一种细胞内溶物与细胞因子组合物及体外高效扩增NK细胞的方法与流程

一种细胞内溶物与细胞因子组合物及体外高效扩增nk细胞的方法
技术领域
1.本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种细胞内溶物与细胞因子组合物及体外高效扩增nk细胞的方法。


背景技术：

2.研究表明自然杀伤(natural killer，nk)细胞能诱导有效的抗肿瘤、抗感染免疫反应，无需预先刺激，通过使用穿孔素和颗粒酶以及其它机制，无mhc限制性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞。异体nk细胞移植几乎不会导致移植物抗宿主病和细胞因子风暴，有望成为一种“现货型”的产品。临床结果显示，nk疗法治疗复发或难治性非霍奇金淋巴瘤患者，大多数产生了临床缓解，且未出现主要的毒性作用。
3.但是限制其临床应用的瓶颈之一为nk细胞在体外大量扩增较难。k562细胞或者工程化改造k562细胞可激活及扩增nk细胞，目前主要工艺为将k562细胞或者工程化改造k562细胞辐照处理，作为饲养层细胞与外周血单个核细胞共培养，培养后的终产品具有引入外源细胞的潜在风险，安全性较低。
4.细胞因子在调节nk细胞活性中起重要作用。其中il-2、il-12、il-15、il-18、il-21是nk细胞增殖和促进其分化成熟、发挥细胞毒性的重要调节因子，在体外培养中可以刺激nk细胞的增殖和活性。但因子法培养获得的nk细胞纯度偏低。
5.利用k562作为饲养层细胞制成的扩增nk细胞试剂盒产品对存储条件要求高，需要液氮存储，而本发明制成的试剂盒产品不需要液氮存储，-20℃以下冰箱存储就可以。
6.现有技术中暂未发现k562细胞内溶物及其作用的报道。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明提供了一种细胞内溶物与细胞因子组合物及体外高效扩增nk细胞的方法。
8.本发明首次发现利用细胞内容物与细胞因子组合物用于体外扩增nk细胞，可以获得大量高纯度nk细胞，并且有效避免了k562作为饲养层细胞时，容易造成k562细胞残留风险，本发明提供的方法具有良好的安全性。
9.本发明提供的细胞内容物与细胞因子组合物用于扩增nk细胞，容易制成商品化试剂盒，不需要液氮存储，利于市场推广应用。
10.本发明的技术方案如下：
11.一种细胞内溶物与细胞因子的组合物，所述组合物组分包括：细胞内溶物、细胞因子；所述细胞内溶物为k562细胞内溶物；所述细胞因子为：il15和il21。
12.根据本发明优选的，所述细胞因子il15和il21组成质量比例为(0.8～1.2):1。
13.根据本发明优选的，所述组合物中细胞内溶物的蛋白浓度为1～5mg/ml、细胞因子的浓度为30～100ug/ml。
14.上述细胞内溶物的制备方法，包括如下步骤：
15.(1)将k562细胞进行裂解，然后离心，获得上清液；
16.(2)将步骤(1)获得的上清液进行3kd～10kd超滤，将超滤得到的物质利用磷酸缓冲溶液重悬，再进行3kd～10kd超滤，重复1次以上，超滤得到的物质为细胞内溶物。
17.根据本发明优选的，步骤(1)中，将k562细胞与裂解液混合进行裂解，然后离心10000r/min～12000r/min，10～15min，获得上清液。
18.进一步优选的，将k562细胞与裂解液混合，低温条件下进行裂解。
19.更优选的，将k562细胞与裂解液混合，在冰浴条件下进行裂解3-5min中。
20.进一步优选的，裂解液的成分组成：50mm tris，150mm nacl，质量分数1％ triton x-100，质量分数1％ sds。
21.裂解液为常规市售产品。
22.根据本发明优选的，步骤(2)中，超滤是利用10kd超滤管。
23.进一步优选的，超滤是利用10kd超滤管，离心，4000g，1～2min。
24.根据本发明优选的，步骤(2)中，重复1-2次。
25.根据本发明优选的，步骤(2)中，得到的细胞内溶物利用1xpbs溶液溶解，制备成不同浓度细胞内溶物溶液。
26.上述细胞内溶物与细胞因子组合物的制备方法，包括如下步骤：
27.①
将细胞因子il15和il21使用1xpbs溶解配置母液；
28.②
取步骤
①
配置的母液与细胞内溶物混合制得组合物。
29.根据本发明优选的，步骤
②
中，细胞内溶物是由上述方法制备。
30.根据本发明优选的，步骤
②
中，制得组合物中细胞因子的浓度为30～100ug/ml，细胞内溶物的蛋白浓度为1～5mg/ml。
