一种重组酵母基因工程菌及其在生物合成胆绿素中的应用的制作方法

一种重组酵母基因工程菌及其在生物合成胆绿素中的应用
(一)技术领域
1.本发明属于生物合成技术领域，具体涉及一种重组酵母基因工程菌及其在生物合成胆绿素中的应用。
(二)

背景技术：

2.胆绿素(biliverdin，cas：114-25-0)是一些生物体内产生的一类胆色素，主要由血红素(heme，cas：14875-96-8)降解产生。在脊椎动物体中，衰老的红细胞在单核吞噬细胞系统的作用下，释放出血红蛋白，血红蛋白随后被分解成球蛋白和血红素。血红素在血红素加氧酶(heme oxygenase，缩写ho)的作用下，将卟啉环氧化断裂而成为胆绿素(反应式见图1)。ho有ho1、ho2和ho3三种类型，其中ho1是主要酶，对血红素的催化活性高于其他两种类型，其分子量约为27kda，属于热休克蛋白(hsp)家族，在许多微生物、植物、动物和人体细胞内都天然存在。
3.在脊椎动物体内，作为血红蛋白的重要组成部分，血红素的重要性不言而喻，但血红素的代谢产物胆色素(胆绿素和胆红素)一直被认为对机体是有害无益。但近年的研究发现，作为血红素主要的代谢产物之一，胆绿素可依靠胆绿素-胆红素氧化还原系统，发挥抗氧化、抗炎、抑制免疫反应、稳定血管内皮细胞、调控细胞凋亡等作用，此外，胆绿素还可以作为多种发光基团的前体物质，在材料科学、合成生物学等领域中发挥重要作用。
4.胆绿素天然存在于如鸟类蛋壳、海洋鱼类血液、蛇类、禽类胆汁等，所以胆绿素可以从动物源性材料中直接提取，或将哺乳动物胆汁中提取出的胆红素氧化成胆绿素，但从动物组织中提取生化制品，存在着得率低、杂质过多、病原微生物污染等风险因素。因此亟需开发一种非动物来源的胆绿素生产方法，而利用微生物代谢合成被广泛认为是一种最有潜力的生产方式。
5.血红素是胆绿素的直接前体，目前可以从猪血中大量提取制备，价格不高，如果利用化学或生物方法将血红素转化为胆绿素，是一条极具有开发前景的生产方法。化学水解法由于没有选择性，往往得到是ixα、ixβ、ixγ和ixδ共计4种胆绿素的异构体；相比之下，生物转化法具有较高的选择性，血红素在ho1的作用，得到的只有ixα一种构型。目前，国内学者开展了一些生物转化血红素为胆绿素的研究，如梅建凤等构建了表达集胞藻ho1的大肠杆菌，转化外源血红素为胆绿素，转化体系中的胆绿素产率为61.7mg/l[cn201810854269.4]；闫思翰等构建了表达破伤风梭状芽孢杆菌来源的ho的基因重组大肠杆菌，并在其细胞内构建了nadph辅酶再生系统和膜表面展示系统，转化血红素为胆绿素产率达到76.3mg/l[闫思翰,邵明龙,徐美娟,等.重组大肠杆菌全细胞催化高效合成胆绿素.生物工程学报,2022,38(7):2581-2593]。利用完整细胞转化血红素为胆绿素，存在最大的问题是血红素进入大肠杆菌细胞内存在跨膜障碍，表达ho1的大肠杆菌很难高效率转化。
[0006]
因此，目前仍亟需开发一种绿色环保、高效的生物转化血红素制备胆绿素的方法。
(三)

技术实现要素：

[0007]
本发明提供一种重组酵母基因工程菌及其在生物转化法合成胆绿素中的应用，所述重组酵母基因工程菌以巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris，以下简称毕赤酵母)为宿主菌，过表达血红素加氧酶1(ho1)，以该重组毕赤酵母基因工程菌为催化剂，以血红素为底物，生物转化法合成胆绿素，显著提高了产率，且生产工艺具有高效、绿色环保等优点。
[0008]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
[0009]
本发明提供一种重组酵母基因工程菌，所述重组酵母基因工程菌以毕赤酵母为宿主菌过表达拟南芥(arabidopsis thaliana)来源血红素加氧酶1(ho1)；所述毕赤酵母优选为巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)gs115菌株。
[0010]
优选的，所述ho1编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0011]
优选的，所述的重组毕赤酵母基因工程菌，按以下步骤构建：
[0012]
(1)基因的合成：依据ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库提供的拟南芥来源ho1基因序列(genbank:ab021858)，两端分别引入bamh i和not i限制性内切酶位点序列，化学合成基因的dna序列，基因的dna序列见seq id no.1；
