm，4ms-gm，6ms-gm四种不同浓度ms复合的基体水凝胶材料。用胰蛋白酶将培养并扩增到第六代的huvecs消化下来，离心后，混入四种复合水凝胶基体中，细胞浓度约300-400万/ml，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。充分混合后的四种负载huvecs细胞的生物墨水记为ec-gm，ec-2ms-gm，ec-4ms-gm，ec-6ms-gm。
37.图2中a表明ms-gm复合基体水凝胶内部具有密集多孔结构，充分保证细胞在凝胶
中的活性。图2中b表明ec-gm，ec-2ms-gm，ec-4ms-gm，ec-6ms-gm四种生物墨水具有剪切稀化性能，可用于挤出式生物3d打印。
38.实施例3无机/有机复合微图案多细胞支架的制备：步骤(1)：ms-gm无机/有机复合生物墨水的制备称取0.05g lap光引发剂溶解于10ml pbs缓冲溶液中，向其中加入1.2g gelma，避光置于65℃水浴锅中溶解。待gelma完全溶解得到浓度为12％的gelma溶液。向其中加入0.01g甲基纤维素(mc)，待其完全溶解后得到gelma-mc(gm)基体材料用0.22μm滤菌膜过滤除菌后，在37℃水浴锅中保温待用。分别称取0.0048g，0.0096g，0.0144g ms粉体(2ml 12％ gelma质量的2％，4％，6％)，放入紫外交联仪中紫外光照1h以上进行灭菌。之后分别向ms中各加入2ml无菌pbs缓冲溶液，超声分散2h，再将不同浓度的2ml ms分散液分别与2ml gelma-mc溶液进行充分混合，得到gm，2ms-gm，4ms-gm，6ms-gm四种不同浓度ms复合的基体水凝胶材料。用胰蛋白酶将培养并扩增到第六代的huvecs消化下来，离心后，混入四种复合水凝胶基体中，细胞浓度约300-400万/ml，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。充分混合后的四种负载huvecs细胞的生物墨水记为ec-gm，ec-2ms-gm，ec-4ms-gm，ec-6ms-gm；步骤(2)：将配置好的12％ gelma溶液用无菌pbs缓冲溶液进行稀释2倍得到6％ gelma溶液。使用胰蛋白酶将培养并扩增到第三代的hhdpcs消化下来，离心后，混入6％gelma溶液中，细胞浓度约500万/ml，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。得到负载hhdpcs细胞的生物墨水2；步骤(3)：打印ms-gm无机/有机复合微图案多细胞支架框架将ec-gm，ec-2ms-gm，ec-4ms-gm，ec-6ms-gm四种生物墨水被分别封入金属料筒中，在4℃冰箱中放置约20min形成预凝胶。之后将各金属料筒装入生物3d打印机的冷却打印通道，在无菌条件下分别进行打印。冷却通道和打印平台的设置温度为10℃，所使用的挤出式打印的气压约20-40kpa，打印针头型号为27g，针头内径约250μm。打印程序设置为层间旋转角度90
°
，高度约0.6mm的正方形大孔结构框架，框架间距约1.5mm(即正方形边长)；得到孔隙率约为40％huvecs细胞框架；步骤(4)：框架填充huvecs细胞框架打印完成后，将负载hhdpcs细胞的生物墨水填充在框架的孔洞部分。最终huvecs框架与hhdpcs填充的孔洞形成一个整体。使用蓝光照射支架约1min，使其充分交联，即得到无机/有机复合微图案多细胞支架。支架被转移至12孔板中后，以ecm:mscm＝1:1比例配制混合培养基，每孔加入1ml混合培养基后将支架放入37℃培养箱中进行培养。每两天进行一次换液。根据ms的四种不同含量，微图案多细胞支架被分别记为co-gm(网络状支架框架和散点填充部分的质量比为1.5：1)，co-2ms-gm(网络状支架框架和散点填充部分的质量比为1.5：1)，co-4ms-gm(网络状支架框架和散点填充部分的质量比为1.5：1)和co-6ms-gm(网络状支架框架和散点填充部分的质量比为1.5：1)。
39.图3显示打印出的四种支架的外形，硅酸镁纳米球分散在支架内部。
