胰腺癌阳离子标志物的筛选方法及其应用

1.本发明涉及胰腺癌领域，尤其是涉及一种胰腺癌阳离子标志物的筛选方法及其应用。


背景技术：

2.胰腺癌（pancreatic cancer，pc）是一种毁灭性疾病，由于缺乏早期诊断和对常规治疗方案无反应，导致生存率仍然低，死亡率接近100%。迄今为止，手术切除是唯一可能治愈的方法。随着胰腺癌的全球发病率和流行率持续上升，迫切需要高度重视其预防及早期诊断。吸烟是最常见的烟草消费方式，烟草也是最常见的吸食物质。根治性手术切除是目前治疗胰腺癌最有效的方法，但低于20%的胰腺癌患者才拥有手术机会且预后较差。因此，寻找新型有效的辅助诊断措施对改善胰腺癌的发生、发展及预后尤为重要。
3.目前，越来越多的人已经认识到整合不同水平的数据是诊断早期胰腺癌生物标志物的重要方法。利用代谢组学技术可以对生物体内所有代谢物进行定量分析。近年来，代谢组学作为系统生物学的重要组成部分，结合模式识别方法，可用于判断生物体的病理生理状态，因此被广泛运用于疾病研究中。液相色谱-质谱串联技术是代谢组学的主要研究手段，前列腺癌的诊断标志物肌氨酸的检测、新生儿疾病筛查时的多种氨基酸检测等均是代谢小分子在疾病诊断中应用的已有成功案例。因此，寻找新的可以诊断胰腺癌的代谢标志物具有十分重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明目的之一在于提供一种胰腺癌阳离子标志物的筛选方法，即采用质谱分析的方法检测小分子阳离子含量；该方法简单，实用，且通过多种小分子的检测可以更好地提高检测方法的灵敏度与特异性。
5.为实现上述目的，本发明胰腺癌阳离子标志物的筛选方法采取下述技术方案：一种胰腺癌阳离子标志物的筛选方法，包括如下步骤：（1）样本预处理，取出-80
°
c下保存的血液样本并解冻，采用4
°
c预冷的pbs清洗，加入ddh2o后进行匀浆，涡旋，再加入体积之比为1：1的甲醇和乙腈混合溶液，涡旋，超声破碎，再放置-20
°
c下孵育后，4
°
c下离心，将上清真空冷冻干燥，将冻干粉置于-80
°
c下备用；（2）lc-ms/ms质谱分析，将步骤（1）中的冻干粉采用体积之比为1：1的乙腈和水混合溶液复溶后采用超高效液相色谱进行分离，然后采用电喷雾电离质谱进行检测得到质谱数据；（3）分子产物鉴定，待步骤（2）中检测完毕后，通过质谱仪鉴定分子产物，同时，采集样本的一级谱图和二级谱图，经proteowizard将质谱数据转换成.mzxml格式，然后采用lc-ms spectra annotation软件进行峰对齐、保留时间校正以及峰面积的提取；采用精确质量数匹配《25 ppm和二级谱图匹配的方式对小分子的结构进行鉴定；（4）显著性差异的阳离子筛选，采用opls-da模型对步骤（3）中的分子产物进行初
筛，以vip》1为筛选标准，初步筛选出各分组之间的差异分子，然后，对初筛得到的差异分子再次筛选，筛选出具有显著性差异的分子即为胰腺癌阳离子标志物。
6.优选地，步骤（2）中，所述复溶采用的溶液为乙腈和水的混合物，所述乙腈和水的体积之比为1：1。
7.进一步优选地，步骤（2）中，所述超高效液相色谱的参数设置为：柱温为25
°
c，流速为0.3 ml/min，上样量为2 μl；流动相由流动相a和流动相b组成，其中，流动相a为含有25 mm乙酸铵和25 mm氨水的水溶液，流动相b为纯乙腈；样品采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为，0～0.5 min，95% b；0.5～7min，95%b～65%b；7～8 min，65%b～50%b；8～9 min，50%b；9～9.1 min，50%b～95%b；9.1～12 min，95%b。
8.优选地，步骤（2）中，所述电喷雾电离质谱在正离子模式下进行检测，电喷雾电离质谱的参数设置为：干燥气体流速为16 l/min，气体温度为250
°
c；鞘气温度为500
°
c，鞘气流速为12 l/min，喷雾器为20 psig，升压电容正极为3000 v，nozzle电压为175 v，相对分子质量范围为50～1200 da，数据采速率为4 hz，每个循环的时间为50ms。
9.优选地，步骤（3）中，所述质谱仪的参数设置为：离子源气体1为50，离子源气体2为80，离子源温度为650
°
c，气帘气为30，离子喷雾电压
±
5000 v，正离子模式；二级质谱采用高灵敏度模式进行采集，分布势能为
±
60 v，正离子模式，碰撞能量为35
±
