一种缩短葫芦科植物主茎长度的方法及相关产品

一种缩短葫芦科植物主茎长度的方法及相关产品
1.本技术要求于2022年05月07日提交中国专利局、申请号为202210493626.5、发明名称为“一种缩短葫芦科植物主茎长度的方法及相关产品”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本技术中。
技术领域
2.本发明涉及分子生物学、生物技术和植物改良的技术领域，特别涉及5’utr片段和生物材料及其在缩短葫芦科植物主茎长度中的应用、以及在葫芦科植物材料或其相关产品中的应用。


背景技术：

3.随着世界人口的迅速增加和耕地的逐渐减少，如何实现高效农业生产已成为全球最重要的科学挑战之一。植物株型是“单位面积产量”的主要因素，对提高农作物产量和农业机械化管理等具有重要意义。农作物矮化品种具有高密植、适应机械化和增产潜力大等特点，因此矮化株型育种一直是农作物育种改良的重要方向。
4.葫芦科植物如黄瓜、甜瓜、西瓜和南瓜等是世界上重要的蔬菜作物，其种植面积在世界范围内仅次于茄科类蔬菜作物，是世界上第二大类蔬菜作物。但是近十年来，重要的葫芦科作物如黄瓜、甜瓜、西瓜和南瓜的单位面积产量仅仅增长了10％；这主要是由于目前绝大多数葫芦科植物的主茎较长、占地面积较大，这大大限制了单位面积产量，同时造成管理上费时费工。适度矮化的株型由于具有植株紧凑，适于密植，单位面积产量高，节约劳动力等优点，适合植物的密植高产和轻简化栽培需求。因此培育主茎适度缩短的矮化株型品种成为葫芦科植物株型育种改良的新方向。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了5’utr片段和生物材料及在缩短葫芦科植物主茎长度中的应用、以及在葫芦科植物或其相关产品中的应用。通过对该5’utr片段的删除，达到缩短植物(尤其是葫芦科植物)主茎长度的目的。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明一方面提供了一种5’utr片段(yabby1基因5’utr的b-region序列)，该5’utr片段包含如下核苷酸序列中的至少一种：
8.a)核苷酸序列结构为：b
1-x-b29.其中，b1为seq id no：1所示序列，x为任意碱基或无碱基，b2为seq id no：2所示序列。
10.b1序列为nnnaaggcagatccaagga，其中，n为g或a；
11.b2序列为ggtggttaatctgtcaatcccatcaatcagtc。
12.b)上述a)中所示序列的互补序列、简并序列或同源序列，其中同源序列为与a)所示序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列；
13.c)在严紧条件下与a)所示序列杂交的核苷酸序列或其互补序列；
14.d)序列a)-c)中任一序列的cdna序列。
15.在本发明提供的实施例中，碱基选自腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)、尿嘧啶(u)。在本发明提供的具体实施例中，碱基为腺嘌呤(a)。
16.在拟南芥等模式植物中，yabby1基因具有负调控植株茎尖分生组织的功能。如拟南芥yabby1突变体中的植物茎尖分生组织大于对照野生型的茎尖分生组织；而在拟南芥中，35s启动子超量表达yabby1基因可以抑制茎尖分生组织，使得拟南芥植株变得矮小。
17.本发明通过正向遗传学，克隆了中国南瓜矮化基因bu，该基因编码一个yabby转录因子(yabby1)，在该基因的5’utr里矮化南瓜植株相对于野生型南瓜植株缺失了76bp，导致了目的基因的蛋白翻译效率的大幅度提高。进一步分析发现缺失的76bp序列中存在一个葫芦科保守的顺式调控元件(命名为b-region)。本发明实施例中利用crispr-cas9基因编辑工具，将南瓜、黄瓜、西瓜和甜瓜的yabby1基因5’utr的b-region序列删除或部分删除，在这些葫芦科作物中均表现为：各种b-region序列的缺失在不同程度上提高了yabby1的翻译效率，并且以剂量依赖性方式成比例地抑制植株的主茎长度。
18.进一步的，同源序列为与原始核苷酸序列约80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上同一性的核苷酸序列，或其相对应的cdna分子。
19.示例性地，所述“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针至少80％互补的靶序列。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性。
