一种两菌一步发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法

一种两菌一步发酵生产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法
技术领域
1.本发明主要涉及一种两菌一步发酵生产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.维生素c是一种对人体至关重要的水溶性维生素，具有很强的还原能力，参与生物体内的许多重要生化反应。除了抗氧化功能外，维生素c还参与胶原蛋白合成、激素合成、肉碱合成、基因转录、通过不同机制调节翻译等。灵长类动物、豚鼠和鱼类缺乏维生素c合成所需的古龙内酯氧化酶(gulo)，因此它们必须依赖外源性维生素c补充。目前，维生素c的年需求量达到22万吨，广泛应用于制药、食品、健康、化妆品和饲料行业。
3.目前维生素c工业化生产主要通过“莱氏法”和“二步发酵法”生产。莱氏法首创于1933年，通过六步化学反应和一步发酵过程将d-葡萄糖转化为维生素c，但该法工艺复杂、操作难以连续化、能耗高、环保压力大，并且生产周期较长。三菌二步发酵法由我国科学家于1975年首创，是目前唯一成功应用于工业生产的微生物转化法，被我国维生素c生产商所广泛采用。由于该工艺巨大的成本优势，使我国一跃成为全球维生素c最大的供应国。目前维生素c的全球需求量超过22万吨，中国供给达到70％，是全球维生素c的重要生产基地。
4.二步发酵法的第一步发酵是由氧化葡萄糖酸杆菌将山梨醇转化为l-山梨糖，目前工业化生产中第一步发酵的转化率可达98％以上；第二步发酵是由生酮基古龙酸菌(俗称小菌)及其伴生菌(俗称大菌)组成的混菌体系将l-山梨糖转化为2-酮基-l-古龙酸(2-kga)，第二步发酵的转化率在90％以上。第二步反应中，生酮基古龙酸菌利用自身的酶系转化l-山梨糖生成2-酮基-l-古龙酸，但该菌单独培养时生长缓慢且产酸少，需要伴生菌共同培养以促进其生长和产酸，目前已开发的伴生菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、浸麻芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、条纹假单胞菌、嗜麦芽黄单胞菌和掷孢酵母等，其中巨大芽孢杆菌被广泛应用于实际生产中。
5.已有研究者对混菌发酵中的两菌关系、发酵条件控制、外源物质添加、菌株改造、优良菌株选育和基因组代谢网络模型的构建等方面进行了研究。如：中国专利文献cn 102321698a通过添加外源物质硫辛酸促进酮古龙酸菌的生长和产酸，在没有大菌伴生的情况下，提高酮古龙酸菌的生长速度和产酸能力，其中，硫辛酸是细菌生长所需b族维生素，作为辅酶或辅基的组成成分，是一种酰基载体，在α-酮酸氧化作用和脱羧作用时行使偶联酰基转移和电子转移的功能，在物质代谢中起重要作用。中国专利文献cn 104152365 a通过优良菌种选育得到一株可独立生长与产2-酮基-l-古龙酸的新菌株酮古龙酸菌spub-003。中国专利文献cn 109810975a通过基因工程技术改造酮古龙酸菌，构建了新的糖代谢途径，单菌生产2-酮基-l-古龙酸。
6.虽然二步发酵法在工业上取得了巨大的经济效益，但是依然存在二次发酵、二次灭菌、发酵总周期长、能耗高和发酵工艺复杂等问题。现有技术中对于一步发酵法也有相关报道。如：中国专利文献cn 109234350 a通过菌株改造的方式将过表达d山梨醇脱氢酶
(sldh)的地衣芽孢杆菌与产酸菌普通生酮基古龙酸菌混合培养，实现了从d山梨醇到2酮基l古龙酸的“一锅法”转化。中国专利文献cn 104404121 a直接将氧化葡萄糖酸杆菌与酮古龙酸杆菌混合，以山梨醇作为碳源，一步法发酵制备2-酮基-l-古龙酸，但是由于混菌发酵过程中两菌生长和代谢关系的复杂性，转化率和生产强度还有很大的上升空间。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明提供了一种两菌一步发酵生产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法。该方法以黑醋菌为产糖菌将d-山梨醇转化为l-山梨糖，以氧化葡萄糖酸杆菌为产酸菌将l-山梨糖转化为2-酮基-l-古龙酸，通过两菌组成的混菌发酵体系实现d-山梨醇到2-酮基-l-古龙酸的一步发酵制备。该方法相较于传统的两步发酵，简化了生产工艺，降低了生产成本，使生产过程更容易控制，并且可以降低生产的设备投入，适合2-酮基-l-古龙酸的工业化生产。