31.一种用制备nk细胞的试剂盒，包括上述细胞内容物。
32.根据本发明优选的，所述试剂盒，包括上述组合物。
33.上述组合物在制备nk细胞中的应用。
34.一种制备nk细胞的方法，包括如下步骤：
35.将细胞因子il2溶解于无血清培养基中，使il2浓度为100～1000iu/ml，将外周血单个核细胞接种于含有il2的无血清培养基中，接种后使培养基中的细胞密度为(1～3)
×
106个/ml，并加入上述组合物，或加入上述细胞内溶物+细胞因子il15+il21，使培养基中细胞因子终浓度为30～100ng/ml，细胞内溶物的蛋白终浓度为3～5ug/ml，添加体积分数5％～10％细胞培养添加物或血浆，每2～3天补充含有il2的无血清培养基和体积分数2.5～10％细胞培养添加物或血浆，保持补液后细胞密度为(0.8～1)
×
106个/ml，继续培养至收获nk细胞。
36.根据本发明优选的，添加血浆为自体血浆。
37.根据本发明优选的，无血清培养基为gt-t551 h3培养基。
38.根据本发明优选的，培养至第14～21天，收获nk细胞。
39.根据本发明优选的，所述细胞因子il15和il21组成质量比例为(0.8～1.2):1。
40.上述方法中的细胞培养添加物为常规市售产品。
41.有益效果
42.本发明首次发现利用k562细胞内溶物与细胞因子il15和il21组合用于体外扩增nk细胞，可以获得大量高纯度nk细胞，并且有效避免了k562作为饲养层细胞时，容易造成k562细胞残留风险，本发明提供的方法具有良好的安全性。
43.本发明提供的细胞内容物与细胞因子组合物用于扩增nk细胞，容易制成商品化试剂盒，不需要液氮存储，利于市场推广应用。
附图说明
44.图1是实施例5、实施例6、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4流式检测nk细胞占比(cd3-cd56
+
)的结果图。
45.图2是实施例5、实施例6与对比例1、对比例2、对比例3、对比例4倒置显微镜nk细胞观察40x结果图。
46.图3是实施例5、实施例6与对比例1、对比例2、对比例3、对比例4nk扩增倍数的柱状图。
47.图4是实施例5、实施例6与对比例1、对比例2、对比例3、对比例4体外杀伤k562效果图。
具体实施方式
48.下面结合实施例对本发明的内容作进一步阐述，但本发明的保护内容并不局限于此。
49.实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
50.主要材料的来源
51.k562细胞购买于武汉普诺赛生命科技有限公司。
52.细胞因子il12、il15、il21购买于苏州近岸蛋白科技股份有限公司。
[0053]1×
pbs购买于corning。
[0054]
裂解液购买于碧云天生物技术。
[0055]
gt-t551 h3培养基购买于takara。
[0056]
细胞培养添加物购买于达科为生物技术股份有限公司。
[0057]
乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒购买于碧云天生物技术。
[0058]
外周血单个核细胞(pbmc)可以制备也可以用常规市售产品。
[0059]
实施例1
[0060]
k562细胞内溶物的制备方法，包括如下步骤：
[0061]
(1)将1
×
106个k562细胞置于1.5ml无菌离心管中，离心，600g，10min，弃上清，用冰浴的1
×
pbs清洗两遍，加入200ul已过滤除菌的裂解液，混匀置于冰上5min；
[0062]
(2)冰浴结束后，离心管放于4℃离心机中，离心，12000r/min，15min，将上清液转移到无菌离心管中；
[0063]
(3)将上述获得的上清液置于10kd超滤管中，离心，4000g，2min，上层离心管得到的超滤物质中加入1ml 1
×
pbs混匀，离心，4000g，2min，重复2次，然后将上层离心管得到的超滤物质作为细胞内溶物，加入0.2ml 1
×
pbs溶液混匀制得细胞内溶物溶液备用。
[0064]
实施例2
[0065]
蛋白含量检测
[0066]
(1)根据bca蛋白浓度测定试剂盒说明书配置标准品，检测实施例1制备的细胞内溶物溶液，562nm波长检测读值。
[0067]
(2)绘制标准曲线，计算蛋白含量；本发明实施例1制备的细胞内溶物溶液的蛋白含量为10mg/ml。
[0068]
实施例3
[0069]
一种细胞内溶物与细胞因子的组合物的制备方法，包括如下步骤：
[0070]