[0013]
(2)重组载体的构建：合成的dna序列和质粒载体ppic9k，分别经限制性内切酶bamh i和not i双酶切后用t4 dna酶连接，获得重组载体ppic9k-ho1，热激法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选阳性转化子并抽提质粒；抽提的质粒经sal i酶切线性化，割胶纯化回收线性化后的重组载体ppic9k-ho1；
[0014]
(3)重组载体转化酵母：制备毕赤酵母(优选gs115菌株)感受态细胞，并用电转化将线性化的重组载体ppic9k-ho1同源重组至毕赤酵母基因组中，电转化的毕赤酵母接种于md平板培养基，30℃培养24h。所述md培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/l，无氨基酵母氮源(ynb)13.4g/l，生物素0.4mg/l，琼脂20g/l，溶剂为水，ph自然；
[0015]
(4)阳性重组子的筛选：从md平板上挑取多个单菌落，接种至含100μg/ml遗传霉素(g418)的ypd培养基的试管中，30℃培养24h，随后分别从各菌液中抽提各转化子的基因组，使用5
′‑
aox和3
′‑
aox引物扩增，筛选阳性重组子。所述ypd培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母浸出粉10g/l，溶剂为水，ph＝7.2；
[0016]
(5)高拷贝重组子的筛选：将步骤(4)中的阳性重组子进行高拷贝重组子的ptva扩增(post transformational vector amplification)，提高其ho1的拷贝数，获得一株ho1拷贝数为4的重组子，即为所述重组酵母基因工程菌，编名为毕赤酵母gs115-ho1。
[0017]
本发明还提供一种所述重组酵母基因工程菌在生物转化血红素合成胆绿素中的应用，所述应用的方法为：(1)重组酵母基因工程菌菌体接种于bmmy培养基中诱导表达ho1；(2)向步骤(1)诱导后的发酵液中加入血红素溶液构成转化体系，用1mol/l的naoh水溶液调整转化体系的ph＝7.0
–
8.0；体系于30℃、180
–
200r/min转化4
–
8h；(3)步骤(2)转化反应结束后，转化液于5000
–
8000r/min离心10min，分别收集湿菌体和上清，从湿菌体和上清中分离胆绿素，获得胆绿素粗提物。
[0018]
进一步，步骤(1)所述重组酵母基因工程菌菌体接种于bmmy培养基中诱导表达ho1的方法是：将甘油水溶液冻存的重组酵母基因工程菌(优选毕赤酵母gs115-ho1)菌液，按体积分数2％
–
3％的接种量，接种于bmgy培养基中，30℃、180
–
200r/min培养16
–
18h至od
600
＝6
–
8时，将其倒入无菌的离心管中，4℃、5000
–
8000r/min离心5
–
10min，弃上清，加入bmgy培
养基1/2体积的bmmy培养基重悬后，倒入三刺锥形瓶中，于30℃、200
–
220r/min培养3
–
5d，得od
600
＝11
–
13的发酵液。培养期间，每24h补加bmmy培养基体积1％的甲醇和/或2.5％甲醇摩尔量的山梨糖醇(1mol/l的水溶液形式加入)。
[0019]
进一步，所述的bmgy培养基终浓度组成：蛋白胨20g/l、酵母浸出粉10g/l、甘油10g/l、无氨基酵母氮源(ynb)13.4g/l、生物素0.4mg/l，溶剂为ph＝6.0、0.1mol/l柠檬酸钠缓冲液。
[0020]
所述的bmmy培养基终浓度组成：蛋白胨20
–
30g/l、酵母浸出粉10
–
15g/l、甲醇10
–
20ml/l、ynb 13.4g/l、生物素0.4mg/l，溶剂为ph＝5.0
–
6.0、0.1mol/l柠檬酸钠缓冲液，其中蛋白胨优选20g/l、酵母浸出粉优选10g/l。
[0021]
进一步，步骤(2)转化体系中血红素浓度为0.6
–
0.8g/l，诱导后发酵液的菌体浓度od
600
＝11
–
13。
[0022]
进一步，步骤(2)所述的血红素溶液，是用0.05mol/l的naoh水溶液配制的氯化血红素溶液，浓度为20g/l。
[0023]
进一步，步骤(3)从湿菌体中分离胆绿素的方法为：湿菌体加原转化体系体积的1/6
–
1/10的甲醇，涡旋震荡2min后，室温条件下8000