20.在本发明提供的具体实施例中，a)中核苷酸序列包含seq id no：3～seq id no：5所示序列中的至少一种。
21.seq id no：3序列为：
22.gggaaggcagatccaaggaggtggttaatctgtcaatccc atcaatcagtc，seq id no：3序列存在于南瓜中。
23.seq id no：4序列为：
24.gaaaaggcagatccaaggaaggtggttaatctgtcaatcc catcaatcagtc，seq id no：4序列存在于黄瓜、甜瓜、西瓜、葫芦中。
25.seq id no：5序列为：
26.aaaaaggcagatccaaggaaggtggttaatctgtcaatcc catcaatcagtc，seq id no：5序列存在于冬瓜中。
27.在本发明提供的另一实施例中，5’utr片段还包含5’端侧翼序列a1和/或3’端侧翼序列a2，a1或a2为任意长度、任意碱基组合的序列。
28.在本发明提供的具体实施例中，5’端侧翼序列a1序列为an(2)cn(4)can(7)n(8)an(10)n(11)an(13)n(14)n(15)n(16)n(17)n(18)n(19)n(20)n(21)n(22)n(23)n(24)n(25)aan(28)n(29)n(30)aa aan(35)，其中，第2、28-30位n为g或a，第4位n为g或t，第7、8、10位n为a或t，第11位n为a或c，第13位n为a、t或无任何碱基，第14位n为c或无任何碱基，第15-17、
19、21-23位n为a或无任何碱基，第18、20、24、25、35位n为a、g或无任何碱基。
29.本发明另一方面提供了一种生物材料，该生物材料为下述1)至5)中的任一种：
30.1)删除上述5’utr片段或其部分片段的敲除盒；
31.2)删除上述5’utr片段或其部分片段的敲除载体；
32.3)删除上述5’utr片段或其部分片段的重组微生物；
33.4)删除上述5’utr片段或其部分片段的植物细胞系；
34.5)导入1)-3)中任意一种的植物原生质体、细胞或愈伤组织。
35.本发明另一方面提供了上述5’utr片段或生物材料在缩短植物主茎长度中的应用。
36.在本发明提供的实施例中，植物为葫芦科植物。
37.在本发明提供的具体实施例中，葫芦科植物包括但不限于南瓜(cucurbita moschata)、黄瓜(cucumis sativus)、西瓜(citrullus lanatus)、甜瓜(cucumis melo)、葫芦(lagenaria siceraria)、冬瓜(benincasa hispida)、丝瓜(luffa cylindrica)、苦瓜(momordica charantia)、佛手瓜(sechium edule)、绞股蓝(gynostemma pentaphyllum)、雪胆(hemsleya chinensis)、栝楼(trichosanthes kirilowii)、木鳖(momordica cochinchinensis)、罗汉果(siraitia grosvenorii)等。其它没有列举出来的葫芦科植物也在本发明的保护范围之内。
38.本发明另一方面提供了一种葫芦科植物材料的培育方法，在受体植物中删除上述5’utr片段或其部分片段，得到目的植物；与受体植物相比，目的植物的主茎长度缩短。
39.本发明实施例中利用基因编辑工具将葫芦科作物中的yabby1基因的5’utr中保守的b-region序列删除，使所述基因的蛋白翻译效率提高，达到缩短葫芦科植物主茎长度的目的。
40.本发明具体实施例中，利用基因编辑crispr-cas9技术删除目的序列。将导入了crispr-cas9系统的表达盒，或重组载体，或重组微生物应用于南瓜、黄瓜、西瓜和甜瓜等葫芦科植物的基因编辑中，可以对b-region序列进行删除，进而缩短这些葫芦科植物的主茎长度。
41.对于载体的具体种类不作限定，能够满足成功构建重组的表达载体，且该表达载体能够通过工程菌介导进入南瓜、黄瓜、西瓜和甜瓜中正常发挥crispr-cas9系统的功能即可。具体的，载体包括但不限于pkse401、pkse402、pgreb32、phr04、pcxun-be3，本发明具体实施例中选择pkse402作为载体。
42.本发明具体实施例中，利用导入了上述表达盒和/或载体的微生物或植物细胞删除目的序列。
