稳定表达T7聚合酶细胞系、轮状病毒反向遗传系统及其构建方法和应用

稳定表达t7聚合酶细胞系、轮状病毒反向遗传系统及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明涉及牛轮状病毒(bovine rotavirus)分离株以及稳定表达t7聚合酶细胞系，本发明进一步涉及以稳定表达t7聚合酶细胞系为基础所构建的轮状病毒反向遗传系统及其在拯救牛轮状病毒、稳定表达zsgreen的牛轮状病毒报告病毒、猴轮状病毒、猪轮状病毒或人轮状病毒等方面的应用，属于轮状病毒反向遗传系统及其构建和应用领域。


背景技术：

2.轮状病毒(rotavirus，rv)属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属成员；基因组为分节段双股rna，全基因组共分为11个基因节段；病毒粒子无囊膜，呈正二十面体，直径约75nm。rv是婴幼儿和幼龄动物腹泻的主要病原，在世界范围内广泛流行。据统计，全球每年约有59.2万名5岁以下儿童死于rv腹泻，大部分发生在发展中国家。在发达国家，rv引起的死亡数比发展中国家少，但是由此产生的公共卫生压力也是巨大的。对于畜牧业而言，家畜rv感染的危害主要体现在生长率的降低、一定比例的死亡以及治疗成本增加而导致的经济损失。
3.牛轮状病毒(bovine rotavirus，brv)是引起新生犊牛腹泻的最主要病原，其中g6和g10是brv流行的主要基因型。早在2007年，同属于多节段rna病毒的呼肠孤病毒(10基因节段)和环状病毒(10基因节段)均已建立完全基于质粒的反向遗传系统，而11基因节段的轮状病毒却不能建立完全基于质粒的反向遗传系统，当时建立了依赖辅助病毒的单质粒轮状病毒反向遗传系统，这大大限制了轮状病毒的研究进展。直到2017年，日本科学家建立了人轮状病毒sa11毒株完全基于质粒的反向遗传系统。但是，由于轮状病毒不同毒株其体外复制特性差别很大，因此完全参考sa11毒株的反向系统并不能建立brv的反向遗传操作系统。
4.病原流调表明，brv也是中国犊牛腹泻的主要病原，而且近五年的发生和流行有不断扩大的趋势，对养牛业的危害十分严重，接种疫苗是防控rv感染的有效方法。rv高效疫苗的成功研制取决于其复制特性、致病性、与宿主相互作用以及致病和免疫机制等方面的突破性研究，而反向遗传系统又是rv这些相关研究的重要技术手段。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一是提供两株牛轮状病毒分离株；
6.本发明的目的之二是提供基于稳定表达t7聚合酶的细胞系以及单细胞克隆株；
7.本发明的目的之三提供轮状病毒反向遗传系统及其构建方法；
8.本发明的目的之四将所构建的轮状病毒反向遗传系统应用于拯救牛轮状病毒、稳定表达zsgreen的牛轮状病毒报告病毒、猴轮状病毒、猪轮状病毒或人轮状病毒等方面。
9.本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
10.本发明的一方面是提供了两株从黑龙江某奶牛场新生犊牛的腹泻粪便中分离获得的两株牛轮状病毒分离株，分别命名为c7-3株和h26株，这两株病毒均可以在marc-145细
胞上产生rv特异性cpe，并能够稳定传代；电子显微镜观察结果显示，两株分离病毒的粒子形态呈球形、无囊膜，具有典型的轮状病毒粒子形态，直径约75nm；经vp7和vp4基因序列分析，确定其中一株为g6p[1]基因型，命名为c7-3，另一株为g10p[11]型，命名为h26；其中，c7-3株的全基因组序列由vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7、nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5这11个基因节段组成，这11个基因节段的核苷酸序列分别为seq id no.1-11所示；h26株的全基因组序列由vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7、nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5这11个基因节段组成，这11个基因节段的核苷酸序列分别为seq id no.12-22所示。
[0011]
本发明将所分离的牛轮状病毒g6型毒株c7-3提交到专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号是：cgmcc no.45380，其分类命名是：牛轮状病毒；保藏时间是：2022年12月26日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0012]
本发明的另一方面是提供了稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系，其微生物保藏编号是：cgmcc no.45342，其分类命名是：乳仓鼠肾细胞；保藏时间是：2022年12月26日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0013]