40.实施例4无机/有机复合微图案多细胞支架的细胞分布步骤(1)：ms-gm无机/有机复合生物墨水的制备称取0.05g lap光引发剂溶解于10ml pbs缓冲溶液中，向其中加入1.2g gelma，避光置于65℃水浴锅中溶解。待gelma完全溶解得到浓度为12％的gelma溶液。向其中加入
gelma-mc溶液进行充分混合，得到gm，2ms-gm，4ms-gm，6ms-gm四种不同浓度ms复合的基体水凝胶材料。用胰蛋白酶将培养并扩增到第六代的huvecs消化下来，离心后，混入四种复合水凝胶基体中，细胞浓度约300-400万/ml，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。充分混合后的四种负载huvecs细胞的生物墨水记为ec-gm，ec-2ms-gm，ec-4ms-gm，ec-6ms-gm；步骤(2)：将配置好的12％ gelma溶液用无菌pbs缓冲溶液进行稀释2倍得到6％ gelma溶液。使用胰蛋白酶将培养并扩增到第三代的hhdpcs消化下来，离心后，混入6％gelma溶液中，细胞浓度约500万/ml，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。得到包裹hhdpcs细胞的生物墨水2；步骤(3)：打印ms-gm无机/有机复合微图案多细胞支架框架将ec-gm，ec-2ms-gm，ec-4ms-gm，ec-6ms-gm四种生物墨水被分别封入金属料筒中，在4℃冰箱中放置约20min形成预凝胶。之后将各金属料筒装入生物3d打印机的冷却打印通道，在无菌条件下分别进行打印。冷却通道和打印平台的设置温度为10℃，所使用的挤出式打印的气压约20-40kpa，打印针头型号为27g，针头内径约250μm。打印程序设置为层间旋转角度90
°
，高度约0.6mm的正方形大孔结构框架，框架间距约1.5mm；得到孔隙率约为40％huvecs细胞框架；步骤(4)：框架填充huvecs细胞框架打印完成后，将负载hhdpcs细胞的生物墨水填充在框架的孔洞部分。最终huvecs框架与hhdpcs填充的孔洞形成一个整体。使用蓝光照射支架约1min，使其充分交联，即得到无机/有机复合微图案多细胞支架。支架被转移至12孔板中后，以ecm:mscm＝1:1比例配制混合培养基，每孔加入1ml混合培养基后将支架放入37℃培养箱中进行培养。每两天进行一次换液。根据ms的四种不同含量，微图案多细胞支架被分别记为co-gm(网络状支架框架和散点填充部分的质量比为1.5：1)，co-2ms-gm(网络状支架框架和散点填充部分的质量比为1.5：1)，co-4ms-gm(网络状支架框架和散点填充部分的质量比为1.5：1)和co-6ms-gm(网络状支架框架和散点填充部分的质量比为1.5：1)；步骤(5)：细胞活/死染色及统计在微图案支架培养的第1、7、14和21天分别进行活/死荧光染色拍照。使用calcein-am/pi双染色试剂盒配制am:pi:ecm:mscm＝2:3:500:500细胞活/死染色溶液。吸去支架的培养基后加入荧光染色溶液使其浸没支架，将支架放入37℃℃培养箱中孵育20 min。使用荧光显微镜进行拍照。细胞存活率的统计通过细胞计数的方式进行。分别计算各组荧光照片相同区域内的活细胞数量和死细胞数量，细胞存活率(％)＝活细胞数量/活细胞与死细胞数量之和。
43.图5显示无机/有机复合微图案多细胞支架内的细胞活性。co-gm，co-2ms-gm和co-4ms-gm微图案多细胞支架能够在长达21天的培养过程中保持支架内两种细胞的高度存活(绿色荧光)。相反，co-6ms-gm微图案多细胞支架中死亡细胞数明显增加(红色荧光)。定量统计结果显示，co-gm、co-2ms-gm支架在前期培养过程中一直保持细胞存活率高于85％，培养到21天时已经上升至95％以上。co-4ms-gm支架培养前期的细胞存活率约70％，到第21天存活率也已增长至85％。而co-6ms-gm支架内的细胞存活率始终低于30％，表明高含量ms对细胞存活产生了不利影响。
44.综合以上结果，co-gm、co-2ms-gm、co-4ms-gm为具备较佳生物活性的支架。
