用于从微生物中提取脱氧核糖核酸和/或核糖核酸的珠粒撞击管和方法与流程

用于从微生物中提取脱氧核糖核酸和/或核糖核酸的珠粒撞击管和方法
1.本技术是分案申请，对应的母案申请的申请号为201780008892.1，申请日为2017年1月30日，发明名称为“用于从微生物中提取脱氧核糖核酸和/或核糖核酸的珠粒撞击管和方法”。
2.本技术要求2016年1月30日提交的欧洲专利申请号ep16153540的优先权利益，其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本技术涉及用于从微生物中提取脱氧核糖核酸和/或核糖核酸的珠粒撞击管和方法。


背景技术：

4.感染性疾病的遗传测试与诊断于临床微生物学的领域中扮演重要角色。为克服基于培养的方法学固有的偏差与限制，遗传测试越来越多地被用于检测样本中所含的微生物。为了使如此遗传测试可被执行，细胞必须被裂解以允许以尽可能高的浓度自微生物提取dna和/或rna。
5.zhongtang yu等人，2004,“improved extraction of pcr-quality community dna from digesta and fecal samples,”biotechniques,vol.36(5)：808-812描述用于自消化物和粪样本分离dna的方法。于该方法中，0.25g的取自母牛的胃肠系统的样本液(其被假定为含有微生物(即细菌))首先与1ml的含有500mm氯化钠、ph 8.0的50mm tris盐酸盐、50mm乙二胺四乙酸和4％十二烷基硫酸钠的缓冲液混合。此外，0.4g无菌氧化锆珠粒被导入该样本液中。所获得的混合物随后于样本管中以mini-beadbeater
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振荡三分钟，使得珠粒破坏微生物的细胞壁。于此程序中，细胞中所含的dna被释放。该缓冲液亦可用于保护dna免于被样本液中所含的dna酶降解。于执行该珠粒撞击后，杂质是通过以醋酸铵沉淀来自样本移除。核酸是通过以异丙醇沉淀来获得。于进一步方法步骤中，dna是依序以rna酶与蛋白酶k消化并随后以管柱纯化。
6.该方法有以下缺陷：其是相对复杂的。因为样本液由于该缓冲液的添加而被稀释，样本中的dna浓度减低。因此，该方法仅允许有限的检测正确性与敏感性。
7.因此，存在有对于用于裂解样本液中所含的微生物的细胞并自其提取核酸的改良装置与方法的需求。


技术实现要素：

8.本文的公开内容是关于改良的珠粒撞击管与珠粒撞击系统与方法。无意受限于理论，发明人相信珠粒撞击允许核酸溶解至溶液中。本文的公开内容是(部分)基于以下发现：于核酸提取方法中使用珠粒撞击会由于在珠粒上的吸附而造成核酸损失，和如此损失可通过适当量的封阻剂以封阻珠粒上的结合位置来预防。本文的公开内容还是基于以下认识：
虽然一些先前用于珠粒撞击中的裂解缓冲液可能含有可扮演封阻剂的试剂，但这样的试剂可以以远低于通常所使用者的量使用。进一步，本文的公开内容还是基于以下认识：一些生物样本(诸如血液)固有地含有封阻剂和因此可在添加剂(诸如裂解缓冲液)不存在下经历珠粒撞击。
9.于某些方面，本文的公开内容提供珠粒撞击系统，其适合在珠粒撞击以下者时使用：不固有地含有封阻剂或含有其量低于适用于有效封阻核酸被珠粒吸附的量的封阻剂的样本。本文的公开内容的珠粒撞击系统包括干封阻剂。令人意外地，结果是当将本文的公开内容的撞击撞击系统用于裂解微生物与自液体样本中所含的微生物提取脱氧核糖核酸(dna)和/或核糖核酸(rna)时，可实现比在使用不含有该封阻剂的相应珠粒撞击管时更大的dna和/或rna提取率。
10.本文的公开内容的珠粒撞击系统还可规避于珠粒撞击前组合样本与裂解溶液的需要，从而由于没有样本稀释而允许回收较大量的核酸。