8.本发明利用黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌作为两菌一步发酵法的菌种，而提高发酵转化率和降低发酵周期的关键在于如何控制两菌的数量关系，使两菌的比例处在合适的关系。此外，还应考虑如何提高其生长速度和转化效率。
9.本发明的技术方案如下：
10.一种两菌一步发酵生产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法，是将黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌混合发酵，以d-山梨醇为底物，以黑醋菌为产糖菌将d-山梨醇转化为l-山梨糖，以氧化葡萄糖酸杆菌为产酸菌将l-山梨糖转化为2-酮基-l-古龙酸，并在发酵过程中流加硫化钠，通过两菌组成的混菌发酵体系实现d-山梨醇到2-酮基-l-古龙酸的一步发酵制备。
11.根据本发明优选的，所述黑醋菌为黑醋菌(gluconbacter melanogenus)h02，2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号cctcc no:m 2020409。
12.根据本发明优选的，所述氧化葡萄糖酸杆菌为氧化葡萄糖酸杆菌(gluconobacter oxydans)s19，2020年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号cctcc no:m 2020427。
13.根据本发明优选的，在发酵过程中恒速流加硫化钠。
14.根据本发明优选的，所述硫化钠在发酵前期流加。
15.根据本发明优选的，所述硫化钠在发酵过程的第0～18h内流加。
16.根据本发明优选的，所述硫化钠的加量为混菌发酵体系质量的0.005～0.01％。
17.根据本发明优选的，所述硫化钠的流加方式是，将硫化钠配制成0.1～1wt％的硫化钠溶液，过滤除菌后流加。
18.根据本发明优选的，是将黑醋菌种子液和氧化葡萄糖酸杆菌种子液混合，得到混菌发酵种子液，接入到发酵培养基中进行混合发酵。
19.进一步优选的，所述黑醋菌种子液的od
600
为7.5～8.0，所述氧化葡萄糖酸杆菌种子液的od
600
为1.8～2.0。
20.进一步优选的，所述混菌发酵种子液中黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌的od
600
比值为(2～32):1。
21.进一步优选的，所述混菌发酵种子液的接种量为5～25％，体积百分比。
22.进一步优选的，所述发酵培养基组分为：d-山梨醇8～10％，酵母浸粉0.2～0.5％，玉米浆干粉1.2～1.5％，尿素0.2～0.5％，磷酸二氢钾0.1～0.2％，硫酸镁0.01～0.03％，碳酸钙0.1～0.3％，均为质量百分比。
23.进一步优选的，所述混合发酵的条件为：发酵温度28～30℃、通风量3.0～3.5l/min、转速350～400rpm、发酵期间维持ph 7.2～7.3。
24.根据本发明优选的，当混菌发酵体系中d-山梨醇和l-山梨糖的含量之和≤0.5g/l时，发酵终止。
25.一株黑醋菌(gluconbacter melanogenus)h02，2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号cctcc no:m 2020409。
26.一株氧化葡萄糖酸杆菌(gluconobacter oxydans)s19，2020年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号cctcc no:m2020427。
27.在本发明一种优选的技术方案中，两菌一步发酵生产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法，具体步骤如下：
28.1、平板菌种制备
29.黑醋菌固体培养基，均为质量百分比：d-山梨醇2％，酵母浸粉0.6％，碳酸钙0.1％，琼脂粉2％；ph5.2～5.4。
