一种金果榄多糖及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种金果榄多糖及其制备方法和应用。


背景技术：

2.金果榄，为防己科植物青牛胆(tinospora sagittata(oliv.)gagnep.)或金果榄(tinospora capillipes gagnep.)的干燥块根，具有清热解毒、利咽止痛之功效，常用于治疗咽喉肿痛、痈疽疔毒、脘腹疼痛等，为多版《中国药典》所收录。临床上用其治疗慢性咽炎、输液性静脉炎、外感发热等，民间多用其来治疗急慢性扁桃体炎、急性咽喉炎、口腔炎等，是复方党参片、泻停封胶囊、羚羊清肺颗粒等常用中成药的主要原料之一。
3.金果榄主要分布在我国秦岭至南岭山脉，以及越南北部的热带和亚热带森林等地，分布范围广，各地植株形态存在较大差异。金果榄中的主要成分有萜类、生物碱、植物甾醇、木脂素等，其中二萜类和生物碱类是研究最广泛的化学成分。到目前为止，从中已分离得到33种二萜类化合物、26种生物碱、9种甾体、其他含氮化合物以及脂肪酸等物质。
4.金果榄作为一种清热解毒的中药，在民间得到了广泛的应用，具有非常高的药用价值和医疗保健功效。然而，当前对于金果榄的研究主要集中在二萜类和生物碱类化合物，而对其他如多糖等成分研究甚少，关于金果榄多糖的研究仅仅停留在提取工艺优化和体外抗氧化活性等方面，未见有关其结构和抗肿瘤免疫活性相关研究报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种金果榄多糖及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明从金果榄中提取得到了一种葡聚糖，该葡聚糖具有治疗肝癌的作用。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种金果榄多糖，所述金果榄多糖是由α-d-葡萄糖组成的葡聚糖，具有1
→
连接的葡萄糖残基、1
→
4连接的葡萄糖残基和1
→
4，6连接葡萄糖残基的结构片段，其数量比为18∶72.3∶9.6；所述金果榄多糖的分子量为14.248kd。
8.本发明还提供一种上述的金果榄多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.(1)利用水提醇沉法对金果榄进行提取后，再经过除蛋白操作，得到粗多糖；
10.(2)所述粗多糖再经过阴离子交换柱层析纯化和凝胶柱层析纯化，得到所述金果榄多糖；
11.在步骤(1)中，所述水提醇沉法中的水提操作采用超声辅助提取。
12.进一步地，在步骤(1)中，所述水提操作的时间为30min，所述超声的频率为40khz。
13.进一步地，在步骤(1)中，所述水提醇沉法使用乙醇溶液进行醇沉处理，所述乙醇溶液的体积分数为85％。
14.进一步地，在步骤(2)中，所述阴离子交换柱层析纯化采用deae-52纤维素阴离子交换层析柱。
15.进一步地，在步骤(2)中，凝胶柱层析纯化采用葡聚糖凝胶g-100。
16.本发明还提供上述的金果榄多糖在制备治疗肝癌的药物中的应用。
17.进一步地，所述药物具有以下(1)-(4)中至少一项所述的作用：
18.(1)延长肝癌患者的生存期；
19.(2)延缓肝癌患者的体重下降；
20.(3)抑制肝癌患者的肝脏肿瘤生长；
21.(4)改善肝癌患者的肝脏功能损伤。
22.本发明还提供一种治疗肝癌的药物，活性成分包括上述的金果榄多糖。
23.进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
24.本发明公开了以下技术效果：
25.本发明采用超声辅助提取、水提醇沉的方法提取金果榄粗多糖，经sevag法去除蛋白后，通过deae-52纤维素树脂以及葡聚糖凝胶柱对粗多糖进行纯化，得到均一的α-葡聚糖tsp-w，采用现代分析技术对其结构进解析，并以akt/n-ros基因诱导的原发性肝癌小鼠为模型，对金果榄多糖的抗肿瘤免疫活性进行评价，结果发现，hpgpc显示，tsp-w分子量为14.248kd；hplc柱前衍生化分析其单糖组成，tsp-w中葡萄糖含量占比达99.99％；ft-ir光谱分析表明tsp-w中α-d-葡萄糖的存在，是一种新型葡聚糖；sem观察其微观结构主要为光滑的碎屑和棒状；采用甲基化分析鉴定出1