11.在另一个方面，本文的公开内容提供用于执行珠粒撞击以裂解细胞并自生物样本提取核酸的方法。所述方法包括在裂解缓冲液不存在下对该生物样本执行珠粒撞击。所述珠粒撞击方法可利用本文的公开内容的珠粒撞击系统或标准珠粒撞击系统。当使用标准珠粒撞击系统时，于一些实施方式中，一种或多种封阻剂被加至所述珠粒撞击系统。于其他实施方式中，尤其在生物样本天然包括一种或多种封阻剂的情况下，于珠粒撞击前不添加封阻剂。
12.于某些实施方式中，本文的公开内容的珠粒撞击系统是由以下者构成：样本管，其包含具有内腔的容器构件、用于将含有微生物的样本液充至该内腔中的孔洞和用于关闭该孔洞的接附或非接附的封闭物，其中多个肉眼可见的颗粒被布置于该内腔中，其适用于在该样本液被充至该内腔中和该珠粒撞击管经受机械振荡时机械性地破坏该样本液中所含的微生物的细胞壁。示例性珠粒珠粒系统在以下第4.1节与经编号的实施方式1至24及67至75中描述。可用于所述珠粒撞击系统的示例性样本管在第4.1.1节中描述，可用于所述珠粒撞击系统的示例性封阻剂在第4.1.2节中描述，和可用于所述珠粒撞击系统的示例性珠粒在第4.1.3节中描述。
13.本文的公开内容进一步是关于用于裂解微生物以自所述微生物提取脱氧核糖核酸(dna)和/或核糖核酸(rna)的方法，其中样本液被提供(其被假定为含有所述微生物)，其中多个相对于彼此是可移动的颗粒被导入该样本液中和其中含有颗粒的样本液被振荡以使得所述颗粒能够机械性地破坏该样本液中所含的微生物的细胞壁。自其可提取dna的示例性样本在第4.2节中描述和可用于在核酸提取前制备样本的示例性样本预处理步骤在第4.3节中描述。用于自样本(例如自于第4.2节中描述的样本或已如于第4.3节中描述地预处理的样本)提取核酸的示例性方法在以下第4.4节与经编号的实施方式25至58与76至81描述。可用于执行本文的公开内容的核酸提取方法的试剂盒在以下第4.7节与经编号的实施方式59至66描述。
附图说明
14.图1：包含样本管(2)与封闭盖(6)的示例性珠粒撞击系统(1)的侧视图。
15.图2：于图1显示的珠粒撞击系统的俯视图。
16.图3：于图1显示的珠粒撞击系统的底视图。
17.图4：通过于图1显示的珠粒撞击系统的中心面的纵截面，其中该封闭盖自该样本管移除，显露通过其可进入该样本管的内腔(3)的孔洞(4)。珠粒(7)与冷冻干燥封阻剂(8)在该内腔内显示。
18.图5：通过充以样本液(5)的于图1显示的珠粒撞击系统的中心面的纵截面。
19.图6：显示使用于珠粒撞击后自白色念珠菌回收的dna作为模版的pcr扩增产物的强度。calbi144与calbi54是两种不同的白色念珠菌靶基因和hco1-rat87是阴性对照基因。此研究显示尿素于珠粒撞击中具有封阻性功效，促进白色念珠菌dna自pd液的回收。
20.图7：显示使用于珠粒撞击后自白色念珠菌回收的dna作为模版的pcr扩增产物的强度。calbi144与calbi54是两种不同的白色念珠菌靶基因和hco1-rat87是阴性对照基因。此研究显示rna于珠粒撞击中具有封阻性功效，促进白色念珠菌dna自pd液的回收。
21.图8：显示使用于珠粒撞击后自白色念珠菌回收的dna作为模版的pcr扩增产物的强度。calbi144与calbi54是两种不同的白色念珠菌靶基因和hco1-rat87是阴性对照基因。对应于提取的最大理论产量的量的白色念珠菌dna被包括以作为模版。此研究显示白色念珠菌dna可在添加剂不存在下通过珠粒撞击血液回收。
22.图9：显示使用于珠粒撞击后自白色念珠菌回收的dna作为模版的pcr扩增产物的强度。自其探测的基因是用于检测真细菌(eub)、革兰氏阴性细菌(gng)、革兰氏阳性细菌(gpo)、大肠杆菌(eco)、葡萄球菌属(staphylocci)(allstaph)、肠杆菌科(enterobacteriacae)(ent)、金黄色葡萄球菌(sau)、分枝杆菌(myco)。n03 rat 87是阴性对照，和cc是内部对照。对应于提取的最大理论产量的量的金黄色葡萄球菌dna被包括作为模版。此研究显示金黄色葡萄球菌dna可在添加剂不存在下通过珠粒撞击血液回收。