30.氧化葡萄糖酸杆菌固体培养基，均为质量百分比：l-山梨糖2％(单独灭菌)，蛋白胨1％，酵母浸粉0.3％，牛肉膏0.3％，玉米浆干粉0.3％，尿素0.1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.02％，碳酸钙0.1％，琼脂粉2％；ph6.0～6.5。
31.分别取黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌甘油管菌种，用接种环在对应的固体培养基上划线，30℃倒置培养2-3d，有单菌落长出，即为平板菌种。
32.2、种子液制备：
33.黑醋菌液体培养基，均为质量百分数：d-山梨醇2％，酵母浸粉0.6％，碳酸钙0.1％；ph5.2～5.4。
34.氧化葡萄糖酸杆菌液体培养基，均为质量百分数：l-山梨糖2％(单独灭菌)，蛋白胨1％，酵母浸粉0.3％，牛肉膏0.3％，玉米浆干粉0.3％，尿素0.1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.02％，碳酸钙0.1％；ph6.0～6.5。
35.用接种环挑取黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌的平板菌种上的单菌落，接种至各自的液体培养基中，于30℃、150～200rpm摇床恒温震荡培养，黑醋菌培养至od
600
为7.5～8，氧化葡萄糖酸杆菌培养至od
600
为1.8～2，即得种子液；其中，od
600
的测定是将培养好的黑醋菌种子液和氧化葡萄糖酸杆菌种子液无菌取样，用0.5～3％的柠檬酸溶液适当稀释后于600nm处测od值；然后将黑醋菌种子液和氧化葡萄糖酸杆菌种子液混合，即为混菌发酵种子液。混菌发酵种子液中黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌的od
600
比值为(2～32):1。
36.3、发酵罐发酵
37.发酵培养基：d-山梨醇8％，酵母浸粉0.2～0.5％，玉米浆干粉1.2～1.5％，尿素0.2～0.5％，磷酸二氢钾0.1～0.2％，硫酸镁0.01～0.03％，碳酸钙0.1～0.3％。
38.将除d-山梨醇外的培养基成分在发酵罐内120℃灭菌20min，d-山梨醇配制成40％的浓度115℃灭菌30min后加入发酵罐内，将制备好的混菌发酵种子液按照5～25％的接种量接入发酵培养基中；为提高氧化葡萄糖酸杆菌的生长和产酸，在发酵过程的第0-18h内恒速流加过滤除菌的1wt％的硫化钠溶液，硫化钠的加量为发酵体系质量的0.005～0.01％；设置发酵温度30℃、通风量3.5l/min、转速400rpm、发酵期间维持ph 7.2；当发酵液中d-山梨醇和l-山梨糖的含量之和≤0.5g/l时，发酵终止。
39.本发明的有益效果为：
40.1、本发明以黑醋菌为产糖菌将d-山梨醇转化为l-山梨糖，以氧化葡萄糖酸杆菌为产酸菌将l-山梨糖转化为2-酮基-l-古龙酸，通过黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌组成的混菌发酵体系实现了从d-山梨醇到2-酮基-l-古龙酸的一步发酵工艺，并保证了较高的产量和转化率。两菌一步发酵生产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸仅需一次发酵、一次灭菌，能够简化生产工艺，缩短发酵总周期，降低能耗。
41.2、本发明通过控制两菌配比、接种量、流加硫化钠等技术手段，提高了2-酮基-l-古龙酸产量和并缩短了发酵周期，其中，产量可达到76.9g/l，转化率可达到90.2％，发酵周期为42h。硫是生物体所必须的一种大量元素，此外，发酵前期黑醋菌的氧化脱氢反应会造成发酵环境的氧化还原电位升高，进而抑制菌株的生长与代谢。硫化钠本身具有极强的还原性，可以起到降低发酵液氧化还原电位的作用，其次硫化钠在发酵体系中会缓慢地氧化成硫代硫酸钠、亚硫酸钠、硫酸钠和多硫化钠，可以作为一种缓释硫供体。
附图说明
42.图1为实施例4实验组4的发酵过程曲线图。
具体实施方式
43.下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均按照本领域常规操作进行。实施例中未作特别说明的百分数均为质量百分数。
44.实施例中涉及的微生物来源：