45.实施例6无机/有机复合微图案多细胞支架的细胞形态步骤(1)：ms-gm无机/有机复合生物墨水的制备称取0.05 g lap光引发剂溶解于10 ml pbs缓冲溶液中，向其中加入1.2 g gelma，避光置于65℃水浴锅中溶解。待gelma完全溶解得到浓度为12％的gelma溶液。向其中加入0.01 g甲基纤维素(mc)，待其完全溶解后得到gelma-mc(gm)基体材料用0.22μm滤菌膜过滤除菌后，在37℃水浴锅中保温待用。分别称取0.0048 g，0.0096 g ms粉体(2 ml12％gelma质量的2％，4％)，放入紫外交联仪中紫外光照1 h以上进行灭菌。之后分别向ms中各加入2 ml无菌pbs缓冲溶液，超声分散2 h，再将不同浓度的2 ml ms分散液分别与2 ml gelma-mc溶液进行充分混合，得到gm，2ms-gm，4ms-gm三种不同浓度ms复合的基体水凝胶材料。用胰蛋白酶将培养并扩增到第六代的huvecs消化下来，离心后，混入四种复合水凝胶基体中，细胞浓度约300-400万/ml，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。充分混合后的四种负载huvecs细胞的生物墨水记为ec-gm，ec-2ms-gm，ec-4ms-gm；步骤(2)：将配置好的12％gelma溶液用无菌pbs缓冲溶液进行稀释2倍得到6％gelma溶液。使用胰蛋白酶将培养并扩增到第三代的hhdpcs消化下来，离心后，混入6％gelma溶液中，细胞浓度约500万/ml，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。得到负载hhdpcs细胞的生物墨水2；步骤(3)：打印ms-gm无机/有机复合微图案多细胞支架框架将ec-gm，ec-2ms-gm，ec-4ms-gm三种生物墨水被分别封入金属料筒中，在4℃冰箱中放置约20min形成预凝胶。之后将各金属料筒装入生物3d打印机的冷却打印通道，在无菌条件下分别进行打印。冷却通道和打印平台的设置温度为10℃，所使用的挤出式打印的气压约20-40kpa，打印针头型号为27g，针头内径约250μm。打印程序设置为层间旋转角度90
°
，高度约0.6mm的正方形大孔结构框架，框架间距约1.5mm；得到孔隙率约为40％huvecs细胞框架；步骤(4)：框架填充huvecs细胞框架打印完成后，将负载hhdpcs细胞的生物墨水填充在框架的孔洞部分。最终huvecs框架与hhdpcs填充的孔洞形成一个整体。使用蓝光照射支架约1min，使其充分交联，即得到无机/有机复合微图案多细胞支架。支架被转移至12孔板中后，以ecm:mscm＝1:1比例配制混合培养基，每孔加入1ml混合培养基后将支架放入37℃培养箱中进行培养。每两天进行一次换液。根据ms的四种不同含量，微图案多细胞支架被分别记为co-gm(网络状支架框架和散点填充部分的质量比为1.5：1)，co-2ms-gm(网络状支架框架和散点填充部分的质量比为1.5：1)，co-4ms-gm(网络状支架框架和散点填充部分的质量比为1.5：1)；步骤(5)：支架内部细胞核/骨架染色体外培养1天和14天后，将生物3d打印支架浸泡在4％多聚甲醛溶液中固定30分钟以上，加入pbs溶液置于摇床上清洗。之后对细胞核和细胞骨架进行染色。加入alex fluor647共轭鬼笔环肽荧光染料室温下避光染色1h。pbs缓冲溶液清洗后加入dapi荧光染料，置于摇床上避光染色10分钟。染色完成后，通过共聚焦激光扫描显微镜在波长为405nm和647nm的激发光照射下观测hhdpcs细胞核以及细胞骨架的荧光显微照片。
46.图6显示毛囊干细胞在1至14天的培养过程中发生迁移并聚集成三维球体，球形形成能够实现对真皮毛乳头结构的部分模拟，为毛囊形成提供基础，证明了微图案多细胞支
架内hhdpcs细胞的高活性。