23.图10：显示使用于珠粒撞击后自白色念珠菌回收的dna作为模版的pcr扩增产物的强度。自其探测的基因是用于检测真细菌(eub)、革兰氏阴性细菌(gng)、革兰氏阳性细菌(gpo)、大肠杆菌(eco)、葡萄球菌(allstaph)、肠杆菌科(ent)、金黄色葡萄球菌(sau)、分枝杆菌(myco)。n03 rat 87是阴性对照，和cc是内部对照。对应于提取的最大理论产量的量的大肠杆菌dna被包括作为模版。此研究显示大肠杆菌dna可在添加剂不存在下通过珠粒撞击血液回收。
具体实施方式
24.详细描述
25.珠粒撞击是用于裂解细胞以释放其内容物(包括其核酸(dna与rna))的均质化程序。样本被置于具有适当的研磨珠粒的管子内并经受高能混合。所述样本通常随后被离心和裂解产物被从所述珠粒上回收。通常，经受珠粒撞击的样本是以裂解缓冲液处理以促进dna自细胞释放。
26.本文的公开内容是关于改良的珠粒撞击方法与系统。所述珠粒撞击方法可在不使用裂解缓冲液下执行，简化细胞裂解与核酸提取的程序和避免样本稀释同时使归因于在珠粒上的吸附的损失减至最小。
27.本文的公开内容的方法是关于使用适当量的封阻剂执行珠粒撞击。所述封阻剂对于该样本而言可是外源性或内源性。例如，血液含有尿素，一种被发现会封阻生物样本中的
核酸与珠粒撞击珠粒的结合的试剂。因此，本文的公开内容提供在不添加外源性封阻剂下珠粒撞击这样的样本的方法，虽然以外源性封阻剂补充内源性封阻剂还被考虑。对于不含有内源性封阻剂或含有低量的内源性封阻剂的生物样本，可使用外源性封阻剂。本文的公开内容进一步提供珠粒撞击系统，干封阻剂被并入至其内，这允许在没有造成样本稀释的试剂的添加下珠粒撞击生物样本。
28.因此，本文的公开内容提供包括干封阻剂的珠粒撞击系统。本文的公开内容进一步提供用于执行珠粒撞击以裂解生物样本中的细胞并自其提取核酸的方法。所述方法包括在裂解缓冲液不存在下对所述生物样本执行珠粒撞击。所述珠粒撞击方法可利用本文的公开内容的珠粒撞击系统或标准珠粒撞击系统。当使用标准珠粒撞击系统时，于一些实施方式中，一种或多种封阻剂被加至所述珠粒撞击系统。于其他实施方式中，尤其在生物样本天然地包括一种或多种封阻剂的情况下，没有封阻剂在珠粒撞击前被添加。
29.本文中还提供含有(或适用于获得)本文的公开内容的珠粒撞击系统的试剂盒。
30.4.1珠粒撞击系统
31.本文的公开内容提供可用于细胞裂解与自液体样本中所含的细胞(例如微生物)提取脱氧核糖核酸(dna)与核糖核酸(rna)的珠粒撞击系统。本文的公开内容的珠粒撞击系统包含样本管和位在该样本管内的珠粒与干封阻剂。可用于本文的公开内容的珠粒撞击系统的封阻剂包括尿素、胍盐、清洁剂、核苷酸和寡核苷酸。封阻剂在第4.1.2节详细描述。可用于本文的公开内容的珠粒撞击系统的珠粒包括包含矿物质和/或金属的珠粒。适合用于本文的公开内容的珠粒撞击系统的珠粒在第4.1.3节中描述。
32.4.1.1样本管
33.本文的公开内容的珠粒撞击系统包含样本管，其具有可透过孔洞进入和可容纳珠粒、封阻剂和液体样本的内腔。该样本管可以任何生物惰性材料(例如塑料或硼硅酸盐)构成，和优选地是以塑料(例如聚丙烯、聚丙烯共聚物或聚碳酸酯)构成。用于本文中，术语“管子”涵盖小瓶(例如研磨小瓶)与管子(例如锥形管)。
34.该珠粒撞击系统可包括用于遮盖该孔洞并密封该样本管的封闭物。该封闭物可被固定至该样本管(例如通过铰链固定至该样本管的盖子)或可与该样本管分离(即可移除的盖子)。该样本管可包括适用于啮合螺纹盖的螺纹区域。所述螺纹可在该样本管的内或外表面上(例如如于图4-5显示的)。
35.可用于本文的公开内容的珠粒撞击系统的样本管是商业上可购得的(例如)螺旋盖聚丙烯或微量离心管。标准管尺寸可用于制造本文的公开内容的珠粒撞击管与系统，例如0.5ml、1.7ml、2ml、4.5ml、7ml、15ml、50ml或250ml。
36.4.1.2封阻剂