→
)连接葡萄糖残基、(1
→
4)连接葡萄糖残基、(1
→
4，6)连接的葡萄糖残基，比例为18∶72.3∶9.6。动物实验结果表明，tsp-w可减轻akt/n-ros基因诱导的原发性肝癌小鼠肝脏损伤，抑制肿瘤生长，延长患瘤小鼠的生存期。
26.本发明为进一步开发抗肝肿瘤免疫制剂提供借鉴，同时也为金果榄资源开发和抗肝癌治疗提供新思路。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1为金果榄粗多糖粉末；
29.图2为tsp组分deae-52阴离子层析洗脱图；
30.图3为tsp-1组分葡聚糖凝胶层析洗脱图(sephadex g-100)；
31.图4为tsp-2组分葡聚糖凝胶层析(sephadex g-100)；
32.图5为tsp-w化学成分含量测定中硫酸苯酚法测葡萄糖含量的标准曲线(a)和bca法测蛋白质含量的标准曲线(b)；
33.图6为tsp-w紫外光谱扫描曲线；
34.图7为tsp-w的高效凝胶渗透色谱图(a)和右旋糖酐标准品logmp-t校正曲线(b)；
35.图8为tsp-w的单糖组成分析；其中a为混合单糖标准品的pmp衍生化hplc色谱图，man：甘露糖；glcn：盐酸氨基葡萄糖；glca：葡萄糖醛酸；gala：半乳糖醛酸；glcnac：n-乙酰氨基葡萄糖；glc：葡萄糖；gal：半乳糖；ara：阿拉伯糖；fuc：岩藻糖；b为tsp-w样品pmp衍生化hplc色谱图；
36.图9为tsp-w的红外光谱图(扫描区间：400-4000cm-1
)；
37.图10为tsp-w总离子流图；
38.图11为tsp-w甲基化糖醇乙酰酯质谱图；其中a：1,5-di-o-acetyl-2,3,4,6-tetra-o-methyl glucitol；b：1,4,5-tri-o-acetyl-2,3,6-tri-o-methyl glucitol；c：1,4,5,6-tetra-o-acetyl-2,3-di-o-methyl glucitol；
39.图12为tsp-w在不同分辨率500
×
(a)、1000
×
(b)和3000
×
(c)条件下的扫描电镜图；
40.图13为tsp-w对肝癌小鼠的保护作用；其中a为各组小鼠的生存曲线；b为各组小鼠体重变化(n＝5)；
41.图14为tsp-w对小鼠肝功能的影响；其中，a为血清中ast水平；b为血清中alt水平；c为血清中ggt水平；与正常组n-pbs组相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01，
###
p《0.001；与模型组c-pbs组相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001(n＝4)；
42.图15为tsp-w对小鼠肝脏的影响；其中a为各组小鼠肝脏组织；b为各组小鼠肝组织he染色图。
具体实施方式
43.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
44.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
45.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
46.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
47.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
48.实施例1
49.一、材料和方法
50.1.实验材料
51.1.1药材与动物
52.金果榄来源于湖北省十堰市。
53.akt/n-ros基因诱导的原发性肝癌雄性c57bl/6小鼠(6周龄)购自武汉有度生物科技有限公司，雄性c57bl/6小鼠(18
±
2g)购于湖北医药学院动物实验中心，室内环境为23
±
2℃，相对湿度55
±
5％，12h交替日光照明。所有的动物实验操作方案均经湖北医药学院实验动物伦理审查委员会批准。
54.1.2试剂
55.表1试剂