本发明利用逆转录病毒转导技术建立了稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系，并进行单克隆筛选；试验结果显示：采用抗t7 rna聚合酶单克隆抗体对bhk-21-t7细胞进行ifa检测，结果显示bhk-21-t7细胞呈现明显的荧光，而对照细胞bhk-21无荧光；同样采用抗t7 rna聚合酶单克隆抗体对bhk-21-t7细胞进行wb检测，结果显示bhk-21-t7细胞裂解产物在相应位置有明显条带，而对照细胞bhk-21的裂解产物无条带。上述检测结果表明，bhk-21-t7细胞可以稳定表达t7 rna聚合酶。
[0014]
本发明进一步应用带有t7启动子的荧光报告质粒转染bhk-21-t7细胞，采用流式细胞仪分选绿色荧光细胞进而进行单克隆分选，最终分选出4个单克隆细胞，分别为bhk-21-t7-g7、bhk-21-t7-b8、bhk-21-t7-d6和bhk-21-t7-c10；经ifa和wb检测，这4个单克隆细胞的t7表达量无明显差别。
[0015]
为了探究稳定表达t7 rna聚合酶细胞系bhk-21-t7与相应的单细胞克隆株b8、g7、c10和d6在rv拯救效率上的差异，将rv c7-3和h26株在不同的细胞上进行多孔次重复拯救病毒。结果显示，单细胞克隆株的拯救效率以及拯救病毒的滴度明显高于细胞系。试验结果表明，稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21-t7细胞系或单克隆细胞株的构建是rv高效反向遗传系统的关键。
[0016]
采用稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系为基础的体外rv拯救方法的建立是建立高效体外rv拯救系统的基础，因此，本发明所建立的稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系能够应用于拯救各种基因型的牛轮状病毒、稳定表达zsgreen的牛轮状病毒报告病毒、猴轮状病毒、猪轮状病毒或人轮状病毒等方面。
[0017]
相应的，本发明的另一方面是将构建的稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系应用于拯救各种基因型的牛轮状病毒、稳定表达zsgreen的牛轮状病毒报告病毒、猴轮状病毒、猪轮状病毒或人轮状病毒等，在以下各方面具有广泛的应用前景：(1)为牛轮状病毒的复制、致病性以及致病机制等基础研究提供了良好的试验平台；(2)提供构建表达荧光蛋白的报告病毒，可为病毒体内、体外复制动态研究提供可视化技术平台，为抗病毒药物筛选和
疫苗免疫评价提供模式病毒；(3)构建表达外源蛋白的重组病毒，可作为载体为病毒活载体疫苗的研究提供技术平台；(4)通过brv疫苗株blr反向遗传操作系统的构建，为基因重配多价疫苗的研制奠定基础；(5)广谱性rv反向遗传系统的构建为多种rv的拯救提供技术手段。
[0018]
作为参考，本发明提供了一种稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系在拯救牛轮状病毒c7-3株、h26株、疫苗株blr株，猪轮状病毒osu毒株或人轮状病毒ku毒株中的应用，包括：(1)分别构建牛轮状病毒c7-3株、h26、疫苗株blr株、猪轮状病毒osu毒株或人轮状病毒ku毒株的全基因组的vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7、nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5这11个基因节段的重组质粒；(2)将所述11个重组质粒采用转染试剂转染稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系，经过培养和鉴定，拯救得到相应的牛轮状病毒c7-3株(rc7-3)、h26(rh26)、疫苗株blr株(rblr)，猪轮状病毒osu毒株或人轮状病毒ku毒株。
[0019]
本发明仅需要构建牛轮状病毒c7-3株、h26株、疫苗株blr株，猪轮状病毒osu毒株或人轮状病毒ku毒株的全基因组的11质粒、不依赖辅助质粒即可实现高效拯救病毒，拯救效率达100％(现有技术的拯救效率仅为30％左右)。
[0020]
作为参考，本发明还提供了一种应用稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系拯救牛轮状病毒c7-3株的报告病毒、h26株的报告病毒或blr株的报告病毒的方法，包括：(1)分别构建牛轮状病毒c7-3株、h26或blr毒株的全基因组的vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7、nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5这11个基因节段的重组质粒；其中，在构建nsp3重组质粒时，将nsp3编码基因的orf末端添加p2a编码基因序列和zsgreen蛋白编码基因；(2)将11个重组质粒采用转染试剂转染稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系，经过培养和鉴定，得到拯救的牛轮状病毒c7-3株的报告病毒、h26株的报告病毒或blr株的报告病毒，分别命名为rc7-3/zs株、rh26/zs株或rblr/zs株。