45.黑醋菌为黑醋菌(gluconbacter melanogenus)h02，2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号cctcc no:m 2020409。
46.氧化葡萄糖酸杆菌为氧化葡萄糖酸杆菌(gluconobacter oxydans)s19，2020年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号cctcc no:m 2020427。
47.实施例1：黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌的种子液制备
48.1、平板菌种制备
49.黑醋菌固体培养基：d-山梨醇2％，酵母浸粉0.6％，碳酸钙0.1％，琼脂粉2％；ph5.2～5.4。
50.氧化葡萄糖酸杆菌固体培养基：l-山梨糖2％(单独灭菌)，蛋白胨1％，酵母浸粉
0.3％，牛肉膏0.3％，玉米浆干粉0.3％，尿素0.1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.02％，碳酸钙0.1％，琼脂粉2％；ph6.0～6.5。
51.分别取黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌甘油管菌种，用接种环在对应的固体培养基上划线，30℃倒置培养2-3d，有单菌落长出，即为平板菌种。
52.2、种子液制备：
53.黑醋菌液体培养基：d-山梨醇2％，酵母浸粉0.6％，碳酸钙0.1％；ph5.2～5.4。
54.氧化葡萄糖酸杆菌液体培养基：l-山梨糖2％(单独灭菌)，蛋白胨1％，酵母浸粉0.3％，牛肉膏0.3％，玉米浆干粉0.3％，尿素0.1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.02％，碳酸钙0.1％；ph6.0～6.5。
55.用接种环挑取黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌的平板菌种上的单菌落，接种至各自的液体培养基中，于30℃、200rpm摇床恒温震荡培养，黑醋菌培养至od值为7.9，氧化葡萄糖酸杆菌培养至od值为1.8，即得种子液。
56.种子液od值的测定方法：将培养好的种子液无菌取样，用0.5～3％的柠檬酸溶液适当稀释后于600nm处测od值，由于在菌种的液体培养基中含有不溶性的碳酸钙，因此在测定种子液的od值时使用柠檬酸溶液稀释，稀释后种子液的od值乘以稀释倍数即为原始所得种子液的od值。
57.实施例2：黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌种子液的配比优化
58.将实施例1制备的黑醋菌种子液和氧化葡萄糖酸杆菌种子液混合，得到混菌发酵种子液，所述混菌发酵种子液中黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌的菌种od值之比分别设置为1:1、2:1、8:1、16:1、32:1、64:1，即将原始所得的黑醋菌种子液和氧化葡萄糖酸杆菌种子液分别按照体积比0.23:1、0.46:1、1.82:1、3.65:1、7.29:1、14.58:1混合。
59.1、发酵罐发酵：
60.发酵培养基：d-山梨醇8％，酵母浸粉0.3％，玉米浆干粉1.5％，尿素0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.02％，碳酸钙0.3％。
61.在5l玻璃发酵罐内将除d-山梨醇外的培养基成分在玻璃发酵罐内120℃灭菌20min，d-山梨醇配制成40wt％的浓度115℃灭菌30min后加入玻璃发酵罐内。将制备好的混菌发酵种子液按照体积百分比15％的接种量接入发酵培养基，发酵液总体积为3.5l。设置发酵温度30℃、通风量3.5l/min、转速400rpm、发酵期间维持ph 7.2。当发酵液中d-山梨醇和l-山梨糖的含量之和≤0.5g/l时，发酵终止。
62.2、2-酮基-l-古龙酸含量测定
63.样品制备：准确吸取0.1ml发酵液加入到0.9ml无菌纯化水中，混匀，12000rpm离心10min，取上清液用0.22μm滤膜过滤，即为待测样品。
64.高效液相色谱(hplc)条件：
65.色谱柱：aminex hpx-87h(300mm
×
7.8mm)，