[0056][0057][0058]
2.实验方法
[0059]
2.1金果榄多糖的提取
[0060]
(1)新鲜金果榄洗净，干燥后粉碎，过2号筛，得金果榄粗粉，烘干后备用。
[0061]
(2)取金果榄粉末580g，按料液比1∶10g/ml加入去离子水，在60℃以40khz超声提取30min，功率为250w，将提取液过滤、离心(3500r/min，10min)后收集上清并浓缩，滤渣重复提取一次，共两次。
[0062]
(3)向浓缩液中缓缓加入体积分数为85％的乙醇水溶液(3倍体积)，静置24h后离心，收集沉淀；上清经旋蒸去除酒精、浓缩后，再次加入体积分数为85％的乙醇水溶液进行醇沉。
[0063]
(4)合并两次收集的沉淀，复溶于适量温水中，得到金果榄粗多糖水溶液。
[0064]
(5)取等体积sevag试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)与金果榄粗多糖水溶液充分混合，搅拌30min后离心，弃下层溶剂和中间层蛋白质，收集上清。连续进行除蛋白操作，直至中间层无明显蛋白质。
[0065]
(6)将上清浓缩并进行冷冻干燥，得金果榄脱蛋白粗多糖粉末，将其放置于4℃冰箱中保存备用。
[0066]
2.2金果榄多糖的分离纯化
[0067]
2.2.1金果榄多糖阴离子交换柱层析纯化
[0068]
(1)填料预处理：
[0069]
①
取deae-52填料置于烧杯中，用2倍体积的0.5m氢氧化钠溶液浸泡30min，通过砂芯漏斗抽滤，取2倍体积的自来水重新浸泡填料，抽滤，反复多次，直到ph试纸检测为中性。
[0070]
②
取2倍体积的0.5m盐酸溶液浸泡30min，通过砂芯漏斗抽滤，用2倍体积的自来水
重新浸泡填料，抽滤，反复多次，直到ph试纸检测为中性。
[0071]
③
然后用2倍体积的蒸馏水浸泡填料抽滤，再次用2倍体积的蒸馏水浸泡，搅拌，转移至抽滤瓶内，间歇性摇晃抽滤瓶，负压抽真空15min，以除尽填料中的气泡(使用完毕后，可加入20％乙醇置于4度冰箱储存)。
[0072]
(2)纯化：将预处理的deae-52纤维素树脂湿法装柱至中压柱中(5.5cm
×
45cm)，打开恒流泵，用超纯水冲洗填料48h以平衡层析柱。调节恒流泵流速，使出样口流速稳定。称取5.0g金果榄脱蛋白粗多糖溶于50.0ml超纯水中，离心后取上清液进行上样。然后以1.0ml/min的流速依次用0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1.0mol/l的nacl溶液洗脱，并用自动收集器收集洗脱液(10.0ml/管)。从每管洗脱液中取30μl样品，采用苯酚-硫酸法(200μl 5％苯酚+800μl浓硫酸，90℃水浴加热10min)对洗脱液中的多糖含量进行示踪，以管数为横坐标，每管吸光度值为主纵坐标、洗脱液nacl浓度为次纵坐标，绘制金果榄多糖deae-52阴离子交换树脂洗脱曲线。根据洗脱曲线合并、收集、浓缩多糖组分，用截留分子量为3500da的透析袋透析48h，每间隔2h更换一次超纯水，样液冷冻干燥后称重，保存于4℃冰箱中保存备用。
[0073]
2.2.2金果榄多糖凝胶柱层析纯化
[0074]
称量“2.2”项下所得金果榄多糖粉末100.0mg溶于3.0ml超纯水中，将金果榄多糖溶液缓慢添加至凝胶柱中(2.5cm
×
100cm)。以超纯水为洗脱剂，自动收集器收集样品洗脱液。参数设置如下：流速1.0ml/min，收集洗脱液8.0ml/管，用苯酚-硫酸法对洗脱液中糖的含量示踪，并绘制金果榄多糖凝胶柱层析洗脱曲线。根据曲线中的洗脱峰收集洗脱液，进行真空冷冻干燥，得到纯化的金果榄多糖粉末。
[0075]
2.3金果榄多糖的成分分析
[0076]
2.3.1采用硫酸-苯酚法检测纯化金果榄多糖的总糖含量。
[0077]
2.3.2采用bca蛋白浓度测定试剂盒检测纯化金果榄多糖的蛋白含量。
[0078]
2.4金果榄多糖的结构表征
[0079]
2.4.1纯化金果榄多糖紫外光谱分析
[0080]
称量10.0mg多糖样品溶解于超纯水中，配置溶液浓度为1.0mg/ml。用紫外可见分光光度计在200～800nm范围内扫描样品的紫外光谱。
[0081]
2.4.2采用hpgpc法对纯化金果榄多糖进行分子量测定