43.本发明实施例中所述的表达盒和/或载体可以被引入到微生物或植物细胞中。此处，“微生物”是指引入所述crispr-cas9系统的表达盒和/或载体，并且还包括携带所述表达盒和/载体的这种微生物的子代。微生物可以是任何原核或真核细胞生物。
44.进一步，所述微生物包括但不限于农杆菌、枯草杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、乳酸菌、昆虫细胞，或本领域技术人员常用的其它合适作为宿主细胞的微生物。
45.进一步，微生物优选农杆菌。农杆菌的菌种包括但不限于：农杆菌eha105、农杆菌lba440、农杆菌eha101、农杆菌gv3101。
46.在本发明的一种实施方式中，包含crispr-cas9系统的表达盒和/或载体的试剂和/或试剂盒用于培育葫芦科植物主茎缩短的材料。
47.本发明另一方面提供了一种葫芦科植物材料或其相关产品，其为上述的植物细胞系、植物原生质体、细胞或愈伤组织生长形成的植物或其相关产品；或者采用上述葫芦科植物材料的培育方法获得的植物或其相关产品；
48.相关产品为其植物部分、植物细胞、花粉或种子。
49.在本发明提供的实施例中，植物材料包括种质、株系、品系、商品种。
50.本发明另一方面提供了一种葫芦科植物材料的育种方法，包括将上述葫芦科植物材料自交，或与其它品种杂交，获得葫芦科植物材料。
51.在本发明的一种实施方式中，上述葫芦科植物的育种方法为主茎缩短的二倍体材料进行自交或与其他二倍体材料进行杂交，获得主茎缩短的材料后代。
52.在本发明的一种实施方式中，上述葫芦科植物的育种方法为主茎缩短的二倍体材料加倍变成四倍体后与其他四倍体材料进行杂交后，再降倍变成二倍体材料后代。
53.在本发明的一种实施方式中，上述葫芦科植物的育种方法为主茎缩短的二倍体材料加倍变成四倍体后与其他四倍体材料进行杂交后，获得四倍体材料。
54.在本发明提供的实施例中，植物材料包括种质、株系、品系、商品种。
55.本发明另一方面提供了一种葫芦科植物材料或其相关产品，其为上述葫芦科植物材料自交，或与其它品种杂交所形成的后代，以及后代生长形成的植物材料或其相关产品；
56.相关产品为其植物部分、植物细胞、花粉或种子。
57.本发明另一方面提供了一种由上述葫芦科植物材料或其相关产品制成的商业植物产品，商业植物产品包括食品、药品、化妆品/护肤品、饲料或其它产品。
58.在本发明提供的具体实施例中，食品包括但不限于：新鲜的果实、干燥的果实、冷冻的果实、腌制的果实、蜜制的果实、油炸的果实或其各种加工形式的果实；各种加工形式的果实包括但不限于果实条、果实块、果实片、果实颗粒、果实粉、果实酱、果实汁液、发酵产品。
59.在本发明提供的具体实施例中，药品包括：植物药用部分制成的各种剂型；植物药用部分可为根、茎、叶、花、果实、种子、瓜蒂等；剂型可为本领域中认可的任意剂型。
60.在本发明提供的具体实施例中，化妆品/护肤品包括但不限于：洗面奶、爽肤水、乳液、面霜、精华、面膜、眼霜、眼膜、隔离乳、防晒乳、粉底液、bb霜。
61.在本发明提供的具体实施例中，饲料包括但不限于：液态饲料、固态饲料、半固态饲料或饲料原料。
62.本发明另一方面提供了一种制造商业植物产品的方法，包括获得上述葫芦科植物材料或其相关产品，制造商业植物产品。
63.与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
64.本发明通过利用基因编辑工具，将葫芦科植物(南瓜、黄瓜、西瓜和甜瓜等)的yabby1基因5’utr的保守的b-region序列删除或部分删除，使得yabby1的翻译效率提高，从而缩短了葫芦科植物主茎长度，达到葫芦科植物株型矮化和密植高产的目的，同时可以大大节约劳动力。
untranslated region，3'-utr)(或"尾随序列，trailer")。尽管它们被称为"非翻译区"，并且不是构成该基因的蛋白质编码区，但在5
′
非翻译区内的上游可读框可以被翻译成多肽；
80.cdna：全称complementary dna，是一种互补脱氧核糖核酸；
81.crispr/cas9系统：crispr/cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源dna。crispr/cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒dna的片段整合到crispr中，并利用相应的crispr rnas(crrnas)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。此系统的工作原理是crrna(crispr-derived rna)通过碱基配对与tracrrna(trans-activating rna)结合形成tracrrna/crrna复合物，此复合物引导核酸酶cas9蛋白再与crrna配对的序列靶位点剪切双链dna。而通过人工设计这两种rna，可以改造形成具有引导作用的sgrna(single-guide rna)，足以引导cas9对dna的定点切割；
