一种7α-HSDH酶突变体和7β-HSDH酶突变体及其编码基因和应用

一种7
α-hsdh酶突变体和7
β-hsdh酶突变体及其编码基因和应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体是一种7α-hsdh酶突变体和7β-hsdh酶突变体及其编码基因和应用。


背景技术：

2.熊去氧胆酸(udca)的化学名称为3α,7β-二羟基-5β-胆酸，其具有极强的促进脂肪和脂肪酸水解等作用，因此，几个世纪以来，udca一直被应用于治疗肝胆疾病，尤其在针对治疗胆固醇型胆结石有着其独特的功效。至今为止，udca是唯一由美国fda批准的可用于治疗原发性胆汁性肝硬化的药物，如今，临床上对udca的需求日渐加大。
3.目前，udca可以通过化学合成或生物合成获得，其中化学合成比如以雄甾烯二酮为原料的合成方法或全合成的方法，路径繁琐，需经多步羟基保护和去保护的步骤，成本较高且总收率低，并且所用化学试剂(如吡啶、cro3和肼)会污染环境，不适合于工业化生产；生物合成方法中的酶法催化绿色环保，顺应当今社会绿色发展和环保趋势，具有巨大应用潜力。
4.传统酶法合成udca需要两步催化，第一步催化是利用7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-hsdh)将原料鹅去氧胆酸(cdca)氧化为7-酮石胆酸(7-klca)，第二步催化是利用7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-hsdh)将第一步反应获得的7-klca还原为udca，其中需要将中间产物7-klca提纯，催化工艺较繁琐。此外，目前用于udca合成的7α-hsdh和7β-hsdh分别需要辅酶nad
+
和nadph的参与，因此催化反应还需要分别加入乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶等辅助酶和辅料进行辅酶nad
+
和nadph的再生，从而导致催化体系复杂，生产成本较高。
5.专利公开号为“cn105861613a”的中国发明专利公开了一种一步法制备熊去氧胆酸的方法，该合成路线较为简单，但其在合成工艺中使用的7-αhsdh和7-βhsdh均为冻干粉，酶蛋白分离纯化成本过高从而造成催化成本过高，且该专利中所提供的制备方法转化率较低，实施例中所记载的转化率最高仅为81％。
6.综上所述，由于现有的7α-hsdh和7β-hsdh在参与熊去氧胆酸合成工艺中的转化率较低，因此，为了寻求更高的转化率，本发明拟在现有的7α-hsdh和7β-hsdh氨基酸序列基础上进行人工突变，以筛选出具有高转化率的7α-hsdh和7β-hsdh参与熊去氧胆酸的合成反应。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明提供了一种7α-hsdh酶突变体和7β-hsdh酶突变体及其编码基因和应用，通过人工突变筛选出具有特定氨基酸序列的7α-hsdh酶突变体和7β-hsdh酶突变体，并在7β-hsdh酶突变体末端添加融合标签，一锅法催化cdca制备udca，实现辅酶的原位循环再生，减少催化步骤，提高催化稳定性和催化效率，显著节约生产成本。
8.本发明技术方案如下：
9.一种7α-hsdh酶突变体，为nadp-1a、nadp-2a、nadp-3a、nadp-4a和nadp-5a中的任一种，所述nadp-1a的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述nadp-2a的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述nadp-3a的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述nadp-4a的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述nadp-5a的氨基酸序列如seq id no.5所示。
10.其中，所述nadp-1a由氨基酸序列如seq id no.12所示的野生型7α-hsdh(nadp-1a)突变得到，在seq id no.12所示的氨基酸序列的第44～47位、第103～104位、第123～126位、第190～191位联合突变(a44g，r45v，a46i，d47a，n103a，t104g，a123p，s124a，q125k，t126a，t190i，a191g)；