[0082]
色谱方法：采用hpgpc法，利用waters高效液相色谱仪，将3根聚合物基质水溶性sec(gfc)色谱柱(8mm
×
300mm)串联，检测器：waters示差检测器；流动相：0.05m nacl溶液；流速：0.65ml/min；控制柱温在40℃；进样量为30μl。
[0083]
2.4.3纯化金果榄多糖的单糖组成分析
[0084]
使用hplc-pmp柱前衍生化的方法检测tsp-w样品中单糖组成情况。
[0085]
采用thermor uitimate 3000液相色谱系统进行分析。色谱条件∶色谱柱c18(4.6mm
×
250mm，5μm)；柱温25℃；检测波长250nm；流动相为乙腈(a)和磷酸盐缓冲液(kh2po4，0.05mol/l，ph 6.9，b)按等度洗脱a∶b＝19∶81；流速1.0ml/min；进样体积10μl。
[0086]
2.4.4红外光谱扫描分析
[0087]
精密称取样品2.0mg置于傅里叶变换红外光谱仪ft-ir nicolet is5上进行扫描记录，扫描次数32次。
[0088]
2.4.5扫描电镜分析
γ含量进行检测。
[0110]
2.6统计分析
[0111]
实验数据采用软件graphpad prism 8.0和spss statistics 26进行分析，结果用mean
±
sd表示，组间统计用one-wayanova，以p是否小于0.05来评判有无统计学意义，p《0.05记为*，p《0.01记为**，p《0.001记为***，每组实验均至少重复3次。
[0112]
二、结果
[0113]
1.金果榄多糖的提取
[0114]
金果榄经超声提取、体积分数85％的乙醇两次沉淀、温水复溶、sevag脱蛋白处理后进行冷冻干燥，得到25.2g黄褐色的金果榄粗多糖(tsp)冻干粉末(如图1)。
[0115]
2.金果榄粗多糖的纯化
[0116]
本发明先采用deae-52纤维素阴离子交换柱层析法对金果榄粗多糖进行纯化。如图2所示，tsp经过8个不同浓度的氯化钠溶液洗脱，采用硫酸苯酚法在0m和0.2m nacl溶液处检测到2个洗脱峰，分别命名为tsp-1和tsp-2。将tsp-1和tsp-2组分收集、浓缩、冻干后，共得到tsp-1粉末6.69g，tsp-2粉末0.83g。多糖tsp-1组分呈白色，略显光泽感，tsp-2为淡黄色，色素明显减少。
[0117]
第二步是通过葡聚糖凝胶g-100进行纯化，以去离子水为洗脱液。结果如图3所示，硫酸-苯酚法检测到tsp-1组分纯化出1个洗脱峰，收集组分，命名为tsp-w；tsp-2洗脱出3个洗脱峰(图4)，分别命名为tsp-2-1、tsp-2-2和tsp-2-3，但由于在本实验中tsp-2-1、tsp-2-2和tsp-2-3的得率较低，因此，本发明后续研究主要针对金果榄多糖去离子水洗脱组分tsp-w展开。
[0118]
3.金果榄多糖tsp-w的理化性质
[0119]
3.1金果榄多糖tsp-w的总糖含量及蛋白质含量测定
[0120]
采用硫酸-苯酚法测定葡萄糖含量的标准曲线如图5中a所示，回归方程为y＝0.0091x+0.0076，r2＝0.999，表明葡萄糖在0～200mg/ml范围内与吸光度值线性关系良好，其中x为葡萄糖溶液浓度，y为吸光度值。以该标准曲线测得tsp-w总糖含量为97.05
±
0.02％。
[0121]
采用bca法测定蛋白质含量的标准曲线如图5中b所示，回归方程为y＝0.2714x+0.1057，r2＝0.9891，表明蛋白质含量在0～0.5μg/μl范围内与吸光度值线性关系良好，其中x为标准蛋白溶液浓度，y为吸光度值。以该标准曲线测得tsp-w蛋白含量为3.66
±
0.02％。
[0122]
3.2金果榄多糖tsp-w的紫外光谱分析
[0123]
实验中使用紫外可见光对tsp-w样品在200-800nm范围内进行波长扫描，如图6所示，在蛋白质和核酸的特征吸收区域，即280nm和260nm处无特征吸收峰，说明纯化的tsp-w样品多糖不含或含极少量的蛋白和核酸。
[0124]
3.3金果榄多糖tsp-w的分子量测定
[0125]