82.sgrna(small guide rna)：是向导rna，在rna编辑的过程中引导尿苷残基插入或缺失到动质体中，属于一种小型非编码rna，可与pre-mrna配对。grna编辑rna分子，长度大约60-80个核苷酸，由单独的基因转录；
83.杂交：两个基因型不同的个体相交。也指不同品种间的交配。植物可指不同品种间的异花传粉；
84.自交：两个基因型相同的个体相交。植物指自花传粉；
85.f2：是杂交或自交的子二代；
86.染色体倍性(chromosome ploidy)：是指细胞中包含的染色体组数或基因组数。正常的配子细胞中所包含的染色体数或半数的体细胞染色体数称为一套单倍染色体，用符号n表示。某种生物的完整的一套单倍染色体称为该种生物的基因组或染色体组。具有一个染色体组的细胞和由这样的细胞组成的个体称为单倍体(n)，具有两个染色体组的细胞或个体称为二倍体(2n)，具有两个以上整套染色体组的细胞或个体则称为多倍体，包括三倍体(3n)、四倍体(4n)等。由相同来源染色体组形成的多倍体称为同源多倍体，由不同来源不同染色体组形成的多倍体称为异源多倍体；
87.sanger测序：sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以a、t、c、g结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的page胶上电泳进行检测，从而获得可见dna碱基序列的一种方法；
88.indel(insertion-deletion)插入缺失标记，指的是两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的pcr引物，这就是indel标记；
89.单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)：主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90％以上；
90.基因组结构性变异(structure variantions，简称svs)通常指基因组上大长度的序列变化和位置关系变化。基因组结构性变异类型很多，包括长度在50bp以上的长片段序列插入或者删除(big indel)、串联重复(tandem repeate)、染色体倒位(inversion)、染色体内部或染色体之间的序列易位(translocation)、拷贝数变异(cnv)以及形式更为复杂的嵌合性变异。
91.核苷酸表：
92.符号含义名称的来源aa腺嘌呤gg鸟嘌呤cc胞嘧啶tt胸腺嘧啶n/na或g或c或t/u，未知，或其它任何
93.南瓜中的yabby1基因，表示为cmoyabby1，对应南瓜的基因号是cmoch15g012090；黄瓜中的yabby1基因，表示为csyabby1，对应黄瓜的基因号是csav3_5g003950；西瓜中的yabby1基因，表示为clyabby1，对应西瓜的基因号是cla97c01g003950；甜瓜中的yabby1基因，表示为cmyabby1，对应甜瓜的基因号是melo3c000087.2。在葫芦科植物yabby1基因的5’utr中，存在一个保守的b-region区域。
94.本发明中所用试剂、仪器、菌种或生物材料等均可由市场购得。
95.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
96.实施例1中国南瓜矮化基因bu的图位克隆
97.中国南瓜杂合商品种“无蔓4号”自交后，在后代群体里发生矮化性状和蔓生性状的分离，遗传学分析表明该矮化性状是由一个完全显性单基因bu控制。通过矮化单株池和蔓生单株池的测序比较分析，在中国南瓜的15号染色体7.8-8.8mb区间，鉴定到一个显著的信号峰(图1a)，即bu基因初步定位于定位于该区间。通过对3200单株的f2分离群体筛选重组单株进行精细定位，结合重组单株表型和分子标记基因型分析，最后bu基因定位在一个55kb的物理区间内(图1b)，通过序列的注释分析发现该区间内有8个候选基因(图1c)。通过对矮化单株池和蔓生单株池测序数据的变异分析，只发现了一个indel(矮化南瓜相对于长蔓南瓜缺失了76bp序列)变异，位于基因号为cmoch15g012090的5’utr(图1d)，除此外，该55kb物理区间内没有其他任何变异(包括snp、indel和sv)。通过进化树分析(图1e)，发现cmoch15g012090基因是一个yabby家族的转录因子(即cmoyabby1)。同时，针对bu位点的76bp变异，我们设计了分子标记并检测了550份