11.其中，所述nadp-2a由氨基酸序列如seq id no.13所示的野生型7α-hsdh(nadp-2a)突变得到，在seq id no.13所示的氨基酸序列的第46～48位、第86位、第118～119位、第141位、第155位、第191～192位、第225位、第250位联合突变(v46r，i47a，a48d，i86v，v118l，q119k，v141i，r155q，i191t，g192a，n225a，a250g)；
12.其中，所述nadp-3a和nadp-4a由dna改组技术获得，将7α-hsdh相关基因家族的靶序列随机片段化，通过无引物pcr和有引物pcr组装成全长的嵌合体基因并对嵌合体基因进行高通量的筛选，选择具有改进功能或全新功能的突变体作为下轮dna改组的模板，重复上述步骤，进行多轮改组和高通量的筛选最终获得nadp-3a和nadp-4a。
13.其中，所述nadp-5a由氨基酸序列如seq id no.14所示的野生型7α-hsdh(nadp-5a)突变得到，在seq id no.14所示的氨基酸序列的第24位、第104～105位、第111～112位、第135位联合突变(e24g，a104n，g105t，f111i，r112a，v135n)；
14.一种7β-hsdh酶突变体，为nadp-1b、nadp-2b、nadp-3b中的任一种，所述nadp-1b的氨基酸序列为seq id no.6所示，所述nadp-2b的氨基酸序列为seq id no.7所示，所述nadp-3b的氨基酸序列为seq id no.8所示。
15.其中，所述nadp-1b由氨基酸序列如seq id no.15所示的野生型7β-hsdh(nadp-1b)突变得到，在seq id no.15所示的氨基酸序列的第26～27位、第132～133位、第207位联合突变(f26e，e27k，e132k，r133q，a207t)；
16.其中，所述nadp-2b由氨基酸序列如seq id no.16所示的野生型7β-hsdh(nadp-2b)突变得到，在seq id no.16所示的氨基酸序列的第42位、第87～88位、第176位、第232位联合突变(e42k，f87v，m88i，s176n，i232l)；
17.其中，所述nadp-3b由氨基酸序列如seq id no.17所示的野生型7β-hsdh(nadp-3b)突变得到，在seq id no.17所示的氨基酸序列的第42位、第87～88位、第176位、第232位联合突变(e42k，f87v，m88i，s176n，i232l)；
18.其中，所述7α-hsdh酶突变体为nadp
+
依赖型；所述7β-hsdh酶突变体为nadph依赖型。
19.一种利用上述7α-hsdh酶突变体和7β-hsdh酶突变体制备熊去氧胆酸的方法，包括如下步骤：
20.s1，将鹅去氧胆酸加入到磷酸盐缓冲液中，调节ph直至鹅去氧胆酸全部溶解；
21.s2，继续加入辅酶nadp
+
、7α-hsdh酶突变体和7β-hsdh酶突变体，进行催化反应，最终得到成品熊去氧胆酸。
22.其中，所述7α-hsdh酶突变体和7β-hsdh酶突变体可以为粗酶液，相较于纯酶能够
大大降低催化成本。
23.其中，s2中所述7α-hsdh酶突变体为nadp
+
依赖型，所述7β-hsdh酶突变体为nadph依赖型。
24.优选的，在7β-hsdh酶突变体的“n端”或“c端”添加有融合标签，成为7β-hsdh融合蛋白；通过在7β-hsdh酶突变体的末端添加融合标签，大大提高了催化稳定性及催化效率。
25.优选的，所述融合标签为sumo、gst或mbp中的任一种；所述sumo的氨基酸序列为seq id no.9所示，所述gst的氨基酸序列为seq id no.10所示，所述mbp的氨基酸序列为seq id no.11所示。
26.优选的，所述鹅去氧胆酸、nadp
+
、7α-hsdh酶突变体和7β-hsdh酶突变体/7β-hsdh融合蛋白之间的质量比例为1:0.0002～0.003:0.1～0.5:0.2～1.0。
27.优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为10～100mm，ph为6.5～8.5。
28.优选的，所述s2中催化反应的温度为25～40℃，反应ph为7.0～8.5，反应时间为1～15h。
29.上述制备熊去氧胆酸方法的催化反应如下：
[0030][0031]
本发明选用nadp
+
依赖型的7α-hsdh酶突变体和nadph依赖型的7β-hsdh酶突变体共同催化cdca生产udca。其中，7α-hsdh酶突变体催化cdca生成7-酮石胆酸(7-klca)，同时将nadp
+
转化为nadph，7β-hsdh酶突变体催化7-klca生成udca，同时将nadph转化为nadp
+
，此方法可以实现辅酶nadp
+