15 ev；ida的排除同位素参数设置为4da，每个周期要监测的候选离子为10；采集数据按照质核比范围进行分段，其中，质核比范围分别为50～300m/z，290～600 m/z，590～900 m/z，890～1200 m/z。
10.优选地，步骤（4）中，再次筛选的依据为：选择同时具有多维统计分析vip》1、fold change》2或《0.5认为胰腺癌血液和正常胰腺血液之间分子含量存在显著倍数差异，并且单维度t检验统计分析p value 《 0.05的分子，作为具有显著性差异的分子阳离子。
11.优选地，步骤（4）中，所述显著性差异的分子为trimethylamine n-oxide、cytosine、sphingomyelin和thymine。
12.本发明目的之二在于提供一种胰腺癌阳离子标志物的应用。
13.为实现上述目的，本发明胰腺癌阳离子标志物的应用采取下述技术方案：一种胰腺癌阳离子标志物在制备胰腺癌诊断试剂盒或诊断药物中的应用，所述胰腺癌阳离子标志物为trimethylamine n-oxide、cytosine、sphingomyelin和thymine。
14.优选地，所述试剂盒中包括特异性检测trimethylamine n-oxide、cytosine、sphingomyelin和thymine的试剂。
15.采用spss分别绘制trimethylamine n-oxide、cytosine、sphingomyelin和thymine的roc曲线，其中，所述trimethylamine n-oxide含量的分界点为36193.8725，所述cytosine含量的分界点为11034.6325，所述sphingomyelin含量的分界点为10272.1589，所述thymine含量的分界点为18474.0571。
有益效果
16.本发明采用lc-ms/ms质谱分析方法检测待测样本，通过大量的临床样本进行液相色谱串联质谱分析后，在阳离子检测中筛选出几个有代表性的分子产物。通过胰腺癌血液与正常胰腺血液相应分子产物含量的差异倍数（大于2或小于0.5）可以确定上述4个分子具有良好的检验效益。因此，上述4个分子产物阳离子（trimethylamine n-oxide、cytosine、
sphingomyelin和thymine）可以作为检测胰腺癌的新的标志物。
附图说明
17.图1为trimethylamine n-oxide阳离子诊断胰腺癌的roc曲线；图2为胰腺癌患者血液和正常人血液中trimethylamine n-oxide含量统计；图3为胰腺癌患者血液和正常人血液中trimethylamine n-oxide含量统计；图4为cytosine阳离子诊断胰腺癌的roc曲线；图5为胰腺癌患者血液和正常人血液中cytosine含量统计；图6为胰腺癌患者血液和正常人血液中cytosine含量统计；图7为sphingomyelin阳离子诊断胰腺癌的roc曲线；图8为胰腺癌患者血液和正常人血液中sphingomyelin含量统计；图9为胰腺癌患者血液和正常人血液中sphingomyelin含量统计；图10为thymine阳离子诊断胰腺癌的roc曲线；图11为胰腺癌患者血液和正常人血液中thymine含量统计；图12为胰腺癌患者血液和正常人血液中thymine含量统计。
实施方式
18.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.质控样本（qc）的制备：抽取等量获得的样品充分混合以制备qc样本。制备qc样本的目的为平衡液相色谱-质谱系统、检测样品进样前整个仪器的状态、评价实验的整个过程仪器及实验操作系统的稳定性。
20.样本：分别为取自胰腺癌患者血液的样本a和取自正常胰腺血液样本b各50个。
21.取出保存在-80
°
c冰箱的血液样本，放置冰上解冻。解冻完全后，采用4
°
c预冷的pbs清洗30mg血液样本2次。清洗干净后，每个样本加入200 μl ddh2o后用mp生物样品台式匀浆仪进行匀浆。涡旋60s，加入800 μl甲醇：乙腈溶液（1：1，v/v）。涡旋60s，4
°
c下进行2次超声破碎，每次30min。放置-20
°
c冰箱孵育1h后，15000 rcf，4
°
c离心20min。取出离心管中的上清，置于真空低温冷冻干燥仪中冷冻干燥。将冻干粉放置于-80
°
c保存。
22.3.1 色谱条件利用安捷伦1290 infinity lc超高效液相色谱系统（uhplc）并联合hilic色谱柱（waters acquity uplc beh amide 1.7 μm. 2.1*100mm）进行分离样品。
23.液相色谱系统的参数设置如下：柱温为25
°