98.中国长蔓南瓜种质，发现这些长蔓南瓜种质均存在该76bp序列。综合上述的实验数据，我们认为cmoch15g012090的5’utr中76bp序列的缺失很可能是矮化表型发生的原因。
99.为了便于后续的阐述和分析，我们将cmoch15g012090的5’utr中缺失的76bp序列分为2部分，即25bp的a-region和51bp的b-region(图1d)。将葫芦科植物的yabby1基因的5’utr序列进行比对，结果显示b-region在葫芦科中较为保守(图2)，预示着在葫芦科作物里b-region作为一个保守的功能元件可能具有一定的生物学功能。
100.南瓜yabby1的b-region序列(seq id no：3)：
101.gggaaggcagatccaaggaggtggttaatctgtcaatc ccatcaatcagtc
102.黄瓜yabby1的b-region序列(seq id no：4)：
103.gaaaaggcagatccaaggaaggtggttaatctgtcaat cccatcaatcagtc
104.甜瓜yabby1的b-region序列(seq id no：4)：
105.gaaaaggcagatccaaggaaggtggttaatctgtcaat cccatcaatcagtc
106.西瓜yabby1的b-region序列(seq id no：4)：
107.gaaaaggcagatccaaggaaggtggttaatctgtcaat cccatcaatcagtc
108.葫芦yabby1的b-region序列(seq id no：4)：
109.gaaaaggcagatccaaggaaggtggttaatctgtcaat cccatcaatcagtc
110.冬瓜yabby1的b-region序列(seq id no：5)：
111.aaaaaggcagatccaaggaaggtggttaatctgtcaat cccatcaatcagtc
112.实施例2cmoyabby1基因5’utr的b-region片段或部分片段删除导致了南瓜植株的主茎变短
113.利用crispr/cas9工具，对南瓜cmoyabby1(cmoch15g012090)基因的b-region设计双靶位进行基因编辑，获得了一系列的缺失b-region南瓜突变体。具体步骤如下：
114.1.sgrna序列的设计和crispr/cas9载体的构建
115.在cmoyabby1基因的b-region上设计双靶位点序列，长度均为19bp。双靶位点设计的位置如图3a，靶位点1的核苷酸序列为aaaagggaaggcagatcca(5
’‑3’
)(seq id no：6)，靶位点2的核苷酸序列为tgtttggttgactgattga(5
’‑3’
)(seq id no：7)。
116.通过试剂盒in-fusion hd cloning plus(clontech,#638909)，利用in-fusion克隆技术将含有上述2个靶位点的序列构建入pkse402载体中，pkse402的酶切位点为bsa i。
117.将上步连接好的pkse402-crispr/cas9载体转化至大肠杆菌感受态dh5α，经过基因测序确定正确的载体质粒。
118.2.南瓜遗传转化和阳性转基因植株的获得
119.将上述获得的pkse402-crispr/cas9载体通过热激转化转至农杆菌感受态细胞eha105，得到重组菌eha105/pkse402-crispr/cas9。
120.将重组菌eha105/pkse402-crispr/cas9采用农杆菌侵染子叶的转化方法。将发芽的南瓜种子去除胚芽，并将子叶远轴端切割去除1/3，剩余的子叶作为外植体。将这些外植体转移到含有20ml农杆菌eha105悬浮液的三角形瓶中，并对其进行超声处理，然后将南瓜外植体在农杆菌悬浮液中进行真空渗透。将外植体与农杆菌在潮湿的滤纸上在黑暗中共培养3天，然后转移至芽诱导培养基。培养3-4周后，由于pkse402载体中携带标签绿色荧光蛋白，选择具有绿色荧光的植株即为t0代转基因南瓜植株。