/nadph的自循环再生，无需再添加用于辅酶再生的辅助酶及辅助原料。
[0032]
本发明的有益效果：
[0033]
1)本发明筛选出具有特定氨基酸序列的7α-hsdh酶突变体和7β-hsdh酶突变体，并在7β-hsdh酶突变体的末端添加融合标签sumo、gst或mbp，大大提高了催化效率和催化稳定性；
[0034]
2)本发明选用nadp
+
依赖型的7α-hsdh酶突变体和nadph依赖型的7β-hsdh酶突变体共同催化cdca生产udca，可以实现辅酶nadp
+
/nadph的自循环再生，无需添加用于辅酶再生的辅助酶及辅助原料，且采用的是粗酶液参与催化反应，极大节约了生产成本；
[0035]
3)本发明采用一锅法催化cdca制备udca，与传统两步催化法相比，减少了中间产物的粗提步骤，工艺简单且节约生产成本，适合工业化大规模应用。
附图说明
[0036]
图1为本发明实施例1中的hplc检测图谱。
具体实施方式
[0037]
下面结合具体实施例进行说明：
[0038]
在7α-hsdh酶突变体和7β-hsdh酶突变体的筛选过程中，通过酶活力检测发现某些位点联合突变后的活性相较于野生型酶得到了显著提高，从而我们根据酶活力的检测结果确定联合突变的位点并成功筛选出7α-hsdh酶突变体nadp-1a、nadp-2a、nadp-3a、nadp-4a、nadp-5a和7β-hsdh酶突变体nadp-1b、nadp-2b、nadp-3b。
[0039]
最终筛选获得的酶突变体具体突变位点及其与野生型酶活力检测对比结果如表1所示，其中7α-hsdh酶活力的定义为：每分钟生成1μmol nadph所需的酶量；7β-hsdh酶活力的定义为：每分钟消耗1μmol nadph所需的酶量。
[0040]
表1.酶突变体与野生型的酶活力对比
[0041][0042]
实施例1：
[0043]
本实施例选用7α-hsdh(nadp-5a)和“c”端含gst标签的7β-hsdh融合蛋白(gst-nadp-1b)共同催化生产udca。
[0044]
一、粗酶液的制备：
[0045]
将含有7α-hsdh或7β-hsdh融合蛋白编码基因的重组大肠杆菌在lb培养基(酵母抽提物5g/l、胰蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l)平板中划线活化，37℃过夜培养后挑取单菌落接种至液体lb培养基中，37℃、220rpm摇床培养12h后，按1％(v/v)接种量接种至tb培养基(酵母抽提物24g/l、胰蛋白胨12g/l、甘油4ml/l、磷酸二氢钾2.2g/l、磷酸氢二钾9.4g/l)中37
℃继续培养，当细胞生长至od
600
＝0.6时，加入终浓度为0.2mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导酶的表达，然后20℃继续摇床培养12h。培养结束后，离心(8000rpm、5min)收集菌体，采用50mm磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次后，使用1/15发酵液体积的100mm磷酸盐缓冲液将细胞重悬，采用高压均质机进行细胞破碎，然后将细胞破碎液进行离心(12000rpm，5min)，所得上清液即为粗酶液。
[0046]
二、辅酶自循环催化制备udca：
[0047]
称取25.0g cdca加入到20ml浓度为50mm的磷酸盐缓冲液(ph 8.5)中，用4mnaoh溶液调节ph至cdca全部溶解；然后加入45.0mg nadp
+
、6.0g 7α-hsdh粗酶(nadp-5a)和14.6g 7β-hsdh融合蛋白粗酶(gst-nadp-1b)，维持反应液ph 8.5、温度35℃；定时取样后采用液相色谱检测底物及产物含量，色谱条件为：岛津lc-20a色谱仪，phenomenx gemini nx-c18色谱柱(5μm，250
×
4.6mm)，rid检测器，流动相为乙腈：磷酸二氢钠缓冲液(6.5mm，ph 3.0)：甲醇＝30:37:40，流速0.8ml/min，柱温40℃。所有反应液样品先用甲醇溶解，然后采用流动相进行稀释，用0.45μm滤膜过滤后进行hplc检测。催化反应8h后，udca转化率为98％，在此转化率下的hplc图谱如图1所示。
[0048]
实施例2：
[0049]
本实施例选用7α-hsdh(nadp-2a)和“n”端含sumo标签的7β-hsdh融合蛋白(sumo-nadp-3b)共同催化生产udca。
[0050]
其中，粗酶液的制备方法同实施例1；
[0051]
称取18.4g cdca加入15ml 50mm磷酸盐缓冲液(ph 8.0)中，用4m naoh溶液调节ph至cdca全部溶解；然后加入14.2mg nadp