–
10000r/min离心5min，收集得到的绿色甲醇液即为菌体提取液，经35℃、
–
0.1mpa真空干燥，得到胆绿素粗提物干粉。
[0024]
进一步，步骤(3)从上清中分离胆绿素的方法为：上清用6mol/l的盐酸调节ph＝1.0，室温条件下8000
–
10000r/min离心5min，收集沉淀，沉淀物经
–
80℃、《100pa条件下冷冻干燥，得到胆绿素粗提物干粉。
[0025]
与现有技术相比，本发明提供了一种制备胆绿素的新方法，有益效果主要体现在：本发明构建表达ho1基因重组毕赤酵母gs115-ho1，经过产酶诱导培养后，外源添加的血红素能够进入细胞内而被转化为胆绿素。在表达ho1的毕赤酵母gs115-ho1发酵液中直接添加血红素底物，转化4h后，体系中胆绿素转化产率达到132mg/l，相比于大肠杆菌表达ho1转化血红素为胆绿素的方法，转化产率大幅度提高，转化时间显著缩短，对降低生物转化法合成胆绿素的生产成本具有显著效果。
(四)附图说明
[0026]
图1：血红素加氧酶将血红素转化为胆绿素的反应式。
[0027]
图2：重组毕赤酵母gs115-ho1的基因pcr鉴定电泳图((1-4:gs115-ho1 pcr产物；m：marker)。
[0028]
图3：重组毕赤酵母gs115-ho1表达ho1的sds-page电泳图(m：marker；1：阴性对照；2：毕赤酵母gs115-ho1细胞裂解液)。
[0029]
图4：酶标仪分析胆红素的标准曲线。
[0030]
图5：生物转化反应后毕赤酵母gs115-ho1菌体照片。
[0031]
图6：毕赤酵母gs115-ho1生物转化合成的胆绿素hplc分析图谱(a:菌体甲醇提取液；b:上清沉淀物；c:胆绿素标准品)。
[0032]
图7：胆绿素浓度—hplc峰面积标准曲线。
(五)具体实施方式
[0033]
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0034]
以下实施例中，如未说明具体的实验方法，均按照常规分子生物学实验方法操作，如魏群主编的《分子生物学实验指导》(第三版，科学出版社，2015)中所述的方法，或按照试剂盒生产商提供的说明书方法操作。
[0035]
本发明所用的血红素为氯化血红素，分子式为c
34h32
clfen4o4，cas号为16009-13-5，分子量为652。
[0036]
实施例1表达ho1的重组毕赤酵母gs115-ho1的构建
[0037]
本发明所述表达ho1的毕赤酵母gs115-ho1，按以下步骤构建：
[0038]
(1)基因的合成：依据ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库提供的拟南芥来源ho1基因序列(genbank:ab021858)，两端分别引入bamh i和not i序列(5
′‑
ggatcc和3
′‑
cgccggcg)，由生工生物工程(上海)股份有限公司(以下简称“上海生工”)化学合成基因序列，基因的dna序列见seq id no.1；
[0039]
(2)重组载体的构建：合成的dna序列和表达载体ppic9k，分别经限制性内切酶bamh i和not i双酶切，酶切产物经过电泳割胶回收后，目标基因片段和开环的载体ppic9k经t4 dna酶连接后，热激法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选阳性转化子；随后使用axygen质粒小提试剂盒(美国axygen公司)提取质粒，获得重组载体ppic9k-ho1。抽提的质粒经sal i酶切线性化，割胶纯化回收线性化后的重组载体ppic9k-ho1；
[0040]
(3)重组载体转化酵母：经过冰浴预冷的线性化重组载体ppic9k-ho1溶液20μl，加入到80μl预处理好的毕赤酵母gs115感受态细胞中，混合后冰浴5min。将混合液转移入预先灭菌干燥后冰浴的电击杯中(0.2-cm型)，于冰上静置5min。将电击杯放入电转化仪(bio-rad公司，165-2100型)，按“fungi-pichia”模式电转化，电击时间为4ms。电转后，立刻向电击杯中加入1ml预冷的1mol/l的山梨糖醇水溶液，并用1ml移液枪轻柔的吹打使电击杯中的酵母菌液重悬，并将其转移至无菌的1.5ml离心管中，立刻将其放入30℃水浴中复苏2h。取复苏后的菌液，5000r/min离心2min后移去部分上清，保留200μl上清，随后将其重悬，涂布至md平板中，30℃正置培养2h后倒置培养，48h后长出明显的单菌落。所述md培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/l，无氨基酵母氮源(ynb)13.4g/l，生物素0.4mg/l，琼脂20g/l，溶剂为水，ph自然。毕赤酵母gs115感受态细胞的制备过程参照上海生工的酵母感受态制备试剂盒说明书操作；