66.流动相：5mm硫酸溶液，
67.流速：0.6ml/min，
68.柱温：65℃，
69.检测器：示差折光检测器，
70.进样量：20μl。
71.实验结果如下表所示：
72.表1：不同菌种配比下2-酮基-l-古龙酸的生产情况
73.实验组两菌的od值之比产量(g/l)摩尔转化率(％)发酵周期(h)11:160.971.47822:169.781.74838:170.382.445416:170.282.345532:170.582.645664:169.281.165
74.由表1可知，黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌混合发酵时，两菌的配比不同，2-酮基-l-古龙酸的产量也不同。当混菌发酵种子液中黑醋菌：氧化葡萄糖酸杆菌的比例过小，即氧化葡萄糖酸杆菌的接种比例过大，发酵前期会提前产2-酮基-l-古龙酸从而抑制黑醋菌的生长和d-山梨醇向l-山梨糖的转化，造成发酵周期变长、转化率降低的现象。当混菌发酵种子液中氧化葡萄糖酸菌：氧化葡萄糖酸杆菌的比例过大，即氧化葡萄糖酸杆菌接种量不足，导致发酵后期产酸变慢，发酵周期变长、转化率降低。通过表1的数据可知，本发明混菌发酵种子液中黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌的od值之比为2:1～32:1，在保证转化率的情况下，明显缩短了发酵周期。
75.实施例3：混菌发酵种子液的接种量优化
76.按照实施例1的方法制备黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌的种子液，其中黑醋菌种子液的od值为7.5，所得氧化葡萄糖酸杆菌种子液的od值为1.8，将制备的黑醋菌种子液和氧化葡萄糖酸杆菌种子液混合，得到混菌发酵种子液，所述混菌发酵种子液中黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌的菌种od值之比为：16:1。
77.1、发酵罐发酵：
78.发酵培养基：d-山梨醇8％，酵母浸粉0.3％，玉米浆干粉1.5％，尿素0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.02％，碳酸钙0.3％。
79.在5l玻璃发酵罐内将除d-山梨醇外的培养基成分在玻璃发酵罐内120℃灭菌20min，d-山梨醇配制成40wt％的浓度115℃灭菌30min后加入玻璃发酵罐内。将制备好的混菌发酵种子液按照不同体积百分比的接种量接入发酵培养基，发酵液总体积为3.5l。设置发酵温度30℃、通风量3.5l/min、转速400rpm、发酵期间维持ph 7.2。当发酵液中d-山梨醇和l-山梨糖的含量之和≤0.5g/l时，发酵终止。
80.2、2-酮基-l-古龙酸含量测定
81.按照实施例2的方法测定发酵液中2-酮基-l-古龙酸的含量，结果如下表所示：
82.表2：不同接种量下2-酮基-l-古龙酸的生产情况
83.实验组接种量产量(g/l)摩尔转化率(％)发酵周期(h)12％65.476.75425％70.585.348315％71.283.545425％71.183.445530％57.467.396
84.由表2可知，黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌混合发酵时，混菌发酵种子液的接种量不同，2-酮基-l-古龙酸的产量也不同：当接种量低于5％时，发酵前期需要一定的时间和营养用于菌种的繁殖和生长，所以发酵周期长、转化率降低；当接种量达到30％，单独灭菌的d-山梨醇液占发酵液体积的20％，氮源、无机盐等营养物质需要配制在剩余50％的体积中灭菌，灭菌时营养物质的浓度过高，会导致灭菌时营养物质的破坏，从而导致发酵产量的降低和发酵周期的延长。通过表2的数据可知，本发明混菌发酵种子液的优化接种量为5～25％，在保证转化率的情况下，明显缩短了发酵周期。
85.实施例4：硫化钠补加量及补加方式的优化
86.按照实施例1的方法制备黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌的种子液，其中黑醋菌种子液的od值为7.8，所得氧化葡萄糖酸杆菌种子液的od值为1.9，将制备的黑醋菌种子液和氧化葡萄糖酸杆菌种子液混合，得到混菌发酵种子液，所得混菌发酵种子液中黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌的菌种od值之比为16:1。