47.实施例7无机/有机复合微图案多细胞支架的成血管和成毛囊基因表达步骤(1)：ms-gm无机/有机复合生物墨水的制备：称取0.05g lap光引发剂溶解于10ml pbs缓冲溶液中，向其中加入1.2g gelma，避光置于65℃水浴锅中溶解。待gelma完全溶解得到浓度为12％的gelma溶液。向其中加入0.01g甲基纤维素(mc)，待其完全溶解后得到gelma-mc(gm)基体材料用0.22μm滤菌膜过滤除菌后，在37℃水浴锅中保温待用。分别称取0.0048g，0.0096g ms粉体(2ml 12％ gelma质量的2％，4％)，放入紫外交联仪中紫外光照1h以上进行灭菌。之后分别向ms中各加入2ml无菌pbs缓冲溶液，超声分散2h，再将不同浓度的2ml ms分散液分别与2ml gelma-mc溶液进行充分混合，得到gm，2ms-gm，4ms-gm三种不同浓度ms复合的基体水凝胶材料。用胰蛋白酶将培养并扩增到第六代的huvecs消化下来，离心后，混入四种复合水凝胶基体中，细胞浓度约300-400万/ml，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。充分混合后的四种负载huvecs细胞的生物墨水记为ec-gm，ec-2ms-gm，ec-4ms-gm；步骤(2)：将配置好的12％ gelma溶液用无菌pbs缓冲溶液进行稀释2倍得到6％ gelma溶液。使用胰蛋白酶将培养并扩增到第三代的hhdpcs消化下来，离心后，混入6％gelma溶液中，细胞浓度约500万/ml，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。得到负载hhdpcs细胞的生物墨水2；步骤(3)：打印ms-gm无机/有机复合微图案多细胞支架框架：将ec-gm，ec-2ms-gm，ec-4ms-gm三种生物墨水被分别封入金属料筒中，在4℃冰箱中放置约20min形成预凝胶。之后将各金属料筒装入生物3d打印机的冷却打印通道，在无菌条件下分别进行打印。冷却通道和打印平台的设置温度为10℃，所使用的挤出式打印的气压约20-40kpa，打印针头型号为27g，针头内径约250μm。打印程序设置为层间旋转角度90
°
，高度约0.6mm的正方形大孔结构框架，框架间距约1.5mm；得到孔隙率约为40％huvecs细胞框架；步骤(4)：框架填充：huvecs细胞框架打印完成后，将负载hhdpcs细胞的生物墨水填充在框架的孔洞部分。最终huvecs框架与hhdpcs填充的孔洞形成一个整体。使用蓝光照射支架约1min，使其充分交联，即得到无机/有机复合微图案多细胞支架。支架被转移至12孔板中后，以ecm:mscm＝1:1比例配制混合培养基，每孔加入1ml混合培养基后将支架放入37℃培养箱中进行培养。每两天进行一次换液。根据ms的四种不同含量，微图案多细胞支架被分别记为co-gm(网络状支架框架和散点填充部分的质量比为1.5：1)，co-2ms-gm(网络状支架框架和散点填充部分的质量比为1.5：1)，co-4ms-gm(网络状支架框架和散点填充部分的质量比为1.5：1)；步骤(5)：支架内部成血管和毛囊分化相关基因的表达水平检测：将培养7天后的co-gm、co-2ms-gm、co-4ms-gm支架进行1.5-2h的裂解，离心后收集沉淀，提取支架内的细胞。向其中加入1ml trizol试剂将细胞裂解并提取细胞内rna，通过primescript 1st strand试剂盒将rna反转录得到cdna。使用rt-qpcr仪器对各组支架中成血管相关基因和毛囊分化相关基因分别进行检测。
48.图7显示co-2ms-gm微图案多细胞支架内五种成血管基因(ve-cad、kdr、hif-1α、enos-1和bfgf)和四种毛囊分化相关基因(c-myc、pdgf-α、pdgf-β、vegf)的表达都显著提升。因此，co-2ms-gm无机/有机复合微图案多细胞支架兼具高成血管和成毛囊活性。
49.实施例8无机/有机复合微图案多细胞支架与单细胞支架的生物活性对比步骤