[0021]
本发明将所拯救的牛轮状病毒c7-3株的报告病毒rc7-3/zs株提交到专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号是：cgmcc no.45379，其分类命名是：稳定表达zzgreen报告病毒；保藏时间是：2022年12月26日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0022]
为了验证本发明的拯救方法具有毒株广谱性，对猴轮状病毒sa11株、猪轮状病毒osu株和人轮状病毒ku株的全基因序列进行合成，采用与c7-3、h26和blr三株病毒质粒构建及病毒拯救完全一致的方法和策略，对猴轮状病毒sa11株、猪轮状病毒osu株和人轮状病毒ku株进行拯救及鉴定。试验结果显示，猴轮状病毒sa11株、猪轮状病毒osu株和人轮状病毒ku株的转染当代细胞培养物接种marc-145细胞第一代即可见明显的轮状病毒特征性细胞病变，拯救的病毒命名为rsa11、rosu和rku，将rsa11、rosu和rku三株病毒在marc-145细胞上传至f10代，经rt-pcr测序验证拯救病毒的分子特征与亲本病毒一致；这些结果表明，本发明的病毒拯救方法可用于rv的不同毒株，具有毒株广谱性。
[0023]
本发明在分离获得g6和g10型brv并测定两株病毒全基因序列的基础上，同时应用高效稳定表达t7聚合酶的bhk-21细胞进行转染，进而建立了g6型brv c7-3株和g10型brv h26株的反向遗传操作系统。在此基础上，同时建立了brv疫苗株blr的反向遗传操作系统。用此反向遗传系统，构建并拯救了表达zsgreen的报告病毒rc7-3/zs、rh26/zs和rblr/zs。应用本发明构建的brv病毒拯救系统对猴轮状病毒sa11株、猪轮状病毒osu株和人轮状病毒ku株进行拯救，均能够拯救相应病毒，表明本发明建立的rv反向遗传系统具有毒株广谱性。
附图说明
[0024]
图1为brv c7-3株病毒粒子的电子显微镜观察。
[0025]
图2为brv h26株病毒粒子的电子显微镜观察。
[0026]
图3为brv c7-3株vp7基因的遗传进化分析。
[0027]
图4为brv c7-3株vp4基因的遗传进化分析。
[0028]
图5为brv h26株vp7基因的遗传进化分析。
[0029]
图6为brv h26株vp4基因的遗传进化分析。
[0030]
图7为bhk-21-t7稳定表达细胞系ifa鉴定。
[0031]
图8为bhk-21-t7稳定表达细胞系wb鉴定。
[0032]
图9为病毒拯救过程模式图。
[0033]
图10为拯救病毒rh26、rc7-3和rblr的细胞病变与ifa。
[0034]
图11为h26拯救病毒(rh26)与亲本病毒(h26)分子标签鉴定。
[0035]
图12为c7-3拯救病毒(rc7-3)与亲本病毒(c7-3)分子标签鉴定。
[0036]
图13为blr拯救病毒(rblr)与亲本病毒(blr)分子标签鉴定。
[0037]
图14为nsp3报告质粒构建示意图。
[0038]
图15为rc7-3/zs、rh26/zs和rblr/zs细胞病变及接毒细胞的荧光图。
具体实施方式
[0039]
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0040]
实施例1brv分离株c7-3株和h26株的分离与鉴定
[0041]
1试验材料和方法
[0042]
1.1病料、细胞系病料为采自于黑龙江某奶牛场新生犊牛的腹泻粪便，marc-145细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊传染病研究创新团队保存。
[0043]
1.2主要试剂dmem basic(1x)购自sigma公司；gnenjetrnacleanup and concentration micro kit购自thermo scientific公司；axyoreptmbody fluid viral dna/rna miniprep kit和axyoreptmdna gel extraction kit 50-prep购自康宁生命科学；t
4 rna ligase buffer、t
4 rna ligase、atp、50％peg8000购自biolabs@inc.公司；rri购自takara公司。
[0044]
1.3病毒分离将病料样本与pbs按照1:3的比例漩涡混合，反复冻融3次，8000rpm离心8min，取上清用0.22μm滤器除菌后加入终浓度为50μg/ml的胰酶，37℃处理1h。培养48h的marc-145细胞pbs洗两遍，胰酶处理后的样品接种至marc-145细胞，37℃孵育1h。弃掉吸附液，加入含5μg/ml胰酶的无血清dmem维持液，置37℃5％ co2培养箱中培养，逐天观察，5d后收毒。按上述方法继续盲传，直到细胞病变(cpe)达到75％时收毒。
[0045]
1.4rt-pcr采用本发明人实验室建立的rt-pcr方法对分离的病毒进行检测，pcr产物经1％琼脂糖电泳鉴定。
[0046]