[0041]
(4)阳性重组子筛选：挑取步骤(3)md培养基上的多个单菌落，接种至5ml含有g418浓度为100μg/ml的ypd培养基的试管中，30℃培养24h，随后吸取1ml菌液，抽提各转化子的基因组，使用5
′‑
aox和3
′‑
aox引物(序列见表1)做pcr扩增。pcr扩增体系见表2，pcr扩增产物的琼脂糖电泳(图2)，可以看到，在900bp左右有条带，按axygen回收试剂盒操作割胶回收dna后，委托上海生工测序验证，测序结果经blast比对分析，与目的基因序列完全一致，说明重组ho1基因的毕赤酵母构建成功。
[0042]
表1 5
′‑
aox和3
′‑
aox引物序列
[0043][0044]
表2gs115-ho1阳性重组子鉴定的pcr体系
[0045][0046]
(5)高拷贝重组子的筛选：将(4)中的阳性重组子进行高拷贝重组子ptva扩增(post transformational vector amplification)，提高其ho1的拷贝数，获得一株ho1拷贝数为4的重组子，即为所述重组酵母基因工程菌，编名为毕赤酵母gs115-ho1。
[0047]
所述的高拷贝重组子ptva扩增方法为：将(4)中确认为阳性重组子的多个gs115-ho1菌体，接种于含100μg/ml g418的ypd培养基，30℃培养24h，取菌液3ml于无菌离心管中，离心弃上清，随后用3ml g418浓度为300μg/ml的ypd培养基将其重悬，随后转移进无菌的试管中，于30℃、180r/min振荡培养24h，转移至无菌离心管中，离心弃上清，并依次用g418浓度为500、1000、1500、2000、2500、3000μg/ml的ypd培养基重复以上操作，挑取菌体量明显增多试管中的菌液0.1ml，加9.9ml无菌水将其稀释后，取0.2ml涂布至g418浓度为3000μg/ml的ypd固体培养基上，于30℃正置培养1h后，倒置培养1d至长出单菌落，挑取长出的多个单菌落，用荧光定量pcr方法检测各自的ho1拷贝数(委托上海生工分析)，筛选获得一株ho1拷贝数为4的重组子，编名为毕赤酵母gs115-ho1。该菌株的菌体接种于含100μg/ml g418的ypd培养基中，30℃、200r/min培养24h后，与质量浓度40％甘油等体积混合，
–
80℃储存备用。
[0048]
(6)ho1诱导表达：将步骤(5)甘油水溶液冻存的毕赤酵母gs115-ho1菌液，以体积分数2％的接种量，接种于50ml bmgy培养基中，30℃、200r/min培养16h至od
600
≈6.0时，将其倒入灭菌后烘干的100ml离心管中，4℃、5000r/min离心5min，弃上清，加入25ml bmmy培养基重悬后倒入250ml三刺锥形瓶中，于30℃、200r/min培养5d，得od
600
＝11.2发酵液。培养期间，每24h补加bmmy培养基体积1％的甲醇。
[0049]
所述的bmgy培养基终浓度组成：蛋白胨20g/l、酵母浸出粉10g/l、甘油10g/l、ynb 13.4g/l、生物素0.4mg/l，溶剂为ph＝6.0、0.1mol/l柠檬酸钠缓冲液；100ml的bmgy培养基配制方法为：蛋白胨2g，酵母浸出粉1g，甘油1g，并加入ph＝6.0柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/l)，使之总体积为90ml，于锥形瓶内121℃灭菌20min，待温度降至室温后，加入过滤除菌的10ml ynb水溶液(134g/l)和10μl生物素水溶液(4g/l)，现配现用；
[0050]
所述的bmmy培养基终浓度组成：蛋白胨20g/l、酵母浸出粉10g/l、甲醇10ml/l、ynb 13.4g/l、生物素0.4mg/l，溶剂为ph＝6.0、0.1mol/l柠檬酸钠缓冲液；100ml的bmmy培养基
配制方法为：蛋白胨2g，酵母浸出粉1g，并加入ph＝6.0、0.1mol/l柠檬酸钠缓冲液，使之总体积为80ml，于锥形瓶内121℃灭菌20min，待温度降至室温后，加入过滤除菌的10ml甲醇水溶液(体积浓度10％)、10ml ynb水溶液(134g/l)和10μl生物素水溶液(4g/l)，现配现用。