(1)：ms-gm无机/有机复合生物墨水的制备：称取0.05g lap光引发剂溶解于10ml pbs缓冲溶液中，向其中加入1.2g gelma，避光置于65℃水浴锅中溶解。待gelma完全溶解得到浓度为12％的gelma溶液。向其中加入0.01g甲基纤维素(mc)，待其完全溶解后得到gelma-mc(gm)基体材料用0.22μm滤菌膜过滤除菌后，在37℃水浴锅中保温待用。称取0.0048g ms粉体(2ml 12％ gelma质量的2％)，放入紫外交联仪中紫外光照1h以上进行灭菌。之后向ms中各加入2ml无菌pbs缓冲溶液，超声分散2h，再将2ml ms分散液与2ml gelma-mc溶液进行充分混合，得到2ms-gm基体水凝胶材料。用胰蛋白酶将培养并扩增到第六代的huvecs消化下来，用红色荧光标记，离心后，混入四种复合水凝胶基体中，细胞浓度约300-400万/ml，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。充分混合后得到负载huvecs细胞的生物墨水ec-2ms-gm；步骤(2)：将配置好的12％ gelma溶液用无菌pbs缓冲溶液进行稀释2倍得到6％ gelma溶液。使用胰蛋白酶将培养并扩增到第三代的hhdpcs消化下来，用绿色荧光标记，离心后，混入6％ gelma溶液中，细胞浓度约500万/ml，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。得到负载hhdpcs细胞的生物墨水2；步骤(3)：打印ms-gm无机/有机复合微图案多细胞支架框架：将ec-2ms-gm生物墨水封入金属料筒中，在4℃冰箱中放置约20min形成预凝胶。之后将金属料筒装入生物3d打印机的冷却打印通道，在无菌条件下避光进行打印。冷却通道和打印平台的设置温度为10℃，所使用的挤出式打印的气压约20-40kpa，打印针头型号为27g，针头内径约250μm。打印程序设置为层间旋转角度90
°
，高度约0.6mm的正方形大孔结构框架，框架间距约1.5mm；得到孔隙率约为40％huvecs细胞框架；步骤(4)：框架填充：huvecs细胞框架打印完成后，将负载hhdpcs细胞的生物墨水填充在框架的孔洞部分。最终huvecs框架与hhdpcs填充的孔洞形成一个整体。使用蓝光照射支架约1min，使其充分交联，即得到co-2ms-gm无机/有机复合微图案多细胞支架(网络状支架框架和散点状框架的质量比为1.5：1)。支架被转移至12孔板中后，以ecm:mscm＝1:1比例配制混合培养基，每孔加入1ml混合培养基后将支架放入37℃培养箱中进行培养。每两天进行一次换液；步骤(5)：单细胞支架的制备：运用同样的方法分别制备只含有huvecs细胞和只含有hhdpcs细胞的无机/有机复合单种细胞支架ec-2ms-gm和dp-2ms-gm。两种单细胞支架内ms、细胞的分布位置与微图案多细胞支架内相应的材料和细胞分布保持一致；步骤(6)：多细胞支架与单细胞支架的相关基因表达：将培养7天后的co-2ms-gm、ec-2ms-gm和dp-2ms-gm支架进行1.5-2h的裂解，离心后收集沉淀，提取支架内的细胞。向其中加入1ml trizol试剂将细胞裂解并提取细胞内rna，通过primescript 1st strand试剂盒将rna反转录得到cdna。使用rt-qpcr仪器对各组支架中成血管相关基因和毛囊分化相关基因分别进行检测。
50.图8显示co-2ms-gm支架共培养系统中的vegf、hif-1α、kdr和ve-cad四种成血管基因的表达水平都显著高于ec-2ms-gm单培养系统，这证明hhdpcs的加入能够进一步提升三维系统的血管生成能力。另一方面，相对于dp-2ms-gm支架单培养系统来说，共培养系统中huvecs的存在对于提升c-myc、pdgf-β、vegf毛囊相关基因的表达起到积极促进作用。以上结果证明了所构建的co-2ms-gm微图案多细胞共培养系统的优越性。
51.实施例9无机/有机复合微图案多细胞支架对裸鼠皮肤损伤的组织修复效果步骤(1)：ms-gm无机/有机复合生物墨水的制备：称取0.05g lap光引发剂溶解于10ml pbs缓冲溶液中，向其中加入1.2g gelma，避光置于65℃水浴锅中溶解。待gelma完全溶解得到浓度为12％的gelma溶液。向其中加入0.01g甲基纤维素(mc)，待其完全溶解后得到gelma-mc(gm)基体材料用0.22μm滤菌膜过滤除菌后，在37℃水浴锅中保温待用。称取0.0048g ms粉体(2ml 12％ gelma质量的2％)，放入紫外交联仪中紫外光照1h以上进行灭菌。之后向ms中各加入2ml无菌pbs缓冲溶液，超声分散2h，再将2ml ms分散液与2ml gelma-mc溶液进行充分混合，得到2ms-gm基体水凝胶材料。