1.5间接免疫荧光取病毒液按照1.3中的接毒方法将病毒接种在铺满marc-145细
胞的96孔板中，设3个重复孔，并设阴阳性对照。加入维持液培养48h后，弃去维持液并用pbst洗涤3次。每孔加入预冷的95％无水乙醇200μl，室温固定20min，弃掉无水乙醇，自然风干。每孔加入1:100倍稀释的兔抗brv vp6蛋白的多克隆抗体。37℃孵育1h，pbst洗3遍，加入1:200倍稀释的fitc标记的山羊抗兔二抗，37℃孵育1h，弃去二抗，再用pbst洗涤3次，采用倒置荧光显微镜观察。
[0047]
1.6病毒粒子负染及电镜观察取细胞培养物上清，3000rpm离心20min，弃沉淀。上清12000rpm离心20min，磷钨酸负染后电镜观察。
[0048]
1.7序列测定与分析用trizol法提取病毒总rna，将锚定引物与单链rna连接。对连接产物进行提纯、变性，然后进行rt-pcr。以genbank数据库中已发表的brv全基因序列为参考，设计各个节段5’和3’末端序列的扩增引物(表1)，分别与5’、3’通用引物(5-15-1)进行pcr，对各个基因节段的末端片段进行扩增，pcr产物直接测序，以确定各个基因节段5’和3’末端的准确序列。其中，vp7、nsp2-nsp5等5个基因节段长度在1000bp左右或以下，因此通过5’和3’末端序列的扩增即可获得全长序列。而vp1-vp4、vp6和nsp1等6个基因节段长度均在1500bp以上，因此这些基因节段的中间序列还需要进一步扩增，所以以测得的这6个基因节段5’和3’末端的真实序列为模板，设计vp1-vp4、vp6和nsp1基因节段中间片段的扩增引物(表2)，进行扩增后pcr产物直接测序，以确定这6个基因节段中间片段的准确序列。
[0049]
表1rt-pcr扩增引物
[0050][0051][0052]
表2vp1-vp4、vp6和nsp1基因节段中间片段的扩增引物
dna聚合酶1μl，ddh2o10μl，共25μl；pcr反应程序为95℃5min，95℃30s,55℃30s,72℃1min,30个循环；72℃10min。pcr产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测分析，回收纯化。
[0062]
1.3plvx-ires-puro-t7重组质粒构建plvx-ires-puro质粒经ecor i、not i双酶切后回收目的片段，参照in fusion说明书按适当的摩尔比例55℃连接15min后，转化感受态细胞dh5α，挑取单菌落经pcr鉴定为阳性克隆的菌种，进行测序分析。
[0063]
1.4重组慢病毒的包装转染前一天将hek239t细胞铺于细胞皿中，待细胞在5％co2的37℃细胞培养箱中，生长至80％-90％时进行转染。取一个ep管，在无血清opti-mem中按3:2:1比例分别加入重组质粒plvx-ires-puro-t7、辅助质粒pspax2和pmd2.0g，混匀，另取一个ep管，在无血清opti-mem中加入pei试剂，混匀，室温静置5min后，将两者混合，室温静置15min。弃去细胞培养液，更换新鲜无血清细胞培养液后将转染复合物逐滴加入细胞中，并置于5％co2的37℃细胞培养箱中继续培养72h。
[0064]
1.5重组慢病毒的收集分别收集48h、72h的细胞培养上清，收集的细胞上清液3 000r/min离心10min，去除细胞碎片，上清液用0.45过滤器过滤，滤液用超滤管进行浓缩。
[0065]
1.6嘌呤霉素(puro)的有效筛选工作浓度24孔板中以5～8
×
104cells/孔的密度接种bhk-21细胞，过夜培养，待细胞密度达70％
–
80％时，弃去孔内旧的细胞培养基，1
×
pbs洗涤2次，在培养过夜后的细胞中更换新鲜配制的筛选培养基，该筛选培养基为含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0、1、2.5、5、7.5、10μg/ml等)，在细胞培养箱中继续培养过夜。每个筛选浓度平行做3孔重复，未加药物的细胞作为阴性对照；连续培养7d，每隔2
–
3d更换新鲜筛选培养基；每天观察细胞形态、存活率，一周后，有效杀死所有细胞的puro最低浓度为7ug/ml，确定此浓度为puro抗性筛选bhk-21细胞最佳工作浓度。
[0066]
1.7稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞株的筛选将bhk-21细胞铺于培养皿中，待细胞密度约为60％-70％,弃去细胞培养液，用pbs洗细胞2次，将浓缩后的慢病毒与5ug/ml聚凝胺(polyberne)混合液加入细胞中，轻轻混匀。感染24h后，弃去细胞培养液，换成含有7ug/ml puro的新鲜10％dmem培养基，连续培养7d，每隔2
–
3d更换新鲜筛选培养基，对照组正常细胞应该100％死亡，处理组中存活的细胞为稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞。如此加压筛选4～5代后，获得的重组细胞系能在puro筛选培养基中稳定生长，命名为bhk-21-t7。
[0067]