根据hpgpc测定结果可知，在tsp-w中检测到一个单一对称洗脱峰(图7)，51.254min处为流动相盐峰，表明纯化效果良好，且纯化后tsp-w的分子量均一。以标准品右旋糖苷相对分子质量mp(峰位分子量)的对数值为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间(time)为横坐标进行线性回归，得到logmp-t校正曲线，校正曲线方程：logmp＝-0.0004t3+
0.0500t
2-2.1475t+36.9321，r2＝0.9997，tsp-w保留时间为43.613min，分子量mw＝14.248kd，其他参数包括平均分子量(mn)、峰分子量(mp)、多分散性(pd)如表3所示。
[0126]
表3 tsp-w分子量测定结果
[0127][0128]
3.4金果榄多糖tsp-w的单糖组成分析
[0129]
本实验中使用hplc-pmp柱前衍生化的方法检测tsp-w样品中单糖组成情况。实验中用甘露糖、盐酸氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、n-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖共计七种单糖以及两种糖醛酸作为标准物质，分别单独测定其保留时间，以及上述九个单糖按等体积混合作为混标测定各单糖的保留时间。图8中a为标准单糖保留时间分布，保留时间由短到长分别为甘露糖、盐酸氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、半乳糖醛酸、n-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖，各单糖组分保留时间依次为8.443min，9.430min，10.350min，11.200min，13.310min，14.177min，15.457min，16.809min，19.180min，以此作为参照测定样品中单糖组成。如图8中b所示，tsp-w样品中仅显示出现一个单糖组分，保留时间为14.260min，为葡萄糖，表明tsp-w是由葡萄糖组成的葡聚糖。
[0130]
3.5金果榄多糖tsp-w的红外光谱扫描分析
[0131]
多糖组分tsp-w的红外分析结果如图9所示，具体分析如下，在3600-3200cm-1
区域的吸收带是糖类的特征峰，3301.67cm-1
为-oh的伸缩振动吸收峰。2925.02cm-1
归属于c-h伸缩振动。1645.74cm-1
的吸收峰可能归属于结晶水。1361.78cm-1
处吸收峰归属于c＝o的对称伸缩振动。1077.58cm-1
处吸收峰是由吡喃环内酯和-oh产生，是葡聚糖典型的红外光谱信号。1148.33cm-1
左右的峰值表明tsp-w中有吡喃糖环。1018cm-1
处吸收峰归属于o-h的变角振动。929.10cm-1
和847.31cm-1
处的吸收可能是由于d-葡聚糖的α-异头碳中的c-h变角振动。因此，ft-ir光谱结果以及糖成分分析表明tsp-w中α-d-葡萄糖的存在。
[0132]
3.6金果榄多糖tsp-w的甲基化分析
[0133]
为了进一步阐明该金果榄多糖中单糖的连接方式，随后进行了甲基化实验，用甲氧基来取代多糖中的游离羟基，构建一个完全甲基化的衍生物。经过gc-ms分析，总离子流图见图10，tsp-w甲基化后共有a、b和c三种甲基化糖醇乙酰脂产物，保留时间依次为8.592min，17.89min和13.72min；分子量分别为351、323和379da，各自对应的质谱图见图11。根据数据库比对判断tsp-w的三种部分甲基化糖醇乙酰脂分别为(图11中a)：1,5-di-o-acetyl-2,3,4,6-tetra-o-methyl glucitol，(图11中b)：1,4,5-tri-o-acetyl-2,3,6-tri-o-methyl glucitol和(图11中c)：1,4,5,6-tetra-o-acetyl-2,3-di-o-methyl glucitol。甲基化分析结果表明分别对应1
→
)连接的葡萄糖残基、(1
→
4)连接的葡萄糖残基和(1
→
4、6)连接的葡萄糖基残基，比例为18.027∶72.373∶9.600∶9.6。推测tsp-w可能具有以1
→