用胰蛋白酶将培养并扩增到第六代的huvecs消化下来，用红色荧光标记，离心后，混入四种复合水凝胶基体中，细胞浓度约300-400万/ml，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。充分混合后得到负载huvecs细胞的生物墨水ec-2ms-gm；步骤(2)：将配置好的12％ gelma溶液用无菌pbs缓冲溶液进行稀释2倍得到6％ gelma溶液。使用胰蛋白酶将培养并扩增到第三代的hhdpcs消化下来，用绿色荧光标记，离心后，混入6％ gelma溶液中，细胞浓度约500万/ml，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。得到负载hhdpcs细胞的生物墨水2；步骤(3)：打印ms-gm无机/有机复合微图案多细胞支架框架：将ec-2ms-gm生物墨水封入金属料筒中，在4℃冰箱中放置约20min形成预凝胶。之后将金属料筒装入生物3d打印机的冷却打印通道，在无菌条件下避光进行打印。冷却通道和打印平台的设置温度为10℃，所使用的挤出式打印的气压约20-40kpa，打印针头型号为27g，针头内径约250μm。打印程序设置为层间旋转角度90
°
，高度约0.8mm的圆形大孔结构框架，圆半径5mm，框架间距约1.5mm；得到孔隙率约为40％huvecs细胞框架；步骤(4)：框架填充：huvecs细胞框架打印完成后，将负载hhdpcs细胞的生物墨水填充在框架的孔洞部分。最终huvecs框架与hhdpcs填充的孔洞形成一个整体。使用蓝光照射支架约1min，使其充分交联，即得到co-2ms-gm无机/有机复合微图案多细胞支架。支架被转移至12孔板中后，以ecm:mscm＝1:1比例配制混合培养基，每孔加入1ml混合培养基后将支架放入37℃培养箱中进行培养。每两天进行一次换液；步骤(5)：运用同样的方法制备只含有huvecs的单细胞支架ec-2ms-gm和不含硅酸镁纳米球的微图案多细胞支架co-gm；步骤(6)：裸鼠皮肤全层损伤模型的建立和治疗：选用雄性8周龄裸鼠(spf清洁级)进行全层皮肤缺损修复实验。裸鼠被随机分为4组：空白组(无支架)，ec-2ms-gm组，co-gm组和co-2ms-gm组。所有支架预先在体外培养3天后用于创面移植。手术前通过腹腔注射戊巴比妥钠对裸鼠进行麻醉。将裸鼠皮肤消毒后，在其背部用手术剪制造一个直径约10mm的圆形全层皮肤缺损创面。将支架移植到皮肤缺损部位后，使用缝合线、无菌纱布和医用敷料对支架进行固定和包扎。裸鼠在spf环境中分组进行饲养；步骤(7)：在第0、8、10、12、14天对裸鼠背部进行拍照记录。对实际伤口面积进行测量，计算各组在各时间点的相对伤口面积。第32天记录裸鼠背部毛发生长情况。收集第14天和第32天的皮肤组织通过组织学染色对创面皮肤组织样品进行分析。
52.图9显示各组14天内的创面愈合情况。根据伤口照片和相对伤口面积统计结果，co-2ms-gm组皮肤伤口愈合速率最快，其次是ec-2ms-gm和co-gm组。这证明ms复合的微图案
多细胞支架能够有效促进皮肤创面愈合。32天后，在co-gm和co-2ms-gm组的小鼠背部皮肤表面发现有毛发生长。根据组织学染色结果，前14天伤口愈合速率由大到小依次为co-2ms-gm组、co-gm组、ec-2ms-gm组、blank组。第14天时co-2ms-gm组的真皮重建和再上皮化已完成，而其他组的皮肤样本中仍存在未愈合的表皮和疤痕(黑色箭头)。第30天时co-2ms-gm组的皮肤组织中密集分布着毛囊，co-gm支架中出现的毛囊数量略少，其他组均未出现毛囊结构。
53.图10显示皮肤组织中cd31(内皮细胞连接标记)、k5(外根鞘标记)和ae13(内根鞘标记)蛋白免疫荧光染色结果，表征皮肤再生过程中血管和毛囊的形成。对比ec-2ms-gm组和co-gm组，co-2ms-gm中含有的ms和hhdpc能够显著促进血管形成。此外，30天时，在co-2ms-gm组中检测到功能性毛囊。与co-gm组相比，co-2ms-gm组新形成的毛囊分布更密集，部分呈拉长形态生长至真皮下层，ae13阳性反应强烈。因此，co-2ms-gm无机/有机复合微图案多细胞支架兼具毛发再生和血管重建的高生物活性。
