具备调节细胞周期及细胞免疫功能的工作液及使用方法

1.本发明属于化合物新用途技术领域，涉及一种具备调节细胞周期及细胞免疫功能的工作液及使用方法。


背景技术：

2.丁酸作为一种短链脂肪酸，除了能够提供能量给肠道细胞，还能促进肠道细胞的分化、增殖和成熟外，增强肠道免疫，具有广泛的药理作用，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤活性和代谢调节等。研究报道丁酸对小鼠肠道诱导炎症反应有抑制作用，丁酸可激活结肠内免疫细胞如巨噬细胞，促进t淋巴细胞的分化，最终抑制结肠炎症。丁酸还可以通过抑制内质网应激的perk-chop通路来保护消化腺细胞免于凋亡。
3.棕榈酸作为一种长链饱和脂肪酸，常被作为饲料添加剂，可直通过促进促炎细胞因子il-6和tnf-α产生等多种途径或者直接刺激宿主产生免疫应答，尤其是产生iga抗体，形成肠道黏膜免疫，从而保障肠道免疫屏障功能。
4.现有技术中对丁酸和棕榈酸的应用研究，均只局限于两种脂肪酸分别对宿主本体相关细胞的刺激或促进作用以提升宿主本体细胞或机体的免疫能力。关于丁酸、棕榈酸两种脂肪酸组合使用的方法及相应效果研究，目前还未见报道。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供丁酸、棕榈酸两种脂肪酸组合使用的新用途，具体是提供一种具备调节细胞周期及细胞免疫功能的工作液及使用方法。
6.为解决技术问题，本发明的技术方案是：
7.提供一种具备调节细胞周期及细胞免疫功能的工作液，该工作液的有效成分是丁酸和棕榈酸，余量为用作溶剂的dmso和ddh2o，以及用于提供细胞营养和促进细胞生长增殖的细胞培养基；其中，丁酸与细胞培养基的质量比为0.013︰100，棕榈酸与细胞培养基的质量比为0.00064︰100。
8.本发明中，所述丁酸的cas号为107-92-6，分子式为c4h8o2，分子量为88.11；所述棕榈酸cas号为57-10-3，分子式为c
16h32
o2，分子量为256.424。
9.作为本发明的优选方案，所述细胞培养基是dmem培养基、1640培养基、f12培养基或mem培养基中的任意一种；这些均为成熟的商业化产品，可通过市购获得。
10.细胞培养基的有效成分，包括氨基酸、糖、矿物质、维生素、氧化剂和抗生素。作为示例，氨基酸包括：甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、谷氨酸等。糖类包括：葡萄糖、半乳糖、胞糖、聚乳酸和多聚葡萄糖等。矿物质的主要成分有钙、磷、镁、钠、钾等。维生素有维生素b12、烟酰胺、乙酰胆碱、肌醇、叶酸、维生素e和维生素c等。氧化剂包括：蛋白酶去除剂、谷胱甘肽、过氧化氢和吲哚三醇等。抗生素包括：链霉素、链霉素、两性霉素b等。
11.本发明还提供了前述工作液的制备方法，包括以下步骤：
12.(1)按25.65mg︰10ml的比例，将棕榈酸溶于dmso中，得到浓度为10mm的棕榈酸母液；按0.881g︰10ml的比例，将丁酸溶于ddh2o中，得到浓度为1m的丁酸母液；
13.(2)按母液︰细胞培养基的比例为2.5μl/ml和1.5μl/ml，分别取棕榈酸母液和丁酸母液；然后依次加入细胞培养基中混匀，配成工作液；工作液中丁酸和棕榈酸的百分比含量为分别为0.013％和0.00064％。
14.本发明进一步提供了前述工作液的使用方法，是将该工作液用于细胞培养。在使用时，丁酸与棕榈酸工作浓度分别为1.5mm和25μm，即每100g(ml)细胞培养基中有0.013g丁酸和0.00064g棕榈酸。
15.作为本发明的优选方案，按下述任意一种方法使用工作液：
16.(1)预处理：对于进行中的细胞培养试验，弃去孔板中原有细胞培养基；加入2ml工作液对细胞进行预处理，然后弃去工作液用hank’s液洗两遍，再根据实验方案对细胞进行后续操作；
17.(2)同时处理：对于进行中的细胞培养试验，弃去孔板中原有细胞培养基，用hank’s液洗两遍；在根据实验方案对细胞进行后续操作的同时，使用2ml工作液进行细胞培养；
18.(3)后处理：根据实验方案对细胞进行操作后，用hank’s液洗两遍，加入2ml工作液进行细胞培养。
19.发明原理描述：