37.本文的公开内容的珠粒撞击系统包括干封阻剂。用于本文中，“干”或“干燥”封阻剂是封阻剂，其含有少于20％水分。于一些实施方式中，该干封阻剂含有少于15％、少于10％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％水分。
38.该干封阻剂优选是长期稳定的，即该珠粒撞击系统可被无问题地运输与储存一段较长的时期而该封阻剂的封阻性功效不会相当地减低。该干封阻剂可被松散地布置于该容器构件的内腔内，和/或该样本的部分或整个内腔可以封阻剂的层或封阻剂的薄膜涂覆。该封阻剂优选是经冷冻干燥。该封阻剂可于所述珠粒被添加至该管前或后被冷冻干燥。
39.封阻剂的实例包括一种或多种离散剂(例如尿素、胍盐)、一种或多种清洁剂、一种或多种核苷酸、一种或多种寡核苷酸或任何其组合。这样的示例性封阻剂的细节在第4.1.2.1至4.1.2.5节示出，如下文所述。包含促成微生物细胞井的溶解的封阻剂(例如清洁剂)可改良使用本文的公开内容的珠粒撞击系统制备的核酸的产率并规避在珠粒撞击前组合样本与裂解溶液的需要。一般而言，用于本文的公开内容的珠粒撞击系统的封阻剂的量低于用于裂解溶液的量。
40.珠粒撞击系统可通过于珠粒撞击管中冷冻干燥裂解溶液(还称为提取缓冲液或裂解缓冲液)来产生。含有封阻剂的裂解溶液是所属技术领域中已知的或可商业地购得。
41.于一些实施方式中，该封阻剂包含一种或多种离散剂。于一些实施方式中，该封阻剂包含一种或多种清洁剂。于一些实施方式中，该封阻剂包含一种或多种核苷酸。于一些实施方式中，该封阻剂包含一种或多种寡核苷酸。于一些实施方式中，该封阻剂包含一种或多种离散剂与一种或多种清洁剂。于一些实施方式中，该封阻剂包含一种或多种离散剂与一种或多种核苷酸。于一些实施方式中，该封阻剂包含一种或多种离散剂与一种或多种寡核苷酸。于一些实施方式中，该封阻剂包含一种或多种清洁剂与一种或多种核苷酸。于一些实施方式中，该封阻剂包含一种或多种清洁剂与一种或多种寡核苷酸。于一些实施方式中，该封阻剂包含一种或多种核苷酸与一种或多种寡核苷酸。于一些实施方式中，该封阻剂包含一种或多种离散剂、一种或多种清洁剂和一种或多种核苷酸。于一些实施方式中，该封阻剂包含一种或多种离散剂、一种或多种清洁剂和一种或多种寡核苷酸。于一些实施方式中，该封阻剂包含一种或多种离散剂、一种或多种核苷酸与一种或多种寡核苷酸。于一些实施方式中，该封阻剂包含一种或多种清洁剂、一种或多种核苷酸和一种或多种寡核苷酸。于一些实施方式中，该封阻剂包含一种或多种离散剂、一种或多种清洁剂、一种或多种核苷酸和一种或多种寡核苷酸。
42.该封阻剂可进一步包含乙二胺四乙酸(edta)和/或其钠盐。edta与钙、镁及铁结合和因此失活化脱氧核糖核酸酶与核糖核酸酶。此方法还对使用该珠粒撞击系统处理的样本液中所含的dna与rna的降解起反作用。因此，测量结果的较高检测敏感性与再现性在检查使用本文的公开内容的珠粒撞击系统自细胞(例如微生物)提取的dna和/或rna的期间成为可能。
43.该封阻剂可被松散地布置于该容器构件的内腔内，例如呈粉末形式。该粉末可(例如)于该样本中与所述珠粒混合或可呈位于所述珠粒之上和/或之下的一层的形式被布置于该样本管内。供选择地或此外，该样本管的内壁可至少部分地以封阻剂的层或封阻剂的薄膜涂覆。该层或薄膜可通过自已加至该样本管的包含该封阻剂的水性混合物蒸发液体来制备。于其他实施方式中，于该珠粒撞击系统中的珠粒中的一些或全部可以该封阻剂涂覆。
44.4.1.2.1离散剂
45.离散剂破坏大分子(诸如蛋白质与核酸)的结构并使其变性。离散溶质因为使邻接蛋白质的水分子无序化所以减少疏水性区域的净疏水性效应。这在溶液中溶解疏水性区域，藉此使蛋白质变性。此还直接适用于脂质双层中的疏水性区域；若离散溶质的临界浓度被达到(于该双层的疏水性区域中)，则膜完整性会被破解，和细胞会裂解。
46.可被用作为封阻剂的示例性离散剂在以下提供。
47.尿素：当该封阻剂包含尿素(或硫脲；用于本文中，除非上下文另外指明，术语尿素