[0051]
(7)sds-page分析：取步骤(6)制备的od
600
＝11.2的毕赤酵母gs115-ho1发酵液100μl于1.5ml离心管中，8000r/min离心3min，弃上清，用50μl的去离子水重悬菌体，采用“煮冻煮”的方式裂解酵母细胞。取16μl裂解后的菌液与4μl的5
×
loading buffer混合后，于沸水中煮沸10min变性备用。所述“煮冻煮”的方法，即菌液放置于沸水中煮5min后放入液氮中速冻10min，再放入沸水中煮沸，如此重复操作3次。细胞裂解液经sds-page蛋白电泳分析(图3)，重组菌表达了分子量约为27kd的蛋白，与ho1分子量大小一致(26.68kd)，说明毕赤酵母gs115-ho1表达了ho1蛋白；
[0052]
(8)ho1酶活测定：取步骤(6)制备的od
600
＝11.2的5ml毕赤酵母gs115-ho1发酵液于离心管中，于4℃、8000r/min离心5min，弃上清，加入1ml的ph＝6.0、0.1mol/l柠檬酸钠缓冲液重悬菌体，冰浴条件下超声破碎细胞(功率300w，工作4s，间隔2s，工作200次)，于4℃、8000r/min离心10min，收集上清液，即为ho1粗酶液。ho1的酶活测定表明，按发酵液的体积计算，ho1活力为0.437
±
0.036u/ml，说明毕赤酵母gs115-ho1能够表达胞内活性的ho1。
[0053]
ho1活力测定方法为：0.5mmol/l氯化血红素溶液50μl(溶剂为0.05mol/l的naoh水溶液)，0.1mol/l ph＝7.0的柠檬酸钠缓冲液449μl，10g/l的bsa水溶液40μl，40mmol/l的d-葡萄糖-6-磷酸二钠(g-6-p-na2)水溶液50μl，1u/μl的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g-6-pd)水溶液1μl，20mmol/l的nadph水溶液10μl，胆绿素还原酶(bvr)粗酶液200μl，ho1粗酶液200μl，上述溶液于试管中混合均匀后(即为反应体系)于30℃保温15min，测定样品的a
450
，由胆红素-a
450
标准曲线(图4)，计算得到产物胆红素的浓度。按公式1计算ho1的酶活力：
[0054][0055]
公式1中：c-胆红素浓度(μg/ml)；t-反应时间(min)；v
1-反应体系体积，即1ml；v
2-测定酶液的体积(ml)，即0.2ml。
[0056]
血红素加氧酶活力的定义：在30℃、ph＝7.0条件下，在胆绿素还原酶过量的条件下，每分钟生成1μg胆绿素所需ho的酶量(ml)为一个酶活力单位(u)。
[0057]
所使用的bvr粗酶液参照专利cn202010912807.8中所述方法制备。
[0058]
步骤(1)中所述的seq id no.1序列为：
[0059]
gcggctactactgcggcagagaagcagaagaagaggtatcctggagaatcaaagggttttgtggaggagatgaggtttgtggctatgagacttcatactaaagatcaagctaaggaaggtgagaaagagactaaatctattgaggaacgtcctgttgctaaatgggaacctactgttgaaggttacttgaggtttcttgtggatagtaaattggtttatgatactcttgaactgattattcaagactccaatttcccaacttatgccgagttcaagaacacggggctggaaagagcggagaaattatccacggatttggagtggttcaaggaacaaggttacgagattccagaaccaacagctcctggtaaaacatattctcaatatttaaaggaattagcagagaaggatcctcaagcattcatttgtcacttctacaacatctactttgctcatagtgctggtggacgaatgattggcagaaaggtggcagagcggatactcgataataaagaactcgagttctacaaatgggacggcgaactttctcaattgttgcagaacgttagggagaaactgaacaaggttgcagaggagtggactagagaagaaaagaatcattgtttggaagagactgagaaatcgttcaagtattctggtgagatacttcgtctcatattgtcc。