连接的葡萄糖残基和1
→
4连接的葡萄糖残基作为1
→
4，6连接葡萄糖残基的o-6位末端取代的主链结构。
[0134]
3.7金果榄多糖tsp-w的扫描电镜
[0135]
在多糖结构分析中，sem技术可展示样品的表面形貌特征，用于比较不同样品之间的结构差异，图12展示了tsp-w在放大倍数为
×
500、
×
1000和
×
3000下的微观结构。从图中可以清晰地观察到多糖tsp为无定形态，结构不规则，在不同的放大倍数下出现了“薄片”“碎屑”和“条状”等形貌，表面光滑、具小孔洞，说明分子间力小，可能促进tsp-w松散结构的形成。
[0136]
4.金果榄多糖tsp-w的抗肿瘤免疫活性研究
[0137]
4.1金果榄多糖tsp-w对肝癌小鼠总体生成率和体重的影响
[0138]
本发明以akt/n-ros基因诱导的原发性肝癌小鼠为模型，探究tsp-w体内抗肿瘤免疫活性。通过小动物b超检测确定肝有占位性病变后，开始用对照剂pbs(100μl)或tsp-w(400mg/kg/100μl)多糖治疗，每2d灌胃1次。在整个灌胃给药过程中观测到，正常组(n-pbs)和tsp-w给药组(400mg/kg)小鼠毛发黑且浓密，具光泽感，反应敏捷；与正常组、给药组、tsp-w治疗组(c-tsp-w，400mg/kg)相比，在灌胃给药第4天，模型组(c-pbs)各小鼠胸腹部见略显膨隆，灌胃给药第8天，模型组小鼠活动灵敏度有所降低，毛色发黄；灌胃给药第10天，与tsp-w治疗组相比，模型组各小鼠活动受限，精神状况明显不佳，活动范围明显减少，活动能力不足，进食减少，而tsp-w治疗组小鼠的整体状态优于模型组，表现在胸部肿胀程度较轻，活动能力稍强，进食状况略好。
[0139]
如图13中a所示，在实验操作期间，对照组、tsp-w给药组、治疗组未出现小鼠死亡现象；灌胃操作结束后第6天，模型组小鼠即出现死亡现象。从整体上来看，与模型组比较，tsp-w治疗组小鼠的整体生存率高于模型组。在整个实验周期内，如图13中b所示，对照组和tsp-w给药组小鼠体重未见明显差异，而模型组小鼠在生存后期体重明显连续下降；与模型组比较，经tsp-w治疗后，肝癌小鼠体重先有所增加，在生存后期体重有所减轻，表明tsp-w治疗可以降低肝癌小鼠的负担，提高肝癌小鼠生存率。
[0140]
4.2金果榄多糖tsp-w对肝癌小鼠肝功能的影响
[0141]
对各组小鼠肝功能血清指标检测分析(如图14所示)，与正常组相比，tsp-w给药组小鼠血清中alt、ast和ggt水平无明显差异，而模型组小鼠血清alt、ast和ggt水平显著升高；与模型组相比，tsp-w治疗组alt、ast和ggt水平均下降显著，结果表明经tsp-w治疗可明显改善肝癌小鼠的肝功能损伤。
[0142]
4.3病理分析
[0143]
分离各组小鼠肝脏，并对肝脏进行he染色分析，结果显示(如图15)，正常组与给药组小鼠肝脏外观无明显差异，模型组小鼠肝脏明显增大、见明显球状结节，tsp-w治疗组小鼠肝脏体积稍小，未见结节。肝脏he染色显示模型组小鼠肝脏见大量脂肪空泡，肝细胞脂肪变性，肝损伤严重，tsp-w治疗组肝损伤明显减轻。与血液生化分析结果一致，he染色结果表明tsp-w对肝癌小鼠具有保护作用。
[0144]
5.总结
[0145]
多糖的经典提取方法通常需要高温和较长时间，可能导致多糖的降解和变性，生物活性减弱，目前各种现代提取技术已被应用于提取功能型生物聚合物。本发明以金果榄为原料，采用超声辅助提取、水提醇沉法获得金果榄粗多糖tsp，产率为4.34％，得率较高。超声处理可以在水溶液中产生声空化气泡，破坏细胞壁从而加速物质溶出，有助于提高产率，同时缩短处理时间，减少能耗，当前超声提取已被广泛用于制备多种生物活性多糖以提
高提取率。
[0146]
与传统分级醇沉方法相比，经过deae-52阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶处理的多糖具有更高的含糖量、纯度和生物活性。本发明通过deae-52纤维素树脂和葡聚糖凝胶sephdex g-100对金果榄粗多糖tsp进行纯化，得到均一中性多糖片段tsp-w，总糖含量高达97％，蛋白质含量较低，说明制备的tsp-w纯度高。
[0147]