1.8细胞系的间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay，ifa)鉴定将能够在puro培养基稳定贴壁生长的bhk-21-t7细胞系，铺于12孔细胞板，同时设bhk-21细胞系为阴性对照，16～18h后待细胞长满，以t7 rna聚合酶的单克隆抗体为一抗(1:500稀释)，羊抗鼠igg-fitc荧光抗体为二抗(1:1000稀释)，进行ifa，在荧光显微镜下观察。
[0068]
1.9细胞系的western blot(wb)鉴定将可在puro培养基稳定表达t7 rna聚合酶、贴壁生长的bhk-21-t7细胞系，铺于6孔细胞板，同时设bhk-21空白细胞为阴性对照，48h后待细胞长满，pbs清洗细胞2次，200ul/孔ip裂解液裂解细胞，冰上裂解1h，按比例加入5
×
sds上样缓冲液，100℃金属浴变性10min，随后利用12％sds-page进行电泳，并将蛋白转印至nc膜上(120v,1min)，然后将nc膜于5％的脱脂奶粉中室温封闭1h，以t7 rna聚合酶的单克隆抗体为一抗(1:1000)4℃孵育过夜，hrp标记的二抗(山羊抗小鼠，1:10000)室温孵育1h，用odyssey近红外激光成像系统扫描，观察结果。
[0069]
1.10稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21-t7细胞的单克隆分选将rv nsp3全长基因
和zsgreen表达基因串联后连接至t7启动子的下游，进而构建重组质粒，用该重组质粒转染bhk-21-t7细胞，采用流式细胞仪分选绿色荧光细胞，并进行单克隆筛选。
[0070]
2试验结果
[0071]
试验结果显示：采用抗t7 rna聚合酶单克隆抗体对bhk-21-t7细胞进行ifa检测，结果显示bhk-21-t7细胞呈现明显的荧光，而对照细胞bhk-21无荧光(图7)；同样采用抗t7 rna聚合酶单克隆抗体对bhk-21-t7细胞进行wb检测，结果显示bhk-21-t7细胞裂解产物在相应位置有明显条带，而对照细胞bhk-21的裂解产物无条带(图8)。上述检测结果表明，bhk-21-t7细胞可以稳定表达t7 rna聚合酶，将该稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21-t7细胞株提交到专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号是：cgmcc no.45342。
[0072]
本试验进一步用带有t7启动子的荧光报告质粒转染bhk-21-t7细胞，采用流式细胞仪分选绿色荧光细胞进而进行单克隆分选，最终分选出4个单克隆细胞，分别为bhk-21-t7-g7、bhk-21-t7-b8、bhk-21-t7-d6和bhk-21-t7-c10。经ifa和wb检测，4个单克隆细胞的t7表达量无明显差别。
[0073]
实施例3 c7-3毒株、h26毒株、blr毒株、osu毒株以及ku毒株的11个基因节段的重组质粒的构建和鉴定
[0074]
1试验材料和方法
[0075]
1.1病毒株、质粒及基因序列brv毒株c7-3、h26和blr，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离和保藏；质粒pt7/vp2sa11，购自addgene plasmid repository(https://www.addgene.org/takeshi_kobayashi)；猪轮状病毒osu株和人轮状病毒ku株的全基因核苷酸序列来源于genbank，osu株vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7、nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5 11个基因节段的genbank号分别为kj450842.1、kj450843.1、kj450844.1、kj450845.1、kj450846.1、kj450847.1、kj450848.1、kj450849.1、kj450850.1、kj450851.1、kj450852.1，ku株vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7、nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5 11个基因节段的genbank号分别为ab022765.1、ab022766.1、ab022767.1、ab714261.1、ab022768.1、d16343.1、ab022769.1、ab022770.1、ab022771.1、ab022772.1、ab022773.1。
[0076]
1.2引物的设计与合成引物均根据不同毒株各个基因节段5’和3’末端准确序列进行设计，每个上游引物的5’末端加上t7启动子序列，每个下游引物的5’末端加上t7终止子序列。
[0077]
1.3重组质粒的构建及病毒的拯救采用1.2设计合成的引物对每个毒株的各个基因节段进行扩增，对质粒pt7/vp2sa11进行酶切，以去除原有克隆的基因并线性化。采用infusion试剂盒对纯化的pcr产物和线性化质粒进行同源重组，进而构建重组质粒。每个毒株的nsp3编码基因的orf末端添加zsgreen蛋白编码基因，构建nsp3报告质粒。