[0060]
实施例2毕赤酵母gs115-ho1表达ho1的条件优化
[0061]
在实施例1的基础上，对毕赤酵母gs115-ho1表达ho1的条件做了优化，包括bmmy培养基的初始ph(3.0
–
8.0)、诱导剂甲醇浓度(0.5％
–
3％)、诱导时间(1
–
6d)和山梨糖醇补加量(甲醇摩尔量的0％
–
10％)，优化得到毕赤酵母gs115-ho1表达ho1的方法为：
[0062]
将甘油水溶液冻存的毕赤酵母gs115-ho1菌液，以体积分数2％的接种量，接种于50ml的bmgy培养基中，30℃、200r/min培养16h至od
600
≈6.0时，将其倒入灭菌后烘干的100ml离心管中，4℃、5000r/min离心5min，弃上清，加入25ml初始ph＝5.0的bmmy培养基重悬后倒入250ml三刺锥形瓶中，于30℃、220r/min培养3d，得od
600
＝12.4发酵液。培养期间，每24h补加bmmy培养基体积1％的甲醇和2.5％甲醇摩尔量的山梨糖醇(1mol/l的水溶液形式加入)。
[0063]
ho1酶活测定表明，按上述方法，以发酵液的体积计算，ho1的酶活为0.560
±
0.081u/ml，较未优化前的0.437
±
0.036u/ml，酶活提高了28.1％。
[0064]
bmgy培养基的终浓度组成和配制方法同实施1；所述的bmmy培养基终浓度组成和配制方法，除柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/l)的ph＝5.0，其他同实施例1。
[0065]
实施例3利用毕赤酵母gs115-ho1生物转化血红素合成胆绿素1
[0066]
利用毕赤酵母gs115-ho1生物转化血红素合成胆绿素的方法，可以按以下步骤操作：
[0067]
(1)甘油水溶液冻存的毕赤酵母gs115-ho1菌液，以体积分数2.5％的接种量，接种于50ml的bmgy培养基中，30℃、200r/min培养16h至od
600
≈6.0时，将其倒入灭菌后烘干的100ml离心管中，4℃、5000r/min离心10min，弃上清，加入25ml的ph＝5.0的bmmy培养基重悬后倒入250ml三刺锥形瓶中，于30℃、220r/min培养3d，得od
600
＝11.6。培养期间，每24h补加bmmy培养基体积1％的甲醇和2.5％甲醇摩尔量的山梨糖醇(1mol/l的水溶液形式加入)。
[0068]
(2)向步骤(1)制备的24.25ml od
600
＝11.6发酵液中加入0.75ml溶于0.05mol/lnaoh水溶液中的氯化血红素(浓度为20g/l)，构成体积为25ml转化体系，使体系中氯化血红素浓度为0.6mg/l，用1mol/l的naoh水溶液将转化体系的ph＝7.0，于30℃、180r/min培养8h，转化反应结束后，转化液于5000r/min离心10min，分别收集湿菌体(图5)和上清。
[0069]
(3)hplc法分别分析湿菌体和上清中的胆绿素，结果为：25ml转化体系中菌体内的胆绿素质量为0.871mg；上清中胆绿素质量为1.83mg，合计得胆绿素2.70mg，25ml转化体系中的氯化血红素质量为15mg，由此计算得胆绿素的转化得率为20.2％，转化体系的胆绿素产率为108mg/l。
[0070]
湿菌体中的胆绿素分析方法为：25ml转化反应后的菌体中添加3ml甲醇，涡旋震荡2min后，8000r/min离心10min，收集得到的绿色甲醇液即为菌体提取液，将其于0.22μm滤膜过滤后hplc其分析胆绿素含量；上清中胆绿素分析方法为：上清用6mol/l的盐酸调节ph＝1.0，随后8000r/min离心10min，收集析出的固体，并用3ml甲醇溶解，于0.22μm滤膜过滤后hplc分析其胆绿素含量。菌体甲醇提取液、上清沉淀物和胆绿素标准品的hplc分析图谱见图6。
[0071]
hplc分析胆绿素的条件为：lc
–
20ad高效液相色谱仪(日本岛津仪器有限公司)，色谱柱phenomenex c18(5μm，250mm
×
4.6mm)，流动相为体积比95:5的乙腈和水(含0.1％乙酸)，流速为1ml/min，柱温为室温，检测波长450nm。进样量20μl。由相同分析条件下的标准
品胆绿素浓度—hplc峰面积标准曲线(图7)，计算出检测样品中胆绿素的浓度。
[0072]
所述的胆绿素的转化得率按公式2计算。
[0073][0074]
实施例4利用毕赤酵母gs115-ho1生物转化血红素合成胆绿素2