多糖的分子量是影响多糖构型和形态重要因素，同时还与蛋白质-碳水化合物相互作用相关，影响多糖的生物活性。超声提取条件和乙醇浓度也对多糖的分子量造成影响，研究显示分子量小的多糖活性具有更高的生物活性。hpgpc结果显示，tsp-w样品为单个窄对称峰，分子量为14.248kda，表明tsp-w是一种分子量较低的均质多糖，而多糖的均一性对结构分析和活性至关重要。
[0148]
多糖的分子量、单糖组成和高级结构与其生物活性密切相关。本发明采用hplc柱前pmp衍生化分析tsp-w的单糖组成，结果显示tsp-w中葡萄糖含量占比达99.99％，是一种葡聚糖。
[0149]
多糖的构型取决于单糖结构单元的构象以及糖链中糖苷键的类型和位置，其高级结构与药理活性密切相关。葡聚糖因具有免疫调节、营养保健等益处，以及抗癌和促凋亡特性，被列为功能性食品，分为α-d-葡聚糖、β-d-葡聚糖和α,β-d-葡聚糖。红外分析显示，tsp-w具有多糖的典型特征吸收峰和α-糖苷键构型。采用甲基化分析鉴定出(1
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)连接葡萄糖残基(a)、(1
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4)连接葡萄糖残基(b)、(1
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4,6)连接葡萄糖残基(c)，这与tsp-w的单糖组成结果一致。根据各残基占比(18∶72.3∶9.6)推测tsp-w具有以残基a和残基b作为残基c的o-6位末端取代的主链结构，与卡介苗多糖bcg-psaw具有类似的结构片段。α-葡聚糖因出色的生物活性而被广泛研究，主要通过1
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3，1
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4或1
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6糖苷键连接，被应用于食品、医药等领域，具有广阔的市场前景。相较于1
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3葡聚糖在医学领域受到广泛关注，1
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4或1
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6葡聚糖在预防和治疗各种疾病方面也具有潜在的应用。此外，本发明从金果榄中分离的葡聚糖tsp-w同样含有
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1，1
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4或1
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4，6三种连接方式，并发现对原发性肝癌小鼠有一定的保护作用。
[0150]
sem是观察多糖形态特征的有效技术，多糖的微观形态多种多样，每种微观形态都是多糖的独有特征。本发明观察到tsp-w主要为“薄片”“碎屑”和“条状”形貌，与西番莲多糖wpep-f2外观相似，在中间有较大的孔径，倾向于产生毛细管作用，形成较大的比表面积，可能具有较好的吸附特性，推测可能是由超声处理的空化作用引起。
[0151]
葡聚糖因具有高度重复结构，可与免疫细胞表面受体或其他靶标进行多价结合，从而激活宿主免疫系统对抗入侵的病原体和肿瘤，若与多种抗体和化疗药物联合使用可提高抗肿瘤治疗的效果。当前可溶性葡聚糖作为一种免疫刺激抗肿瘤药物已被广泛关注，而免疫调节剂已被较广泛地应用于肝癌病人的临床治疗，在提高机体免疫力、减轻化疗不良反应、消灭残癌和微转移灶等方面发挥重要作用。由此本发明推测来自金果榄的葡聚糖tsp-w是否具有类似的免疫活性，并进行了一系列实验来验证其抗肝癌免疫活性。本发明以akt/n-ros基因导入c57bl/6建立的新型转基因原发性肝癌小鼠为模型，用对照剂pbs和tsp-w分别灌胃，观察小鼠生存状态、体重、肝肿瘤大小，并对肝功能相关指标进行检测。在动物实验中发现，正常组(n-pbs)和tsp-w给药组小鼠整体状态良好，未出现小鼠死亡现象。模型组(c-pbs)各小鼠在灌胃第4天胸部略显膨隆，在灌胃后期活动敏捷度明显降低，饮食、精神状况明显不佳，灌胃操作结束后第6天，小鼠即出现死亡现象，肝脏见明显白色结节，小