c、流速为0.3 ml/min、上样量为2 μl。流动相由两相组成：流动相a为含有25 mm乙酸铵和25 mm氨水的水溶液，流动相b为纯乙腈。样品采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0～0.5 min，95% b；0.5～7min，95%b～65%b；7～8 min，65%b～50%b；8～9 min，50%b；9～9.1 min，50%b～95%b；9.1～12 min，95%b。整个实验过程中所有实验样品均置于4
°
c。冷冻干燥仪干燥的样品利用200 μl的乙腈：水（1：1，v/v）溶液进行复溶。通过随机顺序进行样本连续分析的方法进行采样，以避免检测信号波动对样本检测造成影响。
24.3.2 q-tof质谱条件检测样本在电喷雾电离（electro-spray ionization，esi）正离子模式下进行检测。样品经uhplc分离后用安捷伦6550质谱仪进行检测分析。esi源设置参数为：干燥气体流速：16 l/min，气体温度：250
°
c，鞘气温度：500
°
c，鞘气流速：12 l/min，喷雾器：20 psig，vcap（升压电容正极为）：3000 v，nozzle电压：175 v，相对分子质量范围：50～1200 da，数据采速率：4 hz，每个循环的时间：50ms。
25.样本检测完毕后，通过ab triple tof 6600质谱仪鉴定分子。同时采集qc样品的一级谱图和二级谱图。esi源设置参数：离子源气体1：50，离子源气体2：80，离子源温度：650
°
c，气帘气：30，离子喷雾电压
±
5000 v（正离子模式）；二级质谱information dependent acquisition（ida）获得，并且采用高灵敏度模式进行采集，分布势能：
±
60 v（正离子模式），碰撞能量：35
±
15 ev，ida的参数设置如下：exclude isotopes within 4道尔顿，candidate ions to monitor per cycle：10。采集数据的模式按照质核比范围进行分段，50～300m/z，290～600 m/z，590～900 m/z，890～1200 m/z，以达到扩大二级谱图采集率的目的。同时使用本实验室建立的metdda方法和lipdda方法对采集获得的数据进行分子结构的鉴定。
26.经proteowizard将原始数据转换成.mzxml格式，然后采用lc-ms spectra annotation（xcms）软件进行峰对齐、保留时间校正以及峰面积的提取。采用精确质量数匹配（《25 ppm）和二级谱图匹配的方式对小分子的结构进行鉴定。
27.多维统计分析评估经pareto-scaling预处理后的数据。多维统计分析方法主要包括无监督主成分分析（pca）分析，有监督偏最小二乘法判别分析（pls-da）和正交偏最小二乘法判别分析（opls-da）。同时也采用单维统计分析方法分析经pareto-scaling预处理后的数据。单维统计分析方法主要采用student’s t-test和变异倍数分析，单维统计分析后利用r软件进行火山图的绘制。
28.5.1 数据预处理在合理的实验设计和准确的实验数据基础上，首先检查实验数据是否完整，若实验数据缺失，则对其删除或补充，另一方面检查实验数据是否有极值的出现，若存在则对其删除，最后对数据进行分子物之间以及样本之间的归一化处理，用以确保数据的可比性。
29.对数据进行总峰面积归一化，对数据进行pareto-scaling处理。
30.5.2 单维度统计分析单维度统计分析是最简单常用的实验数据分析方法。目前最常用的单维度统计分析方法包括差异倍数分析（fold change analysis，fc analysis）、student’s t-test以及综合前两种分析方法的火山图（volcano plot）制作。在进行两组样本间的差异分子产物分析时，利用单维度统计分析可以直观地显示两组样本间分子物变化的显著性，从而筛选出潜在的标志分子产物。单维度统计分析差异分子物筛选的原则为fc 》 1.5同时p value 《 0.05。
31.5.3主成分分析（pca）主成分分析（pca）是一种非监督的数据分析方法，一方面，它将鉴定到的所有分子物的原始数据进行重新线性阳离子，进而形成一组新的综合变量。另一方面，pca分析根据分析问题的分类从中选取几个综合变量，使分析得到的新的综合变量尽可能多地反映原有
变量的信息，以实现降低数据维度的目的。同时，分子小分子的pca分析也能很好地从整体角度反映样本组内和组间的变异度。