包括硫脲)时，尿素的量可与意欲与该珠粒撞击系统一起使用的该样本液的量匹配，以使得在将该样本液加至该样本管后溶解于该样本液中的尿素的浓度范围介于10与100克每升之间、介于50与100克每升之间、介于20与50克每升之间或介于25与35克每升之间。因此，有关以上实施方式，如果1ml的样本欲被加至2ml管，用于该封阻试剂的尿素的量会介于10与100mg之间、介于50与100mg之间、介于20与50mg之间或介于25与35mg之间(分别地)，和如果0.8ml的样本欲被加至2ml管，用于该封阻试剂的尿素的量会介于8与80mg之间、介于40与80mg之间、介于16and 40mg之间或介于20与28mg之间(分别地)。
48.盐：某些盐可起离散剂的作用。盐可通过遮蔽电荷与预防盐桥的稳定化而具有离散特性。离散盐包括各种胍、锂与镁的盐。
49.胍盐：可被用作为本文的公开内容的珠粒撞击系统中的封阻剂的胍盐包括异氰酸胍、氯化胍和其组合。
50.锂盐：可被用作为本文的公开内容的珠粒撞击系统中的封阻剂的锂盐包括过氯酸锂、醋酸锂和其组合。
51.镁盐：可被用作为本文的公开内容的珠粒撞击系统中的封阻剂的镁盐包括氯化镁。
52.清洁剂：某些清洁剂可起离散剂的作用，例如十二烷基硫酸钠(“sds”)。使用清洁剂作为封阻剂在第4.1.2.3节中描述。
53.4.1.1.2肌酐
54.当该封阻剂包含肌酐时，于该样本管的内腔中该肌酐的存在可对使用该珠粒撞击系统处理的样本中所含的dna和/或rna的降解起反作用。此外，肌酐预防该dna和/或rna非特异性地与所述珠粒和/或该样本管的内壁结合。此在自使用该珠粒撞击管系统处理的细胞(例如微生物)提取dna和/或rna时使较大的产率成为可能。
55.4.1.2.3清洁剂
56.可被用作为本文的公开内容的珠粒撞击系统中的封阻剂的清洁剂包含十二烷基硫酸钠、月桂酰基硫酸肌胺酸钠、聚氧乙烯(20)去水山梨醇单月桂酸酯和其组合。聚氧乙烯(20)去水山梨醇单月桂酸酯还已知为聚山梨糖醇酯20。
57.用于该封阻剂的清洁剂的量可与意欲与该珠粒撞击系统一起使用的该样本液的量匹配。于某些实施方式中，在将该样本液加至该样本管后溶解于该样本液中的清洁剂的浓度范围在1至50mg/ml、1至25mg/ml或25至50mg/ml。因此，有关以上实施方式，如果1ml的样本欲被加至2ml管，用于该封阻剂的清洁剂的量范围会在1至50mg、1至25mg或25至50mg(分别地)，和如果0.8ml的样本欲被加至2ml管，用于该封阻剂的清洁剂的量范围会在0.8至40mg、0.8至20mg或20至40mg。
58.4.1.2.4核苷酸
59.可用于本文的公开内容的珠粒撞击系统的核苷酸包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和其组合。
60.所述核苷酸可是天然存在的。天然存在的核糖核苷酸是腺苷单磷酸、鸟苷单磷酸、胞嘧啶单磷酸和胸苷单磷酸。可使用的天然存在的脱氧核糖核苷酸是封阻剂是脱氧腺苷单磷酸、脱氧鸟苷单磷酸、脱氧胞嘧啶单磷酸和脱氧胸苷单磷酸。
61.所述核苷酸可是天然存在的核苷酸的非天然存在的类似物。非天然存在的类似物
的实例包括(但不限于)胜肽核苷酸、锁核酸(“lna”)核苷酸(其含有双环糖部分代替脱氧核糖或核糖糖)、所述具有不带电的连接者(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺甲酸酯、等等)及带有电的连接者(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、等等)和所述含有侧基部分者。