+
、3.7g 7α-hsdh粗酶(nadp-2a)和5.5g 7β-hsdh融合蛋白粗酶(sumo-nadp-3b)，维持反应液ph 8.0、温度37℃，定时取样后采用液相色谱检测底物及产物含量，色谱条件同实施例1。催化反应4h后，udca转化率为92％。
[0052]
实施例3：
[0053]
本实施例选用7α-hsdh(nadp-1a)和“n”端含mbp标签的7β-hsdh融合蛋白(mbp-nadp-3b)共同催化生产udca。
[0054]
其中，粗酶液的制备方法同实施例1；
[0055]
称取12.0g cdca加入15ml 50mm磷酸盐缓冲液(ph 7.5)中，用4m naoh溶液调节ph至cdca全部溶解；然后加入12.0mg nadp
+
、1.8g 7α-hsdh粗酶(nadp-1a)和3.6g 7β-hsdh融合蛋白粗酶(mbp-nadp-3b)，维持反应液ph 8.0、温度35℃，定时取样后采用液相色谱检测底物及产物含量，色谱条件同实施例1。催化反应3h后，udca转化率为93％。
[0056]
实施例4：
[0057]
本实施例选用7α-hsdh(nadp-3a)和“c”端含gst标签的7β-hsdh融合蛋白(gst-nadp-2b)共同催化生产udca。
[0058]
其中，粗酶液的制备方法同实施例1；
[0059]
称取15.0g cdca加入20ml 50mm磷酸盐缓冲液(ph 6.5)中，用4m naoh溶液调节ph至cdca全部溶解；然后加入20.0mg nadp
+
、5.3g 7α-hsdh粗酶(nadp-3a)和6.8g 7β-hsdh融合蛋白粗酶(gst-nadp-2b)，维持反应液ph 8.0、温度30℃，定时取样后采用液相色谱检测底物及产物含量，色谱条件同实施例1。催化反应6h后，udca转化率为88％。
[0060]
实施例5：
[0061]
本实施例选用7α-hsdh(nadp-4a)和“n”端含gst标签的7β-hsdh融合蛋白(gst-nadp-2b)共同催化生产udca。
[0062]
其中，粗酶液的制备方法同实施例1；
[0063]
称取18.0g cdca加入25ml 50mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)中，用4m naoh溶液调节ph至cdca全部溶解；然后加入10.0mg nadp
+
、3.5g 7α-hsdh粗酶(nadp-4a)和4.6g 7β-hsdh融合蛋白粗酶(gst-nadp-2b)，维持反应液ph 8.0、温度35℃，定时取样后采用液相色谱检测底物及产物含量，色谱条件同实施例1。催化反应4h后，udca转化率为94％。
[0064]
实施例6：
[0065]
与实施例1不同的是，本实施例选用的是不含融合标签的7β-hsdh(nadp-1b)；
[0066]
其中，粗酶液的制备方法以及udca的制备方法同实施例1，催化反应8h后，udca转化率为87％。
[0067]
实施例7：
[0068]
与实施例2不同的是，本实施例选用的是不含融合标签的7β-hsdh(nadp-3b)；
[0069]
其中，粗酶液的制备方法以及udca的制备方法同实施例2，催化反应4h后，udca转化率为81％。
[0070]
实施例8：
[0071]
与实施例3不同的是，本实施例选用的是不含融合标签的7β-hsdh(nadp-3b)；
[0072]
其中，粗酶液的制备方法以及udca的制备方法同实施例3，催化反应3h后，udca转化率为84％。
[0073]
上述实施例1～8中制备udca的转化率如下表2所示：
[0074]
表2.实施例1～8的udca转化率
[0075][0076]
由表2可以看出，在不添加融合蛋白的情况下，udca转化率明显降低。本发明通过在7β-hsdh的末端添加融合标签sumo、gst或mbp，大大提高了udca的催化效率和催化稳定性。
[0077]
对比例1：
[0078]
与实施例6不同的是，本对比例中选用突变前的野生型7α-hsdh(nadp-5a)和突变前的不含融合标签的野生型7β-hsdh(nadp-1b)共同催化生产udca；
[0079]
其中，粗酶液的制备方法以及udca的制备方法同实施例6，催化反应8h后，udca转化率为84％。
[0080]
对比例2：
[0081]
与实施例7不同的是，本对比例中选用突变前的野生型7α-hsdh(nadp-2a)和突变前的不含融合标签的野生型7β-hsdh(nadp-3b)共同催化生产udca；
[0082]
其中，粗酶液的制备方法以及udca的制备方法同实施例7，催化反应4h后，udca转化率为76％。
[0083]
对比例3：
[0084]