20.本发明提供的组合试剂能调节细胞周期及细胞免疫功能，丁酸可以通过影响关键干扰素刺激因子isg15上调，直接增强细胞先天免疫功能，棕榈酸可以通过调节cyclina2等蛋白缓解细胞周期阻滞，促进细胞生长和复制。
21.据文献报道，丁酸可通过诱导未成熟的dc细胞、促进t淋巴细胞的分化等，使其发挥特有的细胞免疫功能，棕榈酸则可通过提升免疫细胞的白介素等炎性反应及特异性抗体表达水平，使其特异性免疫功能增强，从而提高抵抗病菌入侵能力。
22.本发明以上皮细胞等无特化免疫功能且炎性反应较弱的细胞作为研究对象，经过深入研究发现，丁酸可通过干扰素刺激因子isg15等激活上皮细胞干扰素相关通路，直接增强细胞的先天免疫功能，提升上皮细胞免疫屏障作用。在有棕榈酸同时使用时，干扰素通路的先天免疫分子isg15的转录及表达水平显著高于没有棕榈酸时，这表明棕榈酸对丁酸产生的直接增强细胞的先天免疫功能具有协同促进作用。棕榈酸可通过调节cyclina2等蛋白缓解因丁酸引起的细胞周期阻滞，促进细胞生长和复制。同时，在有丁酸共同使用时，cyclina2的表达水平较棕榈酸单独使用时上调更为显著，提示丁酸对棕榈酸产生的调节细胞周期阻滞、促进细胞生长复制的作用具有协同促进作用。
23.结合现有结果及文献报道，丁酸抑制炎症、抑制细胞凋亡的作用，可减轻棕榈酸引起的炎性反应及细胞损伤，从而调节细胞状态；棕榈酸可调节细胞周期，促进细胞生长，从而提升细胞数量。而本发明将丁酸与棕榈酸以特定比例组合使用，能使细胞处于良好的生长状态，两者相互协同可达到最优的调节细胞周期及细胞免疫功能效果。
24.与现有技术相比，本发明的技术效果是：
25.1、本发明所述试剂用于增强细胞免疫、缓解细胞周期阻滞效果非常显著。实验证明在ipec-j2细胞上可显著提高的细胞先天免疫标志分子isg15及细胞周期标志分子
cyclina2的表达水平，所述试剂应用于细胞感染病毒试验时呈现出抗病毒活性，可以缓解病毒感染导致的细胞周期阻滞现象，显著降低细胞内病毒拷贝数，抑制病毒蛋白表达。
26.2、不同于目前用于细胞免疫功能及细胞周期调节的激素、抗生素、人工合成化学物等类型的药物，所述试剂成分丁酸及棕榈酸均为脂肪酸，是机体细胞代谢产物组分之一，对机体细胞无明显毒副作用，作为调节细胞周期、增强细胞免疫的试剂在使用时更安全、便捷、副作用少。
附图说明
27.图1为本发明所述试剂中成分丁酸及棕榈酸的结构式。
28.图2为所述试剂成分对细胞毒性的试验结果。0～3mm丁酸对细胞存活无影响，0～50μm棕榈酸对细胞存活无影响。
29.图3为所述试剂成分按不同比例组合使用对细胞免疫功能及细胞周期的影响。1为不处理对照(丁酸和棕榈酸质量比为0％：0％)，2为棕榈酸处理(丁酸和棕榈酸质量比为0％：0.00128％，棕榈酸工作浓度为50μm)，3为丁酸和棕榈酸组合使用处理(丁酸和棕榈酸质量比为0.0065％：0.00096％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为0.75mm和37.5μm)，4为丁酸和棕榈酸组合使用处理(丁酸和棕榈酸质量比为0.013％︰0.00064％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为1.5mm和25μm)，5为丁酸和棕榈酸组合使用处理(丁酸和棕榈酸质量比为0.195％：0.00032％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为2.25mm和12.5μm)，6为丁酸处理(丁酸和棕榈酸质量比为0.026％：0％，丁酸工作浓度为3mm)。对每组细胞检测细胞先天免疫isg15分子及细胞周期相关因子cyclina2表达水平。丁酸与棕榈酸组合使用时，isg15的转录水平、isg15及cyclina2表达水平均有显著上升，丁酸与棕榈酸组合使用的质量比为0.013％︰0.00064％组合使用时，isg15及cyclina2表达水平最高，对细胞免疫功能及细胞周期的调节效果最佳。