于特殊的实施方式中，该类似物是4-乙酰基胞嘧啶、8-羟基-n6-甲基腺苷、吖口元基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、n6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟粪嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟粪嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟粪嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟粪嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-胺基甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基queosine、5
′‑
甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧醋酸甲酯、尿嘧啶-5-氧醋酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、n-尿嘧啶-5-氧醋酸甲酯、尿嘧啶-5-氧醋酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶和2,6-二胺基嘌呤或7-去氮鸟苷。
62.于一些实施方式中，该封阻剂包含至少两种、至少三种或四种天然存在的核糖核苷酸的混合物。于其他实施方式中，该封阻剂包含至少两种、至少三种或四种天然存在的脱氧核糖核苷酸的混合物。于又其他实施方式中，该封阻剂包含至少两种、至少三种、四种或甚至超过四种核苷酸类似物的混合物。于其他实施方式中，该封阻剂包含以下的混合物：(a)天然存在的核糖核苷酸与天然存在的脱氧核糖核苷酸、(b)天然存在的核糖核苷酸与核苷酸类似物(c)天然存在的脱氧核糖核苷酸与核苷酸类似物；或(d)天然存在的核糖核苷酸、天然存在的脱氧核糖核苷酸与核苷酸类似物。
63.用于该封阻剂的核糖核苷酸的量可与意欲与该珠粒撞击系统一起使用的该样本液的量匹配。于某些实施方式中，在将该样本液加至该样本管后溶解于该样本液中的核糖核苷酸的浓度范围在200pg/ml至20μg/ml、1ng/ml至15μg/ml或1μg/ml至10μg/ml。因此，有关以上实施方式，如果1ml的样本欲被加至2ml管，用于该封阻剂的核糖核苷酸的量范围会在200pg至20μg、1ng至15μg或1μg至10μg(分别地)，和如果0.8ml的样本欲被加至2ml管，用于该封阻剂的核糖核苷酸的量范围会在160pg至16μg、0.8ng至12μg或0.8μg至8μg。
64.4.1.2.5寡核苷酸
65.可用作为封阻剂的寡核苷酸可自天然存在的来源合成或产生。
66.于本文中提及的“寡核苷酸”并非表示该分子的尺寸和意指任何长度的核苷酸的聚合形式。然而，通常，寡聚物不大于2,000个核苷酸，1,000个核苷酸，更通常不大于500个核苷酸，和甚至更通常不大于250个核苷酸。术语寡核苷酸包括双股与单股dna与rna(但优选是至少部分单股)。其还包括已知类型的修饰，例如，所属技术领域中已知的标记、甲基化、“帽盖”、以类似物取代所述天然存在的核苷酸的一种或多种(诸如于第4.1.2.4节中描述的那些)。
67.所述寡核苷酸可是不同尺寸的混合物和/或可包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物或以上的两种或更多种的组合(例如核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的混合物、核糖核苷酸与核苷酸类似物的混合物、脱氧核糖核苷酸与核苷酸类似物的混合物或核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的混合物)。于一些实施方式中，该封阻剂包含rna。