鼠血清alt、ast和ggt水平显著升高。而tsp-w治疗组小鼠的整体状态明显优于模型组，表现在饮食、活动强，体重下降缓慢，生存期长，肝功能指标降低等方面。体内实验结果表明tsp-w可延长小鼠生存期、延缓体重下降、抑制肿瘤生长、减少肝损伤，具有保护肝功能的作用。
[0152]
综上所述，本发明通过阴离子交换柱层析和葡聚糖凝胶色谱纯化，从金果榄粗多糖中分离得到一个均一的α-葡聚糖tsp-w，其对akt/n-ros基因诱导的原发性肝癌有一定的疗效，能明显减轻对肝脏的损伤，抑制肿瘤生长，延长患瘤小鼠的生存期，其抗癌作用可能与逆转t耗竭，提高抗肿瘤免疫能力相关。
[0153]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种金果榄多糖，其特征在于，所述金果榄多糖是由α-d-葡萄糖组成的葡聚糖，具有1
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连接的葡萄糖残基、1
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4连接的葡萄糖残基和1
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4，6连接的葡萄糖残基的结构片段，其数量比为18∶72.3∶9.6；所述金果榄多糖的分子量为14.248kd。2.一种如权利要求1所述的金果榄多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用水提醇沉法对金果榄进行提取后，再经过除蛋白操作，得到粗多糖；(2)所述粗多糖再经过阴离子交换柱层析纯化和凝胶柱层析纯化，得到所述金果榄多糖；在步骤(1)中，所述水提醇沉法中的水提操作采用超声辅助提取。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述水提操作的时间为30min，所述超声的频率为40khz。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述水提醇沉法使用乙醇溶液进行醇沉处理，所述乙醇溶液的体积分数为85％。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述阴离子交换柱层析纯化采用deae-52纤维素阴离子交换层析柱。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，凝胶柱层析纯化采用葡聚糖凝胶g-100。7.一种如权利要求1所述的金果榄多糖在制备治疗肝癌的药物中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物具有以下(1)-(4)中至少一项所述的作用：(1)延长肝癌患者的生存期；(2)延缓肝癌患者的体重下降；(3)抑制肝癌患者的肝脏肿瘤生长；(4)改善肝癌患者的肝脏功能损伤。9.一种治疗肝癌的药物，其特征在于，活性成分包括权利要求1所述的金果榄多糖。10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

技术总结
本发明公开了一种金果榄多糖及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。所述金果榄多糖是由α-D-葡萄糖组成的葡聚糖，具有1


技术研发人员：郝新才 李平飞 胡娇 赵永恒 韩明清 程银水 宋梦楠 余宗兴
受保护的技术使用者：湖北金水源农业开发有限公司
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/9/7