30.图4为所述试剂不同比例组合使用在细胞病毒感染试验中的应用。1为不处理对照(丁酸和棕榈酸质量比为0％：0％)，2为棕榈酸处理(丁酸和棕榈酸质量比为0％：0.00128％，棕榈酸工作浓度为50μm)，3为丁酸和棕榈酸组合使用处理(丁酸和棕榈酸质量比为0.0065％：0.00096％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为0.75mm和37.5μm)，4为丁酸和棕榈酸组合使用处理(丁酸和棕榈酸质量比为0.013％︰0.00064％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为1.5mm和25μm)，5为丁酸和棕榈酸组合使用处理(丁酸和棕榈酸质量比为0.195％：0.00032％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为2.25mm和12.5μm)，6为丁酸处理(丁酸和棕榈酸质量比为0.026％：0％，丁酸工作浓度为3mm)。对每组细胞进行细胞感染病毒试验后，检测pedv n蛋白转录及表达水平。丁酸与棕榈酸组合使用时，可通过细胞免疫功能及细胞周期的调节，显著抑制细胞内病毒复制。
31.图5为所述试剂利用不同方式处理细胞在细胞病毒感染试验中的应用。泳道1为不感染pedv的细胞样本，泳道2为感染pedv的样本，泳道3为感染pedv且经所述试剂处理的样本；a为病毒感染前预处理，b为病毒感染时同时处理，c为病毒感染后处理。三种处理方式均能调节通过细胞免疫功能及细胞周期从而抑制细胞内病毒复制。
32.图6为所述试剂处理在细胞病毒感染试验中的应用。丁酸与棕榈酸组合使用(丁酸和棕榈酸质量比为0.013％︰0.00064％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为1.5mm和25μm)处理
的细胞感染pedv，检测病毒蛋白、细胞周期及相关标志分子表达的情况。1为不感染pedv的细胞组，2为所述试剂组合使用处理的细胞组，3为感染pedv的细胞组，4为所述试剂组合使用后感染pedv的细胞组。a为各组细胞周期的变化；b为细胞周期相关蛋白cyclina2、pedv n蛋白等的表达情况。
具体实施方式
33.下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述。
34.实施例1
35.将ipec-j2细胞培养于96孔板至细胞密度为60％时，每孔分别加入0、1、1.5、2、2.5、3mm丁酸、1、5、10、20、50μm棕榈酸，同时设置阴性对照，每组设置8个重复孔，于37℃培养箱中恒温培养12h后，每孔分别加入10μl cck-8(5mg/ml)，37℃避光孵育2h，测定各孔在450nm的吸光度。细胞活力(％)＝od
450 nm
(对照组)/od
450 nm
(处理组)
×
100。
36.实验结果：
37.细胞活性试验结果如附图2所示，所述试剂成分丁酸在0～5mm浓度范围内对细胞存活无明显影响，所述试剂成分棕榈酸在0～50μm浓度范围内对细胞存活无明显影响。
38.实施例2
39.(1)细胞处理：ipec-j2细胞培养在6孔板中至细胞密度为70-80％，弃去培养基，用hank’s液洗两遍后，按照不处理对照(丁酸和棕榈酸质量比为0％：0％)、棕榈酸处理(丁酸和棕榈酸质量比为0％：0.00128％，棕榈酸工作浓度为50μm)、丁酸和棕榈酸组合使用处理(丁酸和棕榈酸质量比为0.0065％：0.00096％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为0.75mm和37.5μm)、丁酸和棕榈酸组合使用处理(丁酸和棕榈酸质量比为0.013％︰0.00064％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为1.5mm和25μm)、丁酸和棕榈酸组合使用处理(丁酸和棕榈酸质量比为0.195％：0.00032％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为2.25mm和12.5μm)和丁酸处理(丁酸和棕榈酸质量比为0.026％：0％，丁酸工作浓度为3mm)分为6个组，各组2ml细胞培养基中分别加入1m丁酸母液0μl，0μl，1.5μl，3μl，4.5μl，6μl与10mm棕榈酸母液0μl，10μl，7.5μl，5μl，2.5μl，0μl，进行细胞预处理。