54.实施例10无机/有机复合微图案多细胞支架对性激素脱发小鼠的毛发再生效果：步骤(1)：ms-gm无机/有机复合生物墨水的制备：称取0.05g lap光引发剂溶解于10ml pbs缓冲溶液中，向其中加入1.2g gelma，避光置于65℃水浴锅中溶解。待gelma完全溶解得到浓度为12％的gelma溶液。向其中加入0.01g甲基纤维素(mc)，待其完全溶解后得到gelma-mc(gm)基体材料用0.22μm滤菌膜过滤除菌后，在37℃水浴锅中保温待用。称取0.0048g ms粉体(2ml 12％ gelma质量的2％)，放入紫外交联仪中紫外光照1h以上进行灭菌。之后向ms中各加入2ml无菌pbs缓冲溶液，超声分散2h，再将2ml ms分散液与2ml gelma-mc溶液进行充分混合，得到2ms-gm基体水凝胶材料。用胰蛋白酶将培养并扩增到第六代的huvecs消化下来，用红色荧光标记，离心后，混入四种复合水凝胶基体中，细胞浓度约300-400万/ml，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。充分混合后得到负载huvecs细胞的生物墨水ec-2ms-gm；步骤(2)：将配置好的12％ gelma溶液用无菌pbs缓冲溶液进行稀释2倍得到6％ gelma溶液。使用胰蛋白酶将培养并扩增到第三代的hhdpcs消化下来，用绿色荧光标记，离心后，混入6％ gelma溶液中，细胞浓度约500万/ml，使用移液枪缓慢吹匀细胞使其均匀分散。得到负载hhdpcs细胞的生物墨水2；步骤(3)：打印ms-gm无机/有机复合微图案多细胞支架框架：将ec-2ms-gm生物墨水封入金属料筒中，在4℃冰箱中放置约20min形成预凝胶。之后将金属料筒装入生物3d打印机的冷却打印通道，在无菌条件下避光进行打印。冷却通道和打印平台的设置温度为10℃，所使用的挤出式打印的气压约20-40kpa，打印针头型号为27g，针头内径约250μm。打印程序设置为层间旋转角度90
°
，高度约0.8mm的圆形大孔结构框架，圆半径5mm，框架间距约1.5mm；得到孔隙率约为40％huvecs细胞框架；步骤(4)：框架填充：huvecs细胞框架打印完成后，将负载hhdpcs细胞的生物墨水填充在框架的孔洞部分。最终huvecs框架与hhdpcs填充的孔洞形成一个整体。使用蓝光照射支架约1min，使其充分交联，即得到co-2ms-gm无机/有机复合微图案多细胞支架。支架被转移至12孔板中后，以ecm:mscm＝1:1比例配制混合培养基，每孔加入1ml混合培养基后将支架放入37℃培养箱中进行培养。每两天进行一次换液；步骤(5)：运用同样的方法制备不含有细胞和硅酸镁纳米球的水凝胶支架gm；
步骤(6)：雄激素脱发(aga)小鼠模型的建立和治疗：采用8周龄雄性c57bl/6小鼠建立雄激素脱发(aga)模型。c57bl/6小鼠被随机分为3组：空白组(无支架)，gm组和co-2ms-gm组。小鼠每日皮下注射睾酮溶液(5mg/ml)。所有支架预先在体外培养3天后用于创面移植。注射后第7天，通过腹腔注射戊巴比妥钠对aga小鼠进行麻醉。将小鼠皮肤消毒后，在其背部用手术剪制造一个直径约10mm的圆形全层皮肤缺损创面。将支架移植到皮肤缺损部位后，使用缝合线、无菌纱布和医用敷料对支架进行固定和包扎。之后连续三周每日注射睾酮溶液。aga小鼠在spf环境中分组进行饲养；步骤(7)：在第0、7、15、25、40天对小鼠背部进行拍照记录。对实际伤口面积进行测量，计算各组在各时间点的相对伤口面积。收集第40天的毛发进行扫描电镜观察，收集第25天和第40天的皮肤组织通过组织学染色对创面皮肤组织样品进行分析。
55.aga是一种以脱发和毛囊退化为特征的慢性疾病。图11显示40天内aga小鼠背部的伤口愈合及毛发生长情况。三组中co-2ms-gm组的aga小鼠伤口愈合速度最快，在15天时已出现黑色素沉着，并在40天时再生出浓密的毛发，而其他两组中新生毛发数量极少。同时，对新生毛发直径进行统计分析后发现，co-2ms-gm组的再生毛发毛鳞片完整，毛发直径比其他两组更粗，表明其毛发质量更高。