[0075]
在实施例3的基础上，对毕赤酵母gs115-ho1生物转化血红素合成胆绿素条件做了优化，包括血红素的溶剂种类(0.05mol/l的naoh水溶液、0.1mol/l的na2co3水溶液、dmso或含1％盐酸的丙酮溶液)、生物转化时间(2
–
8h)、转化体系ph(3.0
–
8.0)和底物氯化血红素浓度(0.2
–
1.0g/l)。优选的毕赤酵母gs115-ho1生物转化血红素合成胆绿素方法为：
[0076]
(1)甘油水溶液冻存的毕赤酵母gs115-ho1菌液，以体积分数3％的接种量，接种于50ml bmgy培养基中，30℃、200r/min培养18h至od
600
≈6.0时，将其倒入灭菌后烘干的100ml离心管中，4℃、8000r/min离心10min，弃上清，加入25ml ph＝5.0的bmmy培养基重悬后倒入250ml三刺锥形瓶中，于30℃、220r/min培养3d，得发酵液od
600
＝12.0。培养期间，每24h补加bmmy培养基体积1％的甲醇和2.5％甲醇摩尔量的山梨糖醇(1mol/l的水溶液形式加入)。
[0077]
(2)向步骤(1)制备后的24ml od
600
＝12.0发酵液中加入1ml溶于0.05mol/l naoh水溶液中的氯化血红素(浓度为20g/l)，构成体积为25ml的转化体系，使体系中氯化血红素浓度为0.8g/l，用1mol/l的naoh水溶液将转化体系的ph＝7.0。转化体系于30℃、200r/min培养4h，转化反应结束后，转化液于10000r/min离心10min，分别收集湿菌体和上清。
[0078]
(3)按实施例3中所述的方法，hplc分别分析湿菌体和上清中的胆绿素，结果为：25ml转化体系中菌体内的胆绿素质量为1.05mg；上清中胆绿素质量为2.25mg，合计得胆绿素3.30mg，25ml转化体系中的氯化血红素质量为20mg，由此计算得胆绿素的转化得率为18.5％，体系中胆绿素转化得率为132mg/l。
[0079]
实施例5转化体系中回收胆绿素
[0080]
从转化体系中回收胆绿素的方法，可以按如下步骤操作：
[0081]
(1)按实施例4方法，得到25ml的转化液，转化液于10000r/min离心10min，分别收集湿菌体和上清。
[0082]
(2)步骤(1)所得的湿菌体加4ml甲醇，涡旋震荡2min后，室温条件下10000r/min离心5min，收集得到的绿色甲醇液即为菌体提取液，菌体提取物经35℃、
–
0.1mpa真空干燥，得到胆绿素粗提物干粉；
[0083]
(3)步骤(1)所得的上清用6mol/l的盐酸调节ph＝1.0，室温条件下10000r/min离心5min，收集沉淀，沉淀物经
–
80℃、《100pa条件下冷冻干燥，得到胆绿素粗提物干粉。
[0084]
合并步骤(2)和步骤(3)所制备的胆绿素粗提物干粉，得到毕赤酵母gs115-ho1生物转化血红素合成的胆绿素粗提物28.3mg，hplc分析表明，其胆绿素含量为11.7％。
[0085]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化、修饰，或发酵过程的优化和放大，仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种重组酵母基因工程菌，其特征在于，所述重组酵母基因工程菌以毕赤酵母为宿主菌过表达拟南芥(arabidopsis thaliana)来源的血红素加氧酶ho1。2.如权利要求1所述重组酵母基因工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)gs115菌株。3.如权利要求1所述重组酵母基因工程菌，其特征在于，所述血红素加氧酶ho1编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。4.如权利要求1所述重组酵母基因工程菌，其特征在于，所述的重组毕赤酵母基因工程菌按以下步骤构建：(1)基因的合成：依据ncbi数据库上提供的拟南芥来源ho1基因序列，两端分别引入bamh i和not i限制性内切酶位点序列，化学合成基因的dna序列；(2)重组载体的构建：合成的dna序列和质粒载体ppic9k，分别经限制性内切酶bamhi和not i双酶切后用t4 dna酶连接，获得重组载体ppic9k-ho1，热激法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选阳性转化子并抽提质粒；抽提的质粒经sal i酶切线性化，割胶纯化回收线性化后的重组载体ppic9k-ho1；(3)重组载体转化酵母：制备毕赤酵母感受态细胞，并用电转化将线性化的重组载体ppic9k-ho1同源重组至毕赤酵母基因组中，电转化的毕赤酵母接种于md平板培养基培养；(4)阳性重组子的筛选：从md平板上挑取多个单菌落，接种至含100μg/ml遗传霉素的ypd培养基的试管中，30℃培养24h，随后从菌液抽提各转化子的基因组，使用5