40.(1)样本收集：用于检测细胞及蛋白表达情况的样本，弃去培养上清，加入ripa裂解液裂解收获，-80℃保存。用于转录检测的样本，弃去培养上清，加入trizol裂解液裂解收获，-80℃保存。
41.(2)用于细胞蛋白表达情况检测的裂解样本，加入蛋白电泳loading buffer制备蛋白电泳样品，进行sds-page电泳。每孔加20μl蛋白样品，恒压120v，1h后，将蛋白转印至pvdf膜上，转膜条件为恒流0.26a，45min。用5％脱脂奶粉室温封闭1h，tbst洗3次，每次10min。根据蛋白分子量大小裁剪pvdf膜，分别用1:500稀释的isg15抗体、cyclina2抗体及细胞gapdh的抗体4℃孵育过夜。次日用tbst洗三次，用hrp标记二抗(1:1000稀释)37℃孵育1.5h，tbst洗三次。加入ecl显色底物，用化学发光成像仪进行成像分析。
42.(3)将用于转录水平检测的细胞裂解样本，用rna抽提试剂盒提取总rna并进行反转录，反转录体系为：将rnase-free water 8μl，4x gdna wiper mix 4μl和rna 4μl混匀，42℃反应2min后，加入5x hiscript it qrt super mix11 4μl，混匀并短暂离心，37℃反应15min，85℃终止5s。用isg15特异性引物，以cdna为模板，进行扩增，扩增体系及条件为：
sybr 10μl，rnase-free water 7.2μl，上下游引物各0.4μl，cdna 2μl，95℃循环10min，95℃循环15s，58℃循环50s，72℃循环2s，循环40次，熔解曲线为65℃到95℃。
43.实验结果：对每组细胞检测细胞先天免疫isg15分子及细胞周期相关因子cyclina2表达水平，结果如附图3所示。丁酸与棕榈酸组合使用时，isg15的转录水平、isg15及cyclina2表达水平均有显著上升，丁酸与棕榈酸的质量比为0.013％︰0.00064％组合使用时，isg15及cyclina2表达水平最高，对细胞免疫功能及细胞周期的调节效果最佳。
44.实施例3
45.(1)细胞处理：ipec-j2细胞培养在6孔板中至细胞密度为70-80％，弃去培养基，用hank’s液洗两遍后，按照不处理对照(丁酸和棕榈酸质量比为0％：0％)、棕榈酸处理(丁酸和棕榈酸质量比为0％：0.00128％，棕榈酸工作浓度为50μm)、丁酸和棕榈酸组合使用处理(丁酸和棕榈酸质量比为0.0065％：0.00096％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为0.75mm和37.5μm)、丁酸和棕榈酸组合使用处理(丁酸和棕榈酸质量比为0.013％︰0.00064％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为1.5mm和25μm)、丁酸和棕榈酸组合使用处理(丁酸和棕榈酸质量比为0.195％：0.00032％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为2.25mm和12.5μm)和丁酸处理(丁酸和棕榈酸质量比为0.026％：0％，丁酸工作浓度为3mm)分为6个组，各组2ml细胞培养基中分别加入1m丁酸母液0μl，0μl，1.5μl，3μl，4.5μl，6μl与10mm棕榈酸母液0μl，10μl，7.5μl，5μl，2.5μl，0μl，进行细胞预处理。按moi＝1的感染比进行pedv感染。
46.(2)样本收集：用于检测细胞及蛋白表达情况的样本，弃去培养上清，加入ripa裂解液裂解收获，-80℃保存。用于转录检测的样本，弃去培养上清，加入trizol裂解液裂解收获，-80℃保存。
47.(2)用于细胞蛋白表达情况检测的裂解样本，加入蛋白电泳loading buffer制备蛋白电泳样品，进行sds-page电泳。每孔加20μl蛋白样品，恒压120v，1h后，将蛋白转印至pvdf膜上，转膜条件为恒流0.26a，45min。用5％脱脂奶粉室温封闭1h，tbst洗3次，每次10min。根据蛋白分子量大小裁剪pvdf膜，分别用1:500稀释的pedv n蛋白抗体及细胞gapdh的抗体4℃孵育过夜。次日用tbst洗三次，用hrp标记二抗(1:1000稀释)37℃孵育1.5h，tbst洗三次。加入ecl显色底物，用化学发光成像仪进行成像分析。