[0078]
2试验结果
[0079]
试验结果显示：c7-3毒株的11个重组质粒分别命名为pt7/vp1c7-3、pt7/vp2c7-3、pt7/vp3c7-3、pt7/vp4c7-3、pt7/vp6c7-3、pt7/vp7c7-3、pt7/nsp1c7-3、pt7/nsp2c7-3、pt7/nsp3c7-3、pt7/nsp4c7-3和pt7/nsp5c7-3；h26毒株的11个重组质粒分别命名为pt7/vp1h26、pt7/vp2h26、pt7/vp3h26、pt7/vp4h26、pt7/vp6h26、pt7/vp7h26、pt7/nsp1h26、pt7/nsp2h26、pt7/nsp3h26、pt7/nsp4h26和pt7/nsp5h26；blr毒株的11个重组质粒分别命名为pt7/vp1blr、pt7/vp2blr、pt7/vp3blr、pt7/vp4blr、pt7/vp6blr、pt7/vp7blr、pt7/
nsp1blr、pt7/nsp2blr、pt7/nsp3blr、pt7/nsp4blr和pt7/nsp5blr；osu毒株的11个重组质粒分别命名为pt7/vp1osu、pt7/vp2osu、pt7/vp3osu、pt7/vp4osu、pt7/vp6osu、pt7/vp7osu、pt7/nsp1osu、pt7/nsp2osu、pt7/nsp3osu、pt7/nsp4osu和pt7/nsp5osu；ku毒株的11个重组质粒分别命名为pt7/vp1ku、pt7/vp2ku、pt7/vp3ku、pt7/vp4ku、pt7/vp6ku、pt7/vp7ku、pt7/nsp1ku、pt7/nsp2ku、pt7/nsp3ku、pt7/nsp4ku和pt7/nsp5ku。通过对每个重组质粒进行序列测定，确定所有质粒均构建成功。
[0080]
实施例4 brv c7-3、h26和blr株的反向遗传操作系统的构建及其应用
[0081]
1试验材料和方法
[0082]
1.1c7-3、h26和blr拯救病毒分子标签的引入为了鉴别拯救病毒和亲本病毒，对c7-3、h26和blr的其中一个基因进行定点突变，进而引入分子标签。对质粒pt7/nsp3c7-3的nsp3基因的334位核苷酸a突变为g，引入hindiii酶切位点，突变质粒命名为pt7/nsp3c7-3-ihindiii。对质粒pt7/vp4h26的vp4基因的1900位核苷酸t突变为c，引入scaii酶切位点，突变质粒命名为pt7/vp4h26-iscaii。对pt7/nsp3blr的nsp3基因的409位核苷酸a突变为g，消掉ecori酶切位点，突变质粒命名为pt7/nsp3blr-decori。
[0083]
1.2c7-3、h26和blr毒株亲本病毒的拯救将pt7/vp1c7-3、pt7/vp2c7-3、pt7/vp3c7-3、pt7/vp4c7-3、pt7/vp6c7-3、pt7/vp7c7-3、pt7/nsp1c7-3、pt7/nsp2c7-3、pt7/nsp3c7-3-ihindiii、pt7/nsp4c7-3和pt7/nsp5c7-3 11个质粒混匀，将pt7/vp1h26、pt7/vp2h26、pt7/vp3h26、pt7/vp4h26-iscaii、pt7/vp6h26、pt7/vp7h26、pt7/nsp1h26、pt7/nsp2h26、pt7/nsp3h26、pt7/nsp4h26和pt7/nsp5h26 11个质粒混匀，将pt7/vp1blr、pt7/vp2blr、pt7/vp3blr、pt7/vp4blr、pt7/vp6blr、pt7/vp7blr、pt7/nsp1blr、pt7/nsp2blr、pt7/nsp3blr-decori、pt7/nsp4blr和pt7/nsp5blr 11个质粒混匀。采用lipo3000转染试剂分别将每个毒株的11个质粒共转染bhk-21-t7细胞，转染细胞培养2天，之后再将marc-145细胞加入细胞孔共培养2天，收获培养物在marc-145细胞上进行病毒的增殖。每个毒株的nsp3编码基因的orf末端添加zsgreen蛋白编码基因，构建nsp3报告质粒，拯救每个毒株时，将原始nsp3质粒替换为nsp3报告质粒，其他所有步骤同上，即可拯救每个毒株的报告病毒(图9)。
[0084]
1.3c7-3、h26和blr拯救病毒的鉴定转染当代的细胞培养物经冻融2次后，接种marc-145细胞，培养24-48h即可见轮状病毒特异性cpe(图10)，c7-3、h26和blr的拯救病毒分别命名为rc7-3、rh26和rblr，采用轮状病毒单克隆抗体进行ifa检测，可见rc7-3、rh26和rblr接种的细胞均具有特异性荧光(图10)。对h26野生病毒(h26)和拯救病毒(rh26)的vp4基因的1252bp-2321bp共1070bp的节段进行扩增，对pcr产物进行序列测定和scaii单酶切，结果显示野生病毒h26的1900位核苷酸为t，pcr产物单酶切后仍然为一条1070bp的条带，而拯救病毒rh26的1900位核苷酸为c，pcr产物单酶切后为648bp和422bp两条带(图11)，结果表明rh26为拯救病毒，而非野生病毒污染。对c7-3野生病毒(c7-3)和拯救病毒(rc7-3)的nsp3全基因进行扩增，对pcr产物进行序列测定和hindiii单酶切，结果显示亲本病毒c7-3的334位核苷酸为a，pcr产物单酶切后仍然为一条1074bp的条带，而拯救病毒rc7-3的334位核苷酸位g，pcr产物单酶切后为334bp和740bp两条带(图12)，结果表明rc7-3为拯救病毒，而非野毒株污染。对blr野生病毒(blr)和拯救病毒(rblr)的nsp3全基因进行扩增，对pcr产物进行序列测定和ecori单酶切，结果显示亲本病毒blr的409位核苷酸为a，pcr产物单酶切