(1)将细胞因子il15和il21，两种细胞因子组成的质量比例为1:1，使用1
×
pbs溶解配置母液浓度为100ug/ml的细胞因子溶液。
[0071]
(2)取一定体积步骤(1)的细胞因子溶液、一定体积的实施例1制备的细胞内溶物溶液与一定体积的1xpbs混匀，形成组合物，使组合物中细胞因子终浓度为30ug/ml、细胞内溶物的蛋白终浓度为5mg/ml，-20℃保存，备用。
[0072]
实施例4
[0073]
外周血单个核细胞(pbmc)分离，包括如下步骤：
[0074]
(1)将30ml健康志愿者外周血置于含有15ml ficoll分离液的分离管中，离心，800g，20min。
[0075]
(2)离心结束后，吸取外周血单个核细胞至50ml无菌离心管中，使用质量分数0.9％nacl定容至45ml，离心，600g，10min，弃上清，得到外周血单个核细胞(pbmc)。
[0076]
实施例5
[0077]
细胞内溶物与细胞因子il15+il21组合物与pbmc共培养，扩增nk细胞，包括如下步骤：
[0078]
(1)将细胞因子il2溶解于无血清培养基中，使培养基中il2的浓度为200iu/ml，所述无血清培养基为gt-t551 h3培养基；
[0079]
(2)将实施例4分离的外周血单个核细胞悬浮于含有il2的无血清培养基中，细胞密度为2x106个/ml，并加入实施例3制备的组合物，使培养基中细胞因子终浓度为30ng/ml，细胞内溶物的蛋白终浓度为5ug/ml，并在培养基中添加体积分数10％细胞培养添加物，37℃，5％co2培养；
[0080]
(3)每2天补充含有il2的无血清培养基和体积分数5％的细胞培养添加物，保持补液后的细胞密度为1x106个/ml，继续培养至第14天，收获nk细胞，台酚蓝染色检测活细胞浓度，流式检测nk细胞纯度。
[0081]
实施例6
[0082]
与实施例5的不同之处在于，步骤(2)使用的组合物，细胞因子终浓度为100ng/ml，其他均相同。
[0083]
对比例1
[0084]
与实施例5的不同之处在于，步骤(2)使用的组合物，用细胞因子il15代替细胞因子il21，即不含有细胞因子il21，其他均相同。
[0085]
对比例2
[0086]
与实施例5的不同之处在于，步骤(2)使用的组合物，细胞内溶物的蛋白终浓度为2.5ug/ml，其他均相同。
[0087]
对比例3
[0088]
与实施例5的不同之处在于，步骤(2)使用的组合物中增加细胞因子il12，细胞因子il12与il15和il21组成的质量比为1:1:1，其他均相同。
[0089]
对比例4
[0090]
与实施例5的不同之处在于，将细胞内溶物更换为经辐照后的饲养层k562细胞，经辐照后的饲养层k562细胞与细胞因子il15+il21进行培养，饲养层k562细胞与pbmc数量比例关系为1:1，其他均相同。
[0091]
实验结果显示，实施例5及实施例6获得的nk细胞在纯度、生长状态、扩增倍数方面较对比例1-4均有优势，检测结果见图1、图2、图3，实施例5制备的nk细胞纯度为90.48％，扩增倍数432倍，实施例6制备的nk细胞纯度为91.27％，扩增倍数442倍；对比例4制备的nk细胞纯度86.77％，扩增倍数为340倍；实施例5和实施例6细胞生长活跃，增长速度快，细胞均质而透明，较其他对比例有更多细胞克隆团。
[0092]
本发明人在制备nk细胞时，还进行了不含有细胞内溶物只含有细胞因子il15+il21的比较，效果欠佳。
[0093]
效果例
[0094]
nk细胞体外杀伤血液瘤人慢性髓系白血病k562细胞，具体如下：
[0095]
以实施例5、实施例6、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4培养获得的nk细胞为效应细胞，k562为靶细胞，效靶比10:1条件下，按照乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒说明书进行操作，计算nk细胞杀伤力。
[0096]
实验结果显示，体外杀伤k562在效靶比10:1条件下实施例5达到66％，实施例6达到68.5％，均优于对比例1～4，对比例4的达到49.5％，见图4。
[0097]
本发明采用一种细胞内溶物与细胞因子组合可在体外高效扩增nk细胞，细胞生长活跃，增长速度快，细胞均质而透明，且具有更强的杀伤效果。

技术特征：