48.(3)将用于转录水平检测的细胞裂解样本，用rna抽提试剂盒提取总rna并进行反转录，反转录体系为：将rnase-free water 8μl，4x gdna wiper mix 4μl和rna 4μl混匀，42℃反应2min后，加入5x hiscript it qrt super mix11 4μl，混匀并短暂离心，37℃反应15min，85℃终止5s。用5’utr特异性引物，以cdna为模板，进行扩增，扩增体系及条件为：sybr 10μl，rnase-free water 7.2μl，上下游引物各0.4μl，cdna 2μl，95℃循环10min，95℃循环15s，58℃循环50s，72℃循环2s，循环40次，熔解曲线为65℃到95℃。
49.实验结果：对每组细胞检测细胞感染pedv后病毒拷贝数变化及pedv n蛋白表达水平，结果如附图4所示。丁酸与棕榈酸组合使用时，pedv病毒拷贝数及n蛋白表达量均有一定程度下降。
50.实施例4
51.将ipec-j2细胞培养于24孔板，培养至细胞80％汇合时，分别用3种不同的方式处理细胞：(a)病毒感染前预处理：弃去细胞培养基，向培养基中加入1m丁酸母液3μl与10mm棕榈酸母液5μl，丁酸和棕榈酸组合使用处理细胞(丁酸和棕榈酸质量比为0.013％︰
0.00064％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为1.5mm和25μm)，37℃培养4h，弃去含有所述试剂的培养基，用hank’s液洗两遍，按moi＝1的感染比将pedv病毒液加入培养基，37℃吸附4h，弃去含有病毒的培养基，用hank’s液洗两遍后加入含有5％胰酶的培养基继续培养20h；(b)病毒感染时同时处理：弃去细胞培养基，用hank’s液洗两遍，按moi＝1的感染比将pedv病毒液加入培养基，37℃吸附4h，弃去含有病毒的培养基，用hank’s液洗两遍后向培养基中加入1m丁酸母液3μl与10mm棕榈酸母液5μl，丁酸和棕榈酸组合使用处理细胞(丁酸和棕榈酸质量比为0.013％︰0.00064％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为1.5mm和25μm)和5％胰酶继续培养20h；(c)病毒感染后处理：弃去细胞培养基，向培养基中加入1m丁酸母液3μl与10mm棕榈酸母液5μl，丁酸和棕榈酸组合使用处理细胞(丁酸和棕榈酸质量比为0.013％︰0.00064％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为1.5mm和25μm)，37℃培养4h，弃去含有所述试剂的培养基，用hank’s液洗两遍，按moi＝1的感染比将pedv病毒液加入培养基，37℃吸附4h，弃去含有病毒的培养基，用hank’s液洗两遍后加入含有5％胰酶的培养基继续培养4h后，加入所述试剂继续培养16h。设置病毒不感染组的细胞为阴性对照组，设置病毒感染但不经所述试剂处理的细胞为阳性对照组，分别检测pedv n蛋白及细胞内参蛋白β-actin的表达情况。
52.实验结果：
53.不同处理方式对病毒蛋白表达的影响结果如附图5所示，三种处理方式均可有效的抑制pedv n蛋白的表达。
54.实施例5
55.(1)细胞处理：ipec-j2细胞培养在6孔板中至细胞密度为70-80％，弃去培养基，用hank’s液洗两遍后，向培养基中加入1m丁酸母液3μl与10mm棕榈酸母液5μl，丁酸和棕榈酸组合使用处理细胞(丁酸和棕榈酸质量比为0.013％︰0.00064％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为1.5mm和25μm)，设置不处理组作为对照。按moi＝1的感染比进行pedv感染。
56.(2)样本收集：用于检测细胞及蛋白表达情况的样本，弃去培养上清，加入ripa裂解液裂解收获，-80℃保存。用于拷贝数检测的样本，弃去培养上清，加入trizol裂解液裂解收获，-80℃保存。