后为409bp和665bp两条带，而拯救病毒rblr的409位核苷酸位g，单酶切后仍然为一条1074bp的条带(图13)，结果表明rblr为拯救病毒，而非野毒株污染。
[0085]
1.4c7-3、h26和blr表达绿色荧光蛋白zsgreen报告病毒的拯救及鉴定对c7-3、h26和blr毒株的nsp3质粒pt7/nsp3c7-3-ihindiii、pt7/nsp3h26和pt7/nsp3blr-decori进行改造，在orf的末端添加p2a编码基因序列和zsgreen绿色荧光蛋白编码基因序列，进而构建c7-3、h26和blr毒株nsp3基因表达绿色荧光蛋白的报告质粒(图14)，分别命名为pt7/nsp3c7-3-ihindiii/zs、pt7/nsp3h26/zs和pt7/nsp3blr-decori/zs。将每个毒株的nsp3质粒替换为报告质粒，按1.2方法进行转染和拯救病毒。
[0086]
2试验结果
[0087]
试验结果显示，转染当代的细胞培养物经冻融2次后，接种marc-145细胞，培养24-48h即可见轮状病毒特异性cpe(图15)，表达绿色荧光蛋白的c7-3、h26和blr报告病毒分别命名为rc7-3/zs、rh26/zs和rblr/zs。接种rc7-3/zs、rh26/zs和rblr/zs病毒的marc-145细胞在荧光显微镜下可见明显绿色荧光，而拯救病毒rc7-3、rh26和rblr接种的marc-145细胞在荧光显微镜下无荧光(图15)。与亲本病毒rc7-3、rh26和rblr相比，rc7-3/zs、rh26/zs和rblr/zs报告病毒的滴度均降低0.5-1个滴度，表明外源基因的插入对病毒的生长特性影响不大。既然rc7-3/zs、rh26/zs和rblr/zs三株病毒均能够稳定表达zsgreen蛋白，那么这三种病毒也能表达其他外源蛋白。因此，基于c7-3、h26和blr三株病毒的牛轮状病毒反向遗传系统的应用主要体现在：(1)可用于疫苗载体技术平台的建立，应用于病毒活载体疫苗的构建；(2)构建表达标识蛋白的报告病毒，可作为抗病毒药物筛选以及病毒中和试验的可视化模式病毒。
[0088]
实施例5猴轮状病毒sa11株、猪轮状病毒osu株和人轮状病毒ku株的拯救
[0089]
1试验方法
[0090]
为了验证本发明的拯救方法具有毒株广谱性，对猴轮状病毒sa11株、猪轮状病毒osu株和人轮状病毒ku株的全基因序列进行合成，采用与c7-3、h26和blr三株病毒质粒构建及病毒拯救完全一致的方法和策略，对猴轮状病毒sa11株、猪轮状病毒osu株和人轮状病毒ku株进行拯救及鉴定。
[0091]
2试验结果
[0092]
试验结果显示，猴轮状病毒sa11株、猪轮状病毒osu株和人轮状病毒ku株的转染当代细胞培养物接种marc-145细胞第一代即可见明显的轮状病毒特征性细胞病变，拯救的病毒命名为rsa11、rosu和rku，将rsa11、rosu和rku三株病毒在marc-145细胞上传至f10代，经rt-pcr测序验证拯救病毒的分子特征与亲本病毒一致。这些结果表明，本发明的病毒拯救方法可用于rv的不同毒株，具有毒株广谱性。
[0093]
实施例6bhk-21-t7细胞系与bhk-21-t7单细胞克隆株b8、g7、c10和d6拯救效率的差异
[0094]
1试验方法
[0095]
为了探究稳定表达t7 rna聚合酶细胞系bhk-21-t7与相应的单细胞克隆株b8、g7、c10和d6在rv拯救效率上的差异，将rv c7-3和h26株在不同的细胞上进行多孔次重复拯救病毒。
[0096]
2试验结果
[0097]
结果显示，单细胞克隆株的拯救效率以及拯救病毒的滴度明显高于细胞系(表3)。试验结果表明，稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21-t7细胞单克隆细胞株的构建是rv高效反向遗传系统的关键。
[0098]
表3稳定表达t7 rna聚合酶细胞系bhk-21-t7与相应的单细胞克隆株b8、g7、c10和d6在rv拯救效率比较
[0099]

技术特征：