32.5.4 偏最小二乘判别分析（pls-da）与主成分分析（pca）方法不同，偏最小二乘判别分析方法（pls-da）是一种有监督的判别分析统计方法。该方法利用偏最小二乘回归分析建立样品组别和分子物含量间的关系模型，以达到实现对样品类别预测的目的；模型分析的同时计算变量投影重要度（variable importance for the projection，vip）用以衡量各分子产物的表达模式对各组样本分类判别的解释能力和影响强度，用来辅助差异分子物的筛选（通常用vip评分大于1.0作为筛选标准）。
33.5.5 正交偏最小二乘判别分析（opls-da）与主成分分析（pca）方法不同，正交偏最小二乘判别分析（opls-da）同偏最小二乘判别分析方法（pls-da）一样，是一种有监督的判别分析统计方法。此分析方法采用偏最小二乘回归建立分子产物的表达量与样品组别之间的关系模型，以达到对样品组别预测的目的。该方法是基于pls-da分析方法的基础上进行修正得来，该方法滤除了与分类信息无关的噪音，显著提高了模型的有效性和解析能力。在opls-da评分图上，有两种主成分（预测主成分和正交主成分），一般预测主成分只有1个，即t1，而正交主成分可以同时有多个。opls-da分析可以将组间的差异最大程度地反映在t1上，因此根据t1可以直接区分组间的变异，而正交主成分则可以很好地反映组内的变异。
34.示例组opls-da模型的建立：经过7-fold cross-validation（7次循环交互验证）得到模型评价参数（r2y，q2），将评价参数列于opls-da模型的评价参数表上（a：表示主成分数；r2x：表示模型对x变量的解释率；r2y：表示模型对y变量的解释率；q2：表示模型预测能力），r2y和q2越接近1表明模型的稳定性和可靠性越好，一般q2大于0.5就可说明模型具有很好的稳定性和可靠性，0.3《q2≤0.5模型具有较好的稳定性和可靠性，q2《0.3模型的稳定性和可靠性较低。
35.通过随机改变分类变量y的排列顺序进行置换检验，通过建立200次opls-da模型用以获取随机模型的r2和q2值，纵坐标表示r2或q2的值，横坐标表示置换检验的置换保留度，所有的q2点从左到右均低于最右侧原始的q2点，说明模型稳健可靠未发生过拟合。
36.根据opls-da模型得到的变量权重值（vvip）来衡量各分子产物的表达模式对各组别样本分类判别的解释能力和影响强度，用以挖掘具有生物学意义的差异分子产物。以vip》1为筛选标准，初步筛选出各分组之间的差异分子。
37.根据筛选到的差异分子，进一步采用单维度统计分析方法，验证差异分子是否真的具有显著统计学意义。选择同时具有多维统计分析vip》1、fold change》2或《0.5认为胰腺癌血液和正常胰腺血液之间分子含量存在显著倍数差异，并且单维度t检验统计分析p value 《 0.05的分子，作为具有显著性差异的分子阳离子。然后利用spss软件绘制阳离子的差异分子阳离子的roc曲线，并计算曲线下面积（auc），用以判断差异分子阳离子的诊断价值。具体判断方法为auc线下面积大于0.7，且p《0.05。采用灵敏度和特异性之和最大时的阈值标准作为判断胰腺癌与否的阈值标准（cut off值，倍数大于2认为大于阈值为胰腺癌检测阳性，倍数小于2者认定小于阈值者为胰腺癌检测阳性），从而得到合适的约登指数。
38.经质谱数据分析和将胰腺癌血液与正常胰腺血液的分子阳离子进行统计分析比
较，从而得到几个分子阳离子，可以作为与胰腺癌诊断相关的联合阳离子标志物，具体如下：trimethylamine n-oxide阳离子作为诊断方式，检测到在胰腺癌血液与正常胰腺血液中存在显著统计学差异。若检测trimethylamine n-oxide含量大于36193.8725则判断为胰腺癌患者，否则判断为正常。
39.采用roc曲线分析，auc为roc曲线下的面积，是最常用的评价roc曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若auc在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；auc在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。
40.由图1可知，roc分析显示阳离子诊断的auc为0.835》0.7，说明具有较好的诊断效果，即上述离子的阳离子诊断具有良好的诊断效果。在cut off值为36193.8725时，灵敏度为76%，特异度为76%。当进行个体检测时，trimethylamine n-oxide含量大于36193.8725时，被判为胰腺癌患者，否则判断为正常胰腺患者（假阳性率为24%）。