87.1、发酵罐发酵：
88.发酵培养基：d-山梨醇8％，酵母浸粉0.3％，玉米浆干粉1.5％，尿素0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.02％，碳酸钙0.3％。
89.在5l玻璃发酵罐内将除d-山梨醇外的培养基成分在玻璃发酵罐内120℃灭菌20min，d-山梨醇配制成40wt％的浓度115℃灭菌30min后加入玻璃发酵罐内。将制备好的混菌发酵种子液按照体积百分比15％的接种量接入发酵培养基，发酵液总体积为3.5l。为提高氧化葡萄糖酸杆菌的生长和产酸，在发酵过程中补加硫化钠，所述硫化钠的补加量为发酵液质量的0.001～0.02％，将所要补加的硫化钠配制成浓度为1wt％的硫化钠溶液，过滤除菌，在发酵过程的第0-18h内恒速流加，或者在发酵开始时一次性补加。设置发酵温度30℃、通风量3.5l/min、转速400rpm、发酵期间维持ph 7.2。当发酵液中d-山梨醇和l-山梨糖的含量之和≤0.5g/l时，发酵终止。
90.2、2-酮基-l-古龙酸含量测定
91.按照实施例2的方法测定发酵液中2-酮基-l-古龙酸的含量，结果如下表所示：
92.表3：不同的硫化钠补加量及补加方式下2-酮基-l-古龙酸的生产情况
93.实验组补加量补加方式产量(g/l)摩尔转化率(％)发酵周期(h)10/71.884.2％4520.001％恒速流加71.984.0％4530.001％一次性补加73.386.0％4240.005％恒速流加76.990.2％4250.005％一次性补加73.285.9％4560.01％恒速流加76.489.6％4270.01％一次性补加69.381.3％4580.02％恒速流加65.276.5％4890.02％一次性补加60.470.8％48
94.由表3可知，黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌混合发酵时，硫化钠的补加量和补加方式不同，2-酮基-l-古龙酸的产量也不同，适量的一次性补加或恒速流加硫化钠后，硫化钠可作为缓释硫源并调节发酵的氧化还原电位以促进氧化葡萄糖酸杆菌的生长和产酸，过高的
硫化钠会造成氧化还原电位过低抑制两菌的生长和发酵；采取恒速流加硫化钠的实验组在补加硫源的同时避免了一次性补加过高的硫化钠对发酵的抑制，获得了更理想的效果。由表3的数据可知，恒速流加0.005～0.01％的硫化钠，相比于一次性流加，转化率更高，发酵周期更短。其中，实验组4发酵过程中各成分的变化如图1所示。
95.对比例1：不同补加化合物的对比
96.与实施例4的不同之处在于，恒速流加的化合物不同，其他条件均与实施例4相同，具体步骤如下：
97.1、发酵罐发酵：
98.发酵培养基：d-山梨醇8％，酵母浸粉0.3％，玉米浆干粉1.5％，尿素0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.02％，碳酸钙0.3％。
99.在5l玻璃发酵罐内将除d-山梨醇外的培养基成分在玻璃发酵罐内120℃灭菌20min，d-山梨醇配制成40wt％的浓度115℃灭菌30min后加入玻璃发酵罐内。将制备好的混菌发酵种子液按照体积百分比15％的接种量接入发酵培养基，发酵液总体积为3.5l。为提高氧化葡萄糖酸杆菌的生长和产酸，在发酵过程中补加不同的化合物，补加的化合物为硫化钠、亚硫酸钠或者硫辛酸，所补加的化合物的补加量为发酵培养基质量的0.005％，将所要补加的化合物配制成浓度为1wt％的溶液，过滤除菌，在发酵过程的第0-18h内恒速流加。设置发酵温度30℃、通风量3.5l/min、转速400rpm、发酵期间维持ph 7.2。当发酵液中d-山梨醇和l-山梨糖的含量之和≤0.5g/l时，发酵终止。
100.2、2-酮基-l-古龙酸含量测定
101.按照实施例2的方法测定发酵液中2-酮基-l-古龙酸的含量，结果如下表所示：
102.表4：补加不同的化合物时2-酮基-l-古龙酸的生产情况
103.实验组补加化合物产量(g/l)摩尔转化率(％)发酵周期(h)1硫化钠76.890.1％422亚硫酸钠75.288.2％453硫辛酸75.788.8％42