1.牛轮状病毒(bovine rotavirus)分离株c7-3株，其特征在于，其微生物保藏编号是：cgmccno.45380。2.根据权利要求1所述的牛轮状病毒分离株c7-3株，其特征在于，其全基因组序列由vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7、nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5这11个基因节段组成，所述11个基因节段的核苷酸序列分别为seq id no.1-11所示。3.牛轮状病毒(bovine rotavirus)分离株h26株，其特征在于，其全基因组序列由vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7、nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5这11个基因节段组成，所述11个基因节段的核苷酸序列分别为seq id no.12-22所示。4.稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系，其特征在于，其微生物保藏编号是：cgmccno.45342。5.权利要求4所述的稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系在构建轮状病毒反向遗传系统中的应用；优选的，所述的轮状病毒包括各种基因型的牛轮状病毒、表达zsgreen的牛轮状病毒报告病毒、猴轮状病毒、猪轮状病毒或人轮状病毒。6.权利要求4所述的稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系在构建表达外源蛋白的重组病毒中的应用。7.权利要求4所述的稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系在拯救权利要求1所述牛轮状病毒分离株c7-3株或拯救权利要求2所述牛轮状病毒分离株h26株中的应用，其特征在于，包括：(1)分别构建牛轮状病毒分离株c7-3株或h26毒株的全基因组的vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7、nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5这11个基因节段的重组质粒；(2)将所述11个重组质粒采用转染试剂转染权利要求4所述的稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系，经过培养和鉴定，拯救得到牛轮状病毒分离株c7-3株或h26株。8.权利要求4所述的稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系在拯救牛轮状病毒疫苗株blr株、猪轮状病毒osu株或人轮状病毒ku株中的应用，其特征在于，包括：(1)构建blr株、osu株和ku株的全基因组的vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7、nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5这11个基因节段的重组质粒；(2)将所述11个重组质粒采用转染试剂转染权利要求4所述的稳定表达t7rna聚合酶的bhk-21细胞系，经过培养和鉴定，拯救得到牛轮状病毒疫苗株blr株、猪轮状病毒osu株或人轮状病毒ku。9.权利要求4所述的稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系在拯救权利要求1所述牛轮状病毒分离株c7-3株的报告病毒、权利要求2所述h26株的报告病毒或牛轮状病毒疫苗株blr株的报告病毒中的应用，包括：(1)分别构建牛轮状病毒分离株c7-3株、分离株h26株或疫苗株blr株的全基因组的vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7、nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5这11个基因节段的重组质粒；其中，在构建nsp3重组质粒时，将nsp3编码基因的orf末端添加p2a编码基因和zsgreen蛋白编码基因；(2)将11个重组质粒采用转染试剂转染权利要求4所述的稳定表达t7 rna聚合酶的bhk-21细胞系，经过培养和鉴定，拯救得到牛轮状病毒分离株c7-3株的报告病毒rc7-3/zs株、分离株h26株的报告病毒rh26/zs株或疫苗株blr株的报告病毒rblr/zs株。10.牛轮状病毒分离株c7-3株的报告病毒rc7-3/zs株，其特征在于，其微生物保藏编号是：cgmcc no.45379。

技术总结
本发明公开了稳定表达T7聚合酶细胞系、轮状病毒反向遗传系统及其构建方法和应用。本发明从新生犊牛腹泻粪便中分离获得两株牛轮状病毒分离株并进一步构建稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系，其微生物保藏编号是：CGMCC No.45342；在此基础上建立了轮状病毒的反向遗传操作系统并拯救了牛轮状病毒分离株、疫苗株BLR株以及表达ZsGreen的报告病毒株，仅需构建牛轮状病毒株的全基因组的11质粒、不依赖辅助质粒即高效拯救病毒，拯救效率达100％。本发明应用所构建反向遗传操作系统对猴轮状病毒株、猪轮状病毒株和人轮状病毒株进行拯救，均能拯救获得相应的病毒，表明本发明建立的轮状病毒反向遗传系统具有毒株广谱性。反向遗传系统具有毒株广谱性。反向遗传系统具有毒株广谱性。


技术研发人员：常继涛 尹鑫 姜志刚 齐瑛琳 王芳 孙超
受保护的技术使用者：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
技术研发日：2023.04.29
技术公布日：2023/9/7