41.由图2可知，胰腺癌患者血液样本主要分布在检测阈值（图中实线）以上，正常人血液主要分布在检测阈值以下，说明胰腺癌患者血液和正常人血液的trimethylamine n-oxide含量相差甚大，该检测阈值检测效果良好。
42.由图3可知，胰腺癌患者血液中的trimethylamine n-oxide含量显著高于正常组。
43.综上所述，trimethylamine n-oxide阳离子可以作为胰腺癌的诊断方式。
44.2. cytosine阳离子作为诊断方式，检测到在胰腺癌血液与正常胰腺血液中存在显著统计学差异。若检测cytosine含量大于11034.6325则判断为胰腺癌患者，否则判断为正常。
45.采用roc曲线分析，auc为roc曲线下的面积，是最常用的评价roc曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若auc在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；auc在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。
46.由图4可知，roc分析显示阳离子诊断的auc为0.850》0.7，说明具有较好的诊断效果，即上述离子的阳离子诊断具有良好的诊断效果。在cut off值为11034.6325时，灵敏度为92%，特异度为68%。当进行个体检测时，cytosine含量大于36193.8725时，被判为胰腺癌患者，否则判断为正常胰腺患者（假阳性率为32%）。
47.由图5可知，胰腺癌患者血液样本主要分布在检测阈值（图中实线）以上，正常人血液主要分布在检测阈值以下，说明胰腺癌患者血液和正常人血液的cytosine含量相差甚大，该检测阈值检测效果良好。图6可知，胰腺癌患者血液中的cytosine含量显著高于正常组。
48.综上所述，cytosine阳离子可以作为胰腺癌的诊断方式。
49.3. sphingomyelin阳离子作为诊断方式，检测到在胰腺癌血液与正常胰腺血液中存在显著统计学差异。若检测sphingomyelin含量大于10272.1588则判断为胰腺癌患者，否则判断为正常。
50.采用roc曲线分析，auc为roc曲线下的面积，是最常用的评价roc曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若auc在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；auc在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。
51.由图7可知，roc分析显示阳离子诊断的auc为0.903》0.7，说明具有较好的诊断效
果，即上述离子的阳离子诊断具有良好的诊断效果。在cut off值为10272.1588时，灵敏度为76%，特异度为90%。当进行个体检测时，sphingomyelin含量大于10272.1588，被判为胰腺癌患者，否则判断为正常胰腺患者（假阳性率为10%）。
52.由图8可知，胰腺癌患者血液样本主要分布在检测阈值（图中实线）以上，正常人血液主要分布在检测阈值以下，说明胰腺癌患者血液和正常人血液的sphingomyelin含量相差甚大，该检测阈值检测效果良好。
53.由图9可知，胰腺癌患者血液中的sphingomyeline含量显著高于正常组。
54.综上，sphingomyelin阳离子可以作为胰腺癌的诊断方式。
55.4. thymine阳离子作为诊断方式，检测到在胰腺癌血液与正常胰腺血液中存在显著统计学差异。若检测thymine含量大于18474.0570则判断为胰腺癌患者，否则判断为正常。
56.采用roc曲线分析，auc为roc曲线下的面积，是最常用的评价roc曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若auc在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；auc在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。
57.由图10可知，roc分析显示阳离子诊断的auc为0.824》0.7，说明具有较好的诊断效果，即上述离子的阳离子诊断具有良好的诊断效果。在cut off值为18474.0570时，灵敏度为64%，特异度为86%。当进行个体检测时，thymine含量大于18474.0570，被判为胰腺癌患者，否则判断为正常胰腺患者（假阳性率为14%）。