1.一种细胞内溶物与细胞因子的组合物，其特征在于，所述组合物组分包括：细胞内溶物、细胞因子；所述细胞内溶物为k562细胞内溶物；所述细胞因子为：il15和il21。2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述细胞因子il15和il21组成质量比例为(0.8～1.2):1；优选的，所述组合物中细胞内溶物的蛋白浓度为1～5mg/ml、细胞因子的浓度为30～100ug/ml。3.权利要求1中所述细胞内溶物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将k562细胞进行裂解，然后离心，获得上清液；(2)将步骤(1)获得的上清液进行3kd～10kd超滤，将超滤得到的物质利用磷酸缓冲溶液重悬，再进行3kd～10kd超滤，重复1次以上，超滤得到的物质为细胞内溶物。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将k562细胞与裂解液混合进行裂解，然后离心10000r/min～12000r/min，10～15min，获得上清液；优选的，将k562细胞与裂解液混合，低温条件下进行裂解；优选的，将k562细胞与裂解液混合，在冰浴条件下进行裂解3-5min中；优选的，裂解液的成分组成：50mm tris，150mm nacl，质量分数1％triton x-100，质量分数1％sds；步骤(2)中，超滤是利用10kd超滤管；优选的，超滤是利用10kd超滤管，离心，4000g，1～2min；优选的，步骤(2)中，重复1-2次；优选的，步骤(2)中，得到的细胞内溶物利用1xpbs溶液溶解，制备成不同浓度细胞内溶物溶液。5.权利要求1所述细胞内溶物与细胞因子组合物的制备方法，包括如下步骤：
①
将细胞因子il15和il21使用1xpbs溶解配置母液；
②
取步骤
①
配置的母液与细胞内溶物混合制得组合物。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤
②
中，细胞内溶物是由权利要求3所述的方法制备；优选的，步骤
②
中，制得组合物中细胞因子的浓度为30～100ug/ml，细胞内溶物的蛋白浓度为1～5mg/ml。7.一种用制备nk细胞的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1中所述的细胞内容物；优选的，所述试剂盒，包括权利要求1中所述的组合物。8.权利要求1所述组合物在制备nk细胞中的应用。9.一种制备nk细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：将细胞因子il2溶解于无血清培养基中，使il2浓度为100～1000iu/ml，将外周血单个核细胞接种于含有il2的无血清培养基中，接种后使培养基中的细胞密度为(1～3)
×
106个/ml，并加入权利要求1所述的组合物，或加入权利要求1中所述的细胞内溶物+细胞因子il15+il21，使培养基中细胞因子终浓度为30～100ng/ml，细胞内溶物的蛋白终浓度为3～5ug/ml，添加体积分数5％～10％细胞培养添加物或血浆，每2～3天补充含有il2的无血清培养基和体积分数2.5～10％细胞培养添加物或血浆，保持补液后细胞密度为(0.8～1)
×
106个/ml，继续培养至收获nk细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，添加血浆为自体血浆；优选的，无血清培养基为gt-t551 h3培养基；优选的，培养至第14～21天，收获nk细胞；优选的，所述细胞因子il15和il21组成质量比例为(0.8～1.2):1。

技术总结
本发明提供了一种细胞内溶物与细胞因子组合物及体外高效扩增NK细胞的方法，属于免疫学技术领域；提供一种细胞内溶物与细胞因子的组合物，所述组合物组分包括：细胞内溶物、细胞因子；所述细胞内溶物为K562细胞内溶物；所述细胞因子为：IL15和IL21；所述细胞内溶物与细胞因子组合物的制备方法，包括如下步骤：将细胞因子IL15和IL21使用1XPBS溶解配置母液，取配置的母液与上述方法制备的细胞内溶物混合制得组合物；一种用制备NK细胞的试剂盒；所述组合物在制备NK细胞中的应用；本发明采用一种细胞内溶物与细胞因子组合在体外高效扩增NK细胞，细胞生长活跃，增长速度快，细胞均质而透明，且具有更强的杀伤效果。且具有更强的杀伤效果。且具有更强的杀伤效果。


技术研发人员：徐娟 曹启龙 梁少帅 张文茜 韩国英 况斐 黄伟 朱钰婷
受保护的技术使用者：青岛海尔生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/9/7