121.3.b-region发生突变的南瓜阳性植株鉴定和表型观察
122.提取t0代转基因南瓜植株的基因组dna作为模板，pcr扩增b-region区域，得到不同株系的pcr扩增产物。将不同株系的pcr扩增产物进行sanger测序，根据测序结果与野生型南瓜的b-region区域进行比对分析。
123.测序比对结果表明，采用crispr/cas9系统成功的实现了对南瓜cmoyabby1的5’utr中b-region片段或部分片段的删除编辑，造成了4种删除模式(图3a)。
124.将获得的t0代南瓜基因编辑植株继续自交获得种子，t1代继续种植后观察表型。结果显示(图3b-3c)，与野生型对照的南瓜植株相比，cmom-1、cmom-2、cmom-3和cmom-4突变南瓜植株的主茎长度显著变短。
125.实施例3csyabby1基因5’utr的b-region片段或部分片段删除导致了黄瓜植株的主茎变短
126.利用crispr/cas9工具，对黄瓜csyabby1(csav3_5g003950)基因的b-region设计双靶位进行基因编辑。
127.在csyabby1基因的b-region上设计双靶位点序列，长度均为19bp。双靶位点设计的位置如图4a，靶位点1的核苷酸序列为aaaagaaaaggcagatcca(5
’‑3’
)(seq id no：8)，靶位点2的核苷酸序列为attggtagtgactgattga(5
’‑3’
)(seq id no：9)。
128.载体质粒的构建和农杆菌侵染外植体过程同实施例2。
129.转基因黄瓜植株的获得和b-region发生突变的黄瓜阳性植株鉴定过程同实施例2。
130.测序比对结果表明，采用crispr/cas9系统成功的实现了对黄瓜csyabby1的5’utr中b-region片段或部分片段的删除编辑，造成了3种删除模式(图4a)。
131.在上述编辑植株的t1代观察表型，结果显示(图4b-4c)，与野生型对照的黄瓜植株相比，csm-1、csm-2和csm-3突变黄瓜植株的主茎长度显著变短。
132.实施例4clyabby1基因5’utr的b-region删除导致西瓜植株的主茎变短
133.利用crispr/cas9工具，对西瓜clyabby1(cla97c01g003950)基因的b-region设计双靶位进行基因编辑。
134.在clyabby1基因的b-region上设计双靶位点序列，长度均为19bp。双靶位点设计的位置如图5a，靶位点1的核苷酸序列为aaaagaaaaggcagatcca(5
’‑3’
)(seq id no：10)，靶位点2的核苷酸序列为ttggggtttgactgattga(5
’‑3’
)(seq id no：11)。
135.载体质粒的构建同实施例2。
136.西瓜遗传转化过程如下：将西瓜种子萌发出芽，然后去除胚，将没有胚的子叶切成1.5
×
1.5-mm的小块。将含有pkse402-crispr/cas9的农杆菌侵染外植体。将侵染后的子叶外植体在黑暗中共培养4天，然后转移到选择性诱导培养基上，出现再生的不定芽后，将不定芽切下并转移到选择性延伸培养基上。培养数周后，选择具有绿色荧光的植株即为t0代转基因西瓜植株。
137.b-region发生突变的西瓜阳性植株鉴定过程同实施例2。
138.测序比对结果表明，采用crispr/cas9系统成功的实现了对西瓜clyabby1的5’utr中b-region区域的删除编辑，造成了3种删除模式(图5a)。
139.在上述编辑植株的t1代观察表型，结果显示(图5b-5c)，与野生型对照的西瓜植株相比，clm-1、clm-2和clm-3突变西瓜植株的主茎长度显著变短。
140.实施例5cmyabby1基因5’utr的b-region删除导致甜瓜植株的主茎变短
141.利用crispr/cas9基因编辑工具，对甜瓜基因cmyabby1(melo3c000087.2)的b-region设计双靶位进行基因编辑。
142.在cmyabby1基因的b-region上设计双靶位点序列，长度均为19bp。双靶位点设计的位置如图6a，靶位点1的核苷酸序列为aaaagaaaaggcagatcca(5
’‑3’
)(seq id no：12)，靶位点2的核苷酸序列为attggtagtgactgattga(5
’‑3’
)(seq id no：13)。
143.载体质粒的构建和农杆菌侵染外植体过程同实施例2。
144.转基因甜瓜植株的获得和b-region发生突变的甜瓜阳性植株鉴定过程同实施例2。