58.由图11可知，胰腺癌患者血液样本主要分布在检测阈值（图中实线）以上，正常人血液主要分布在检测阈值以下，说明胰腺癌患者血液和正常人血液的thymine含量相差甚大，该检测阈值检测效果良好。由图12可知，胰腺癌患者血液中的thymine含量显著高于正常组。
59.综上，thymine阳离子可以作为胰腺癌的诊断方式。
实施例
60.一种胰腺癌阳离子标志物的筛选方法的技术方案，包括如下步骤：（1）样本的制备：提取相应标本的分子产物。
61.（2）lc-ms/ms质谱分析方法检测：利用安捷伦1290 infinity lc超高效液相色谱系统（uhplc）并联合hilic色谱柱（waters acquity uplc beh amide 1.7 μm. 2.1*100mm）进行分离样品，随后采用电喷雾电离（electro-spray ionization，esi）正离子模式进行检测。样品经uhplc分离后用安捷伦6550 质谱仪进行质谱分析。采集质谱数据并分析结果。
62.（3）数据处理：样本检测完毕后，通过ab triple tof 6600质谱仪鉴定分子产物。同时采集qc样品的一级谱图和二级谱图。经proteowizard将原始数据转换成.mzxml格式，然后采用lc-ms spectra annotation（xcms）软件进行峰对齐、保留时间校正以及峰面积的提取。采用精确质量数匹配（《25 ppm）和二级谱图匹配的方式对小分子的结构进行鉴定。
63.（4）统计学分析根据opls-da模型得到的变量权重值（variable importance for the projection， vip）衡量各分子产物的表达模式对样本分类判别的解释能力和影响强度，用以挖掘具有生物学意义的差异分子产物。以vip》1作为筛选标准，初步筛选出各组间的差异
分子产物。
64.根据筛选到的差异分子产物，进一步采用单维度统计分析方法，验证差异分子产物是否真的具有显著统计学意义。选择同时具有多维统计分析vip》1、fold change》2或《0.5认为胰腺癌血液和正常胰腺血液之间分子产物含量存在显著倍数差异，并且单维度t检验统计分析p value 《 0.05的分子产物，作为具有显著性差异的分子产物阳离子。并通过spss 4种阳离子诊断的roc曲线，并计算曲线下面积（auc），用以判断差异分子产物阳离子的诊断价值。具体判断方法为auc线下面积大于0.7，且p《0.05。采用灵敏度和特异性之和最大时的阈值标准作为判断胰腺癌与否的阈值标准（倍数大于2者认为大于阈值为胰腺癌检测阳性，倍数小于2者认定小于阈值者为胰腺癌检测阳性），从而得到合适的约登指数。
65.具体筛选出的阳离子如下：阳离子1，trimethylamine n-oxide。
66.阳离子2，cytosine。
67.阳离子3，sphingomyelin。
68.阳离子4，thymine。
69.通过对上述阳离子标志物进行检测，可以实现对胰腺癌症的诊断。
70.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种胰腺癌阳离子标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）样本预处理，取出-80
°
c下保存的血液样本并解冻，采用4
°
c预冷的pbs清洗，加入ddh2o后进行匀浆，涡旋，再加入体积之比为1：1的甲醇和乙腈混合溶液，涡旋，超声破碎，再放置-20
°
c下孵育后，4
°
c下离心，将上清真空冷冻干燥，将冻干粉置于-80
°
c下备用；（2）lc-ms/ms质谱分析，将步骤（1）中的冻干粉采用体积之比为1：1的乙腈和水混合溶液复溶后采用超高效液相色谱进行分离，然后采用电喷雾电离质谱进行检测得到质谱数据；（3）分子产物鉴定，待步骤（2）中检测完毕后，通过质谱仪鉴定分子产物，同时，采集样本的一级谱图和二级谱图，经proteowizard将质谱数据转换成.mzxml格式，然后采用lc-ms spectra annotation软件进行峰对齐、保留时间校正以及峰面积的提取；采用精确质量数匹配<25 ppm和二级谱图匹配的方式对小分子的结构进行鉴定；（4）显著性差异的阳离子筛选，采用opls-da模型对步骤（3）中的分子产物进行初筛，以vip>1为筛选标准，初步筛选出各分组之间的差异分子，然后，对初筛得到的差异分子再次筛选，筛选出具有显著性差异的分子即为胰腺癌阳离子标志物。2. 根据权利要求1所述的胰腺癌阳离子标志物的筛选方法，其特征在于，步骤（2）中，所述超高效液相色谱的参数设置为：柱温为25
°