57.(3)用于细胞及蛋白表达情况检测的裂解样本，加入蛋白电泳loading buffer制备蛋白电泳样品，进行sds-page电泳。每孔加20μl蛋白样品，恒压120v，1h后，将蛋白转印至pvdf膜上，转膜条件为恒流0.26a，45min。用5％脱脂奶粉室温封闭1h，tbst洗3次，每次10min。根据蛋白分子量大小裁剪pvdf膜，分别用1:1000稀释的pedv n及细胞β-actin的单抗4℃孵育过夜。次日用tbst洗三次，用hrp标记二抗(1:1000稀释)37℃孵育1.5h，tbst洗三次。加入ecl显色底物，用化学发光成像仪进行成像分析。
58.用于细胞周期检测的细胞悬液，每管细胞样品中加入碘化丙啶染色液，37℃避光孵育30min。染色完成后用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况，进行细胞dna含量分析。
59.实验结果：
60.经丁酸和棕榈酸组合使用(丁酸和棕榈酸质量比为0.013％︰0.00064％，丁酸和棕榈酸工作浓度分别为1.5mm和25μm)处理的细胞感染病毒后，细胞周期检测结果如附图6a所示，细胞及病毒蛋白表达情况如附图6b所示：处理组的细胞感染pedv后，病毒引起的细胞s期阻滞现象得到显著缓解，细胞周期相关的cyclina2蛋白的表达显著上调，病毒n蛋白水平
下降。

技术特征：
1.一种具备调节细胞周期及细胞免疫功能的工作液，其特征在于，该工作液的有效成分是丁酸和棕榈酸，余量为用作溶剂的dmso和ddh2o，以及用于提供细胞营养和促进细胞生长增殖的细胞培养基；其中，丁酸与细胞培养基的质量比为0.013︰100，棕榈酸与细胞培养基的质量比为0.00064︰100。2.根据权利要求1所述的工作液，其特征在于，所述丁酸的cas号为107-92-6，分子式为c4h8o2，分子量为88.11；所述棕榈酸cas号为57-10-3，分子式为c
16
h
32
o2，分子量为256.424。3.根据权利要求1所述的工作液，其特征在于，所述细胞培养基是dmem培养基、1640培养基、f12培养基或mem培养基中的任意一种，其有效成分包括氨基酸、糖、矿物质、维生素、氧化剂和抗生素。4.权利要求1所述具备调节细胞周期及细胞免疫功能的工作液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)按25.65mg︰10ml的比例，将棕榈酸溶于dmso中，得到浓度为10mm的棕榈酸母液；按0.881g︰10ml的比例，将丁酸溶于ddh2o中，得到浓度为1m的丁酸母液；(2)按母液︰细胞培养基的比例为2.5μl/ml和1.5μl/ml，分别取棕榈酸母液和丁酸母液；然后依次加入细胞培养基中混匀，配成工作液；工作液中丁酸和棕榈酸的百分比含量为分别为0.013％和0.00064％。5.权利要求1所述具备调节细胞周期及细胞免疫功能的工作液的使用方法，其特征在于，是将该工作液用于细胞培养。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，按下述任意一种方法使用工作液：(1)预处理：对于进行中的细胞培养试验，弃去孔板中原有细胞培养基；加入2ml工作液对细胞进行预处理，然后弃去工作液用hank’s液洗两遍，再根据实验方案对细胞进行后续操作；(2)同时处理：对于进行中的细胞培养试验，弃去孔板中原有细胞培养基，用hank’s液洗两遍；在根据实验方案对细胞进行后续操作的同时，使用2ml工作液进行细胞培养；(3)后处理：根据实验方案对细胞进行操作后，用hank’s液洗两遍，加入2ml工作液进行细胞培养。

技术总结
本发明涉及化合物新用途技术领域，旨在提供一种具备调节细胞周期及细胞免疫功能的工作液及使用方法。该工作液的有效成分是丁酸和棕榈酸，余量为用作溶剂的DMSO和ddH2O，以及用于提供细胞营养和促进细胞生长增殖的细胞培养基；其中，丁酸与细胞培养基的质量比为0.013︰100，棕榈酸与细胞培养基的质量比为0.00064︰100。本发明试剂用于细胞培养时的增强细胞免疫、缓解细胞周期阻滞效果非常显著。试剂成分均为脂肪酸，是机体细胞代谢产物组分之一，对机体细胞无明显毒副作用，作为调节细胞周期、增强细胞免疫的试剂在使用时更安全、便捷、副作用少。副作用少。副作用少。


技术研发人员：单颖 毛俊勇 张楚妮 徐计东 李肖梁 方维焕
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/9/6