′‑
aox和3
′‑
aox引物扩增，筛选阳性重组子；(5)高拷贝重组子的筛选：将步骤(4)中的阳性重组子进行高拷贝重组子的ptva扩增，提高其ho1基因的拷贝数，获得ho1基因拷贝数为4的重组子，即为重组酵母基因工程菌。5.一种权利要求1所述重组酵母基因工程菌在生物转化血红素合成胆绿素中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：(1)重组酵母基因工程菌菌体接种于bmmy培养基中诱导表达ho1；(2)向步骤(1)诱导后的发酵液中加入血红素溶液构成转化体系，用1mol/l的naoh水溶液调整转化体系的ph＝7.0
–
8.0；体系于30℃、180
–
200r/min转化4
–
8h；(3)步骤(2)转化反应结束后，转化液于5000
–
8000r/min离心10min，分别收集湿菌体和上清，从湿菌体和上清中分离胆绿素，获得胆绿素粗提物。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述重组酵母基因工程菌接种于bmmy培养基中诱导表达ho1的方法是：将甘油水溶液冻存的重组酵母基因工程菌的菌液，按体积分数2％
–
3％的接种量，接种于bmgy培养基中，30℃、180
–
200r/min培养16
–
18h至od
600
＝4
–
8时，将其倒入无菌的离心管中，4℃、5000
–
8000r/min离心5
–
10min，弃上清，加入bmgy培养基1/2体积的bmmy培养基重悬后，倒入三刺锥形瓶中，于30℃、200
–
220r/min培养3
–
5d，得od
600
＝11
–
13的发酵液；培养期间，每24h补加bmmy培养基体积1％的甲醇和/或2.5％甲醇摩尔量的山梨糖醇。8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)转化体系中血红素浓度为0.6
–
0.8g/l，诱导后发酵液的菌体浓度od
600
＝11
–
13。9.如权利要求6或8所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述的血红素溶液，是用0.05mol/l的naoh水溶液配制的氯化血红素溶液，浓度为20g/l。10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(3)从湿菌体中提取分离胆绿素的方法
为：湿菌体加原转化体系体积的1/6
–
1/10的甲醇，涡旋震荡2min后，室温条件下8000
–
10000r/min离心5min，收集得到的绿色甲醇液即为菌体提取液，经35℃、
–
0.1mpa真空干燥，得到胆绿素粗提物干粉；步骤(3)从上清提取分离胆绿素的方法为：上清用6mol/l的盐酸调节ph＝1.0，室温条件下8000
–
10000r/min离心5min，收集沉淀，沉淀物经
–
80℃、<100pa条件下冷冻干燥，得到胆绿素粗提物干粉。

技术总结
本发明公开了一种重组酵母基因工程菌及其在生物合成胆绿素中的应用，所述重组酵母基因工程菌以毕赤酵母为宿主菌过表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源血红素加氧酶1(HO1)。本发明构建表达HO1基因重组毕赤酵母GS115-ho1，经过产酶诱导培养后，外源添加的血红素能够进入细胞内而被转化为胆绿素。在表达HO1的毕赤酵母GS115-ho1发酵液中直接添加血红素底物，转化4h后，体系中胆绿素转化产率达到132mg/L，相比于大肠杆菌表达HO1转化血红素为胆绿素的方法，转化产率大幅度提高，转化时间显著缩短，对降低生物转化法合成胆绿素的生产成本具有显著效果。产成本具有显著效果。


技术研发人员：梅建凤 庄仕航 陈乐生 应国清 易喻
受保护的技术使用者：上海和不同科技有限公司
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/9/6