145.测序比对结果表明，采用crispr/cas9系统成功的实现了对甜瓜cmyabby1的5’utr中b-region片段或部分片段的删除编辑，造成了2种删除模式(图6a)。
146.在上述编辑植株的t1代观察表型，结果显示(图6b-6c)，与野生型对照的甜瓜植株
相比，cmm-1和cmm-2突变甜瓜植株的主茎长度显著变短。
147.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种5’utr片段，其特征在于，所述5’utr片段包含如下核苷酸序列中的至少一种：a)核苷酸序列结构为：b
1-x-b2其中，b1为seq id no：1所示序列，x为任意碱基或无碱基，b2为seq id no：2所示序列。b)所述a)中所示序列的互补序列、简并序列或同源序列，其中所述同源序列为与a)所示序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列；c)在严紧条件下与a)所示序列杂交的核苷酸序列或其互补序列；d)所述序列a)-c)中任一序列的cdna序列。2.根据权利要求1所述的5’utr片段，其特征在于，所述a)中核苷酸序列包含seq id no：3～seq id no：5所示序列中的至少一种。3.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述1)至5)中的任一种：1)删除权利要求1或2所述5’utr片段或其部分片段的敲除盒；2)删除权利要求1或2所述5’utr片段或其部分片段的敲除载体；3)删除权利要求1或2所述5’utr片段或其部分片段的重组微生物；4)删除权利要求1或2所述5’utr片段或其部分片段的植物细胞系；5)导入1)-3)中任意一种的植物原生质体、细胞或愈伤组织。4.权利要求1-2中任一项所述5’utr片段或权利要求3所述生物材料在缩短植物主茎长度中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物为葫芦科植物；优选地，所述葫芦科植物包括南瓜、黄瓜、西瓜、甜瓜、葫芦、冬瓜、丝瓜、苦瓜、佛手瓜、绞股蓝、雪胆、栝楼、木鳖或罗汉果。6.一种葫芦科植物材料的培育方法，其特征在于，在受体植物中将权利要求1或2所述5’utr片段或其部分片段进行删除，得到目的植物；与受体植物相比，所述目的植物的主茎长度缩短。7.一种葫芦科植物材料或其相关产品，其特征在于，其为权利要求3所述的植物细胞系、植物原生质体、细胞或愈伤组织生长形成的植物材料或其相关产品；或者采用权利要求6所述培育方法获得的植物材料或其相关产品；所述相关产品为其植物部分、植物细胞、花粉或种子。8.根据权利要求7所述的葫芦科植物材料或其相关产品，其特征在于，所述植物材料包括种质、株系、品系或商品种。9.一种葫芦科植物材料的育种方法，其特征在于，包括将权利要求7或8所述的葫芦科植物材料自交，或与其它品种杂交，获得葫芦科植物材料。10.一种葫芦科植物材料或其相关产品，其特征在于，其为权利要求7或8所述葫芦科植物材料自交，或与其它品种杂交所形成的后代，以及所述后代生长形成的植物材料或其相关产品；所述相关产品为其植物部分、植物细胞、花粉或种子。11.一种由权利要求7或10所述的葫芦科植物材料或其相关产品制成的商业植物产品，其特征在于，所述商业植物产品包括食品、药品、化妆品/护肤品、饲料或其它产品。12.根据权利要求11所述的商业植物产品，其特征在于，所述食品包括：新鲜的果实、干燥的果实、冷冻的果实、腌制的果实、蜜制的果实、油炸的果实或其各种加工形式的果实；各种加工形式的果实包括果实条、果实块、果实片、果实颗粒、果实粉、果实酱、果实汁液、发酵
产品；所述药品包括：植物药用部分制成的各种剂型；所述化妆品/护肤品包括：洗面奶、爽肤水、乳液、面霜、精华、面膜、眼霜、眼膜、隔离乳、防晒乳、粉底液、bb霜；所述饲料包括：液态饲料、固态饲料、半固态饲料或饲料原料。13.一种制造商业植物产品的方法，其特征在于，包括获得权利要求7或10所述的葫芦科植物材料或其相关产品，制造所述商业植物产品。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，特别涉及5’UTR片段、生物材料及缩短葫芦科植物主茎长度的方法和相关产品。该5’UTR片段包含：核苷酸序列结构为B


技术研发人员：王深浩 杨学勇 黄三文 李海真 李征
受保护的技术使用者：中国农业科学院深圳农业基因组研究所 北京市农林科学院 西北农林科技大学
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/9/7