104.由表4可知，黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌混合发酵时，流加的化合物不同，2-酮基-l-古龙酸的产量也不同，硫化钠、亚硫酸钠、硫辛酸都有提高两菌一步发酵转化率的作用，但硫化钠的效果优于亚硫酸钠和硫辛酸。与亚硫酸钠和硫辛酸的作用不同的是，硫化钠可以调节发酵液的氧化还原电位从而可以提高产物的发酵产量，发酵前期黑醋菌进行剧烈的氧化脱氢将d-山梨醇转化为l-山梨糖，在此阶段流加还原性较强的硫化钠可能是转化率和发酵周期优于亚硫酸钠和硫辛酸的主要原因。
105.对比例2：三菌二步发酵法
106.1、第一步发酵
107.黑醋菌液体培养基：d-山梨醇2％，酵母浸粉0.6％，碳酸钙0.1％；ph5.2～5.4。
108.用接种环挑取黑醋菌单菌落，接种至液体培养基中，于30℃、200rpm摇床恒温震荡培养36h，得黑醋菌种子液。
109.第一步发酵培养基：d-山梨醇20％(单独灭菌)、酵母浸粉0.3％、碳酸钙1％。
110.在5l玻璃发酵罐内将除d-山梨醇外的培养基成分在玻璃发酵罐内120℃灭菌20min，d-山梨醇配制成40wt％的浓度115℃灭菌30min后加入玻璃发酵罐内。将制备好的黑
醋菌种子液按照体积百分比15％的接种量接入发酵培养基，发酵液总体积为3.5l。设置发酵温度30℃、通风量3.5l/min、转速400rpm、发酵期间维持ph 6.0。
111.发酵结果：发酵周期18h、发酵产量为78.6g/l，转化率98.3％。
112.待发酵结束后，将发酵液升温至80℃维持30min，即得一步发酵液。
113.2、第二步发酵
114.菌种液体培养基：l-山梨糖2％(单独灭菌)，蛋白胨1％，酵母浸粉0.3％，牛肉膏0.3％，玉米浆干粉0.3％，尿素0.1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.02％，碳酸钙0.1％；ph6.0～6.5。
115.用接种环分别挑取一环氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌的单菌落，同时接种至上述菌种液体培养基内，于30℃、200rpm摇床恒温震荡培养24h，即得混菌种子液。
116.发酵培养基：一步发酵液40％(低温单独灭菌)，酵母浸粉0.3％，玉米浆干粉1.5％，尿素0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.02％，碳酸钙0.3％。
117.在5l玻璃发酵罐内将除一步发酵液外的培养基成分在玻璃发酵罐内120℃灭菌20min，并按照40％的比例加入低温灭菌(70℃，2h)的一步发酵液和15％的比例接入氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌的混菌种子液，发酵液的总体积为3.5l。设置发酵温度30℃、通风量3.5l/min、转速400rpm、发酵期间维持ph 7.2。
118.发酵结果：发酵周期30h，发酵产量76.5g/l，第二步发酵转化率91.3％
119.实验结果：第一步发酵18h，第二步发酵30h，总发酵周期为48h；产量76.5g/l，摩尔转化率89.7％。与实施例4的实验组结果相比，本发明成功的实现了一步发酵生产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸，在产量及转化率相近的情况下，本发明的发酵周期较传统三菌二步发酵的总发酵周期短，而且简化了生产工艺，相较于传统三菌二步发酵法的二次灭菌、二次发酵减少了一次灭菌和一次发酵的能耗，且比传统三菌二步发酵法在车间建设阶段减少了第一步发酵所需的发酵罐的设备投入，具有巨大的成本优势。