与实施例8不同的是，本对比例中选用突变前的野生型7α-hsdh(nadp-1a)和不含融合标签的野生型7β-hsdh(nadp-3b)共同催化生产udca；
[0085]
其中，粗酶液的制备方法以及udca的制备方法同实施例8，催化反应3h后，udca转化率为82％。
[0086]
上述对比例1～3中制备udca的转化率如下表3所示：
[0087]
表3.对比例1～3的udca转化率
[0088][0089]
由表3可以看出，在选用野生型7α-hsdh和野生型7β-hsdh的情况下，udca转化率相对于实施例6～8更低。
[0090]
综上，本发明通过对现有的7α-hsdh和7β-hsdh氨基酸序列进行人工突变，筛选出具有特定氨基酸序列的7α-hsdh酶突变体和7β-hsdh酶突变体，并在7β-hsdh酶突变体的末端添加融合标签sumo、gst或mbp，显著提高了udca的催化效率和催化稳定性。

技术特征：
1.一种7α-hsdh酶突变体，其特征在于，所述7α-hsdh酶突变体为nadp-1a、nadp-2a、nadp-3a、nadp-4a和nadp-5a中的任一种，所述nadp-1a的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述nadp-2a的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述nadp-3a的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述nadp-4a的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述nadp-5a的氨基酸序列如seq id no.5所示。2.一种7β-hsdh酶突变体，其特征在于，所述7β-hsdh酶突变体为nadp-1b、nadp-2b、nadp-3b中的任一种，所述nadp-1b的氨基酸序列为seq id no.6所示，所述nadp-2b的氨基酸序列为seq id no.7所示，所述nadp-3b的氨基酸序列为seq id no.8所示。3.如权利要求1所述的7α-hsdh酶突变体，其特征在于，所述7α-hsdh酶突变体为nadp
+
依赖型。4.如权利要求2所述的7β-hsdh酶突变体，其特征在于，所述7β-hsdh酶突变体为nadph依赖型。5.权利要求1所述7α-hsdh酶突变体在制备熊去氧胆酸中的应用。6.权利要求2所述7β-hsdh酶突变体在制备熊去氧胆酸中的应用。7.一种利用权利要求1所述7α-hsdh酶突变体和权利要求2所述7β-hsdh酶突变体制备熊去氧胆酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1，将鹅去氧胆酸加入到磷酸盐缓冲液中，调节ph直至鹅去氧胆酸全部溶解；s2，继续加入辅酶nadp
+
、7α-hsdh酶突变体和7β-hsdh酶突变体，进行催化反应，得到成品熊去氧胆酸。8.如权利要求7所述的一种方法，其特征在于，所述7β-hsdh酶突变体的“n端”或“c端”添加有融合标签，成为7β-hsdh融合蛋白。9.如权利要求8所述的一种方法，其特征在于，所述融合标签为sumo、gst或mbp中的任一种；所述sumo的氨基酸序列为seq id no.9所示，所述gst的氨基酸序列为seq id no.10所示，所述mbp的氨基酸序列为seq id no.11所示。10.如权利要求8所述的一种方法，其特征在于，所述鹅去氧胆酸、nadp
+
、7α-hsdh酶突变体和7β-hsdh酶突变体/7β-hsdh融合蛋白之间的质量比例为1:0.0002～0.003:0.1～0.5:0.2～1.0；优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为10～100mm，ph为6.5～8.5；优选的，所述催化反应的温度为25～40℃，反应ph为7.0～8.5，反应时间为1～15h。

技术总结
本发明提供了一种7α-HSDH酶突变体和7β-HSDH酶突变体及其编码基因和应用，通过人工突变筛选出具有特定氨基酸序列的7α-HSDH酶突变体和7β-HSDH酶突变体，相比于野生型7α-HSDH和野生型7β-HSDH提高了酶活性和催化效率；本发明同时提供了一种利用上述7α-HSDH酶突变体和7β-HSDH酶突变体制备熊去氧胆酸的方法，即采用NADP


技术研发人员：赵立秀 张玉婷 高浩飞 袁海波 王腾飞 刘萌 刘洪玲 黄迪 蒋艺
受保护的技术使用者：齐鲁工业大学（山东省科学院）
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/9/5