c，流速为0.3 ml/min，上样量为2 μl；流动相由流动相a和流动相b组成，其中，流动相a为含有25 mm乙酸铵和25 mm氨水的水溶液，流动相b为纯乙腈；样品采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为，0～0.5 min，95% b；0.5～7min，95%b～65%b；7～8 min，65%b～50%b；8～9 min，50%b；9～9.1 min，50%b～95%b；9.1～12 min，95%b。3. 根据权利要求1所述的胰腺癌阳离子标志物的筛选方法，其特征在于，步骤（2）中，所述电喷雾电离质谱在正离子模式下进行检测，电喷雾电离质谱的参数设置为：干燥气体流速为16 l/min，气体温度为250
°
c；鞘气温度为500
°
c，鞘气流速为12 l/min，喷雾器为20 psig，升压电容正极为3000 v，nozzle电压为175 v，相对分子质量范围为50～1200 da，数据采速率为4 hz，每个循环的时间为50ms。4. 根据权利要求1所述的胰腺癌阳离子标志物的筛选方法，其特征在于，步骤（3）中，所述质谱仪的参数设置为：离子源气体1为50，离子源气体2为80，离子源温度为650
°
c，气帘气为30，离子喷雾电压
±
5000 v，正离子模式；二级质谱采用高灵敏度模式进行采集，分布势能为
±
60 v，正离子模式，碰撞能量为35
±
15 ev；ida的排除同位素参数设置为4da，每个周期要监测的候选离子为10；采集数据按照质核比范围进行分段，其中，质核比范围分别为50～300m/z，290～600 m/z，590～900 m/z，890～1200 m/z。5. 根据权利要求1所述的胰腺癌阳离子标志物的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中，再次筛选的依据为：选择同时具有多维统计分析vip>1、fold change>2或<0.5认为胰腺癌血液和正常胰腺血液之间分子含量存在显著倍数差异，并且单维度t检验统计分析p value < 0.05的分子，作为具有显著性差异的分子阳离子。6. 根据权利要求1所述的胰腺癌阳离子标志物的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中，所述显著性差异的分子为trimethylamine n-oxide、cytosine、sphingomyelin和thymine。7. 一种如权利要求1～6任一项所述的胰腺癌阳离子标志物在制备胰腺癌诊断试剂盒中的应用，所述胰腺癌阳离子标志物为trimethylamine n-oxide、cytosine、
sphingomyelin和thymine。8. 根据权利要求7所述的胰腺癌阳离子标志物在制备胰腺癌诊断试剂盒或诊断药物中的应用，其特征在于，所述试剂盒中包括特异性检测trimethylamine n-oxide、cytosine、sphingomyelin和thymine的试剂。9.根据权利要求7所述的胰腺癌阳离子标志物在制备胰腺癌诊断试剂盒或诊断药物中的应用，其特征在于，采用spss分别绘制trimethylamine n-oxide、cytosine、sphingomyelin和thymine的roc曲线，其中，所述trimethylamine n-oxide含量的分界点为36193.8725，所述cytosine含量的分界点为11034.6325，所述sphingomyelin含量的分界点为10272.1588，所述thymine含量的分界点为18474.0571。

技术总结
本发明涉及胰腺癌领域，尤其是涉及一种胰腺癌阳离子标志物的筛选方法及其应用。一种胰腺癌阳离子标志物的筛选方法，包括如下步骤：取出血液样本并解冻，清洗，匀浆，涡旋，超声破碎，孵育，离心，将上清冷冻干燥、备用；将上述冻干粉复溶后采用液相色谱分离，再用电喷雾电离质谱检测；通过质谱仪鉴定分子产物并采集样本的一级谱图和二级谱图；采用OPLS-DA模型初筛，然后，再次筛选出具有显著性差异的分子。本发明采用LC-MS/MS质谱分析方法检测，通过液相色谱串联质谱分析后，在阳离子检测中筛选出具有显著性差异的分子产物。具有显著性差异的分子产物阳离子可以作为检测胰腺癌的新的标志物。产物阳离子可以作为检测胰腺癌的新的标志物。产物阳离子可以作为检测胰腺癌的新的标志物。


技术研发人员：张嘉程 郭文治 陈阔 陈亚斌
受保护的技术使用者：郑州大学第一附属医院
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/9/6