56.图12和图13显示aga小鼠皮肤组织的组织学染色结果。he染色结果证明了co-2ms-gm组皮肤组织中的新生毛囊数量最多，而空白组和gm组中毛囊数量较少。ki67(细胞增殖标志物)免疫组化染色图像显示，co-2ms-gm组皮肤组织中分布着密集的高活性毛囊，证明co-2ms-gm微图案多细胞支架对于诱导毛囊发育的突出效果。

技术特征：
1.一种无机/有机复合的微图案多细胞支架，其特征在于，包括：负载细胞a的无机/有机复合生物墨水排布而成的三维网络状支架框架，以及填充在三维网络状支架框架的孔结构中的负载细胞b的水凝胶生物墨水排布而成的散点状框架。2.根据权利要求1所述的无机/有机复合的微图案多细胞支架，其特征在于，所述负载细胞a的无机/有机复合生物墨水排布而成的三维网络状支架框架的孔隙率为30～50％，孔结构的直径为800μm～2mm。3.根据权利要求1或2所述的无机/有机复合的微图案多细胞支架，其特征在于，所述三维网络状支架框架和散点状框架形成仿生化图案。4.根据权利要求1-3中任一项所述的微图案多细胞支架，其特征在于，所述负载细胞a的无机/有机复合生物墨水包含细胞a、生物活性无机材料和第一水凝胶基质；优选，所述细胞a为血管内皮细胞，优选为人脐静脉内皮细胞、人真皮微血管内皮细胞中的一种；优选，所述生物活性无机材料为硅酸镁纳米空心球，更优选硅酸镁纳米空心球的粒径为400～600nm。5.根据权利要求1-4中任一项所述的微图案多细胞支架，其特征在于，所述负载细胞b的水凝胶生物墨水包含细胞b和第二水凝胶基质；优选，所述细胞b为真皮乳头细胞，优选为人真皮毛乳头细胞、人毛囊干细胞中的一种；优选，所述负载细胞b的水凝胶生物墨水中细胞b的负载量为300万/ml～500万/ml。6.根据权利要求4所述的微图案多细胞支架，其特征在于，所述第一水凝胶基质包括甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸、胶原、甲基纤维素中的至少一种，优选为甲基丙烯酰化明胶与甲基纤维素的均匀混合物；更优选为甲基丙烯酰化明胶与甲基纤维素的均匀混合物中甲基丙烯酰化明胶与甲基纤维素的质量比为(100～150)：1。7.根据权利要求5所述的微图案多细胞支架，其特征在于，所述第二水凝胶基质包括甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸、胶原、甲基纤维素中的至少一种，优选为甲基丙烯酰化明胶。8.根据权利要求4所述的微图案多细胞支架，其特征在于，所述生物活性无机材料的质量不超过第一水凝胶基质质量的8wt％，优选为0.1～6wt％；所述负载细胞a的无机/有机复合生物墨水中细胞a的负载量为300万/ml～500万/ml。9.根据权利要求1-8中任一项所述的无机/有机复合的微图案多细胞支架，其特征在于，所述负载细胞a的无机/有机复合生物墨水排布而成的网络状支架框架和负载细胞b的水凝胶生物墨水排布而成的散点状框架的质量比为(1～3)：1。10.一种如权利要求1至9中任一项所述的无机/有机复合的微图案多细胞支架的制备方法，其特征在于，包括：(1)利用生物3d打印技术逐层打印负载细胞a的无机/有机复合生物墨水，制备具有宏观孔结构的三维网络状支架框架；(2)将负载细胞b的水凝胶生物墨水填充至具有宏观孔结构的三维网络状支架框架的孔结构中，得到复合三维支架；(3)将所得复合三维支架进行交联固化，得到所述无机/有机复合的微图案多细胞支架；优选地，交联固化的温度为10～25℃，时间为30～60秒。
11.一种如权利要求1至9中任一项所述的无机/有机复合的微图案多细胞支架在制备皮肤组织工程材料中的应用，其特征在于，所述皮肤组织工程材料包括毛发再生材料、毛囊重建材料、治疗雄激素脱发材料。

技术总结
本发明涉及一种无机/有机复合的微图案多细胞支架及其制备方法和应用。所述无机/有机复合的微图案多细胞支架包括：负载细胞A的无机/有机复合生物墨水排布而成的三维网络状支架框架，以及填充在三维网络状支架框架的孔结构中的负载细胞B的水凝胶生物墨水排布而成的散点状框架。散点状框架。散点状框架。


技术研发人员：吴成铁 马景阁
受保护的技术使用者：中国科学院上海硅酸盐研究所
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/9/5