120.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一种两菌一步发酵生产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法，其特征在于，是将黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌混合发酵，以d-山梨醇为底物，以黑醋菌为产糖菌将d-山梨醇转化为l-山梨糖，以氧化葡萄糖酸杆菌为产酸菌将l-山梨糖转化为2-酮基-l-古龙酸，并在发酵过程中流加硫化钠，通过两菌组成的混菌发酵体系实现d-山梨醇到2-酮基-l-古龙酸的一步发酵制备。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黑醋菌为黑醋菌(gluconbacter melanogenus)h02，2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号cctcc no:m 2020409。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌为氧化葡萄糖酸杆菌(gluconobacter oxydans)s19，2020年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号cctcc no:m 2020427。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵过程中恒速流加硫化钠；优选的，所述硫化钠在发酵前期流加；优选的，所述硫化钠在发酵过程的第0～18h内流加；优选的，所述硫化钠的加量为混菌发酵体系质量的0.005～0.01％；优选的，所述硫化钠的流加方式是，将硫化钠配制成0.1～1wt％的硫化钠溶液，过滤除菌后流加。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，是将黑醋菌种子液和氧化葡萄糖酸杆菌种子液混合，得到混菌发酵种子液，接入到发酵培养基中进行混合发酵；进一步优选的，所述黑醋菌种子液的od
600
为7.5～8.0，所述氧化葡萄糖酸杆菌种子液的od
600
为1.8～2.0；进一步优选的，所述混菌发酵种子液中黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌的od
600
比值为(2～32):1。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述混菌发酵种子液的接种量为5～25％，体积百分比；优选的，所述发酵培养基组分为：d-山梨醇8～10％，酵母浸粉0.2～0.5％，玉米浆干粉1.2～1.5％，尿素0.2～0.5％，磷酸二氢钾0.1～0.2％，硫酸镁0.01～0.03％，碳酸钙0.1～0.3％，均为质量百分比。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合发酵的条件为：发酵温度28～30℃、通风量3.0～3.5l/min、转速350～400rpm、发酵期间维持ph 7.2～7.3。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当混菌发酵体系中d-山梨醇和l-山梨糖的含量之和≤0.5g/l时，发酵终止。9.一株黑醋菌(gluconbacter melanogenus)h02，2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号cctcc no:m 2020409。10.一株氧化葡萄糖酸杆菌(gluconobacter oxydans)s19，2020年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号cctcc no:m2020427。

技术总结
本发明主要涉及一种两菌一步发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明主要是将黑醋菌和氧化葡萄糖酸杆菌混合发酵，以D-山梨醇为底物，以黑醋菌为产糖菌将D-山梨醇转化为L-山梨糖，以氧化葡萄糖酸杆菌为产酸菌将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸，并在发酵过程中流加硫化钠，通过两菌组成的混菌发酵体系实现D-山梨醇到2-酮基-L-古龙酸的一步发酵制备。两菌一步发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸仅需一次发酵、一次灭菌，能够简化生产工艺，缩短发酵总周期，降低能耗。降低能耗。降低能耗。


技术研发人员：王腾飞 陈文虎 冯帅 袁海波 刘洪玲 黄迪 蒋艺
受保护的技术使用者：齐鲁工业大学（山东省科学院）
技术研发日：2023.05.05
技术公布日：2023/9/5