68.可用于本文的公开内容的珠粒撞击系统的合成寡核苷酸通常是2至120个核苷酸长。于各种实施方式中，所述寡核苷酸是2、5、8、10、15、18、25、40、50、80、100或120个核苷酸长，或具有范围介于以上值的任何配对之间的长度(例如2至100个核苷酸长、2至50个核苷酸长、2至25个核苷酸长、5至40个核苷酸、2至15个核苷酸长、8至120个核苷酸长、8至80个核苷酸长、10至100个核苷酸长、15至50个核苷酸长、50至100个核苷酸长、100至120个核苷酸长等)的寡核苷酸。
69.天然存在的寡核苷酸可通过自一种或多种天然存在的来源(例如鲑鱼精子dna、小牛胸腺dna、鲱鱼精子dna或其组合)提取dna来制备。
70.用于该封阻剂的寡核苷酸的量可与意欲与该珠粒撞击系统一起使用的该样本液的量匹配。于某些实施方式中，在将该样本液加至该样本管后溶解于该样本液中的寡核苷酸的浓度范围在200pg/ml至20μg/ml、1ng/ml至15μg/ml或1μg/ml至10μg/ml。因此，有关以上实施方式，如果1ml的样本欲被加至2ml管，用于该封阻剂的寡核苷酸的量范围会在200pg至20μg，1ng至15μg，或1μg至10μg(分别地)，和如果0.8ml的样本欲被加至2ml管，用于该封阻剂的核糖核苷酸的量范围会在160pg至16μg，0.8ng至12μg，或0.8μg至8μg。
71.4.1.3珠粒
72.本文的公开内容的珠粒撞击系统包含当其被布置于该样本液中时相对于彼此是可移动的珠粒。用于本文中，术语“珠粒”涵盖球形与非球形颗粒两者。所述珠粒可是矿物质珠粒，例如该等由结晶颗粒(例如锆、锆石(硅酸锆)与氧化锆(二氧化锆))、石英、氧化铝、碳化硅(还以金刚砂为人所知)、陶瓷颗粒、玻璃(例如二氧化硅玻璃或硅石)或包含以上的一种或多种的组合(例如氧化锆/硅石珠粒或氧化锆/钆珠粒)构成。所述珠粒还可是金属珠粒，例如不锈钢珠粒或铬钢珠粒。
73.对于细菌dna的回收，所述珠粒优选包括石英颗粒和/或锆颗粒。如此珠粒是商业上可以大量购得和对于dna与rna而言是化学惰性的。石英和/或锆颗粒具有相对高的比重，是坚硬的和可具有锐边。因此，其在暴露至机械震动时极适合用于打开细胞膜。
74.给定珠粒撞击系统的珠粒的材料与尺寸可由所属技术领域中普通技术人员基于欲处理的液体样本中的细胞类型而选择。一般而言，所述珠粒直径范围会在50μm至3mm。对于自细菌细胞提取核酸，可使用小型至中等尺寸的珠粒，其通常是由玻璃或锆构成和直径范围在50μm至0.5mm。对于自较大的微生物细胞(诸如酵母)提取核酸，可使用中等尺寸或大型珠粒(例如具有的0.5mm、1mm或1.5mm珠粒直径的珠粒，其通常由玻璃或锆构成)。用于处理不同细胞类型的不同尺寸与构成的珠粒是商业上可购得。参见(例如)benchmark scientific,product note：benchmark bead beating guide，其可于www.denvillescientific.com/sites/default/files/bead_blasting_notes.pd f获得。
75.本文的公开内容的珠粒撞击系统可包括多种类型的珠粒和/或多种尺寸的相同类型的珠粒，尤其在自多种来源(例如细菌与真菌dna)回收核酸是期望的时。具有多种类型的珠粒的珠粒撞击系统的实例包括具有氧化铝珠粒及碳化硅珠粒的组合、陶瓷珠粒与硅石珠粒的组合、玻璃珠粒及氧化锆珠粒的组合、氧化锆珠粒与氧化铝珠粒的组合或碳化硅珠粒及玻璃珠粒的组合的系统。所述不同类型的珠粒可是相同或不同尺寸。
76.4.2样本
77.自其核酸可使用本文的公开内容的珠粒撞击方法提取的样本的实例包括各种液
体样本。于一些实例中，该样本可是来自受试者的体液样本。该样本可包括自该受试者收集的组织。该样本可包括受试者的体液、分泌物和/或组织。该样本可是生物样本。该生物样本可是体液、分泌物和/或组织样本。生物样本的实例可包括(但不限于)血液、血清、唾液、尿液、胃液与消化液、眼泪、粪便、精液、阴道分泌物、源自肿瘤性组织的组织间隙液、眼液、汗液、黏液、耳垢、油、腺体分泌物、呼吸、脊髓液、毛发、指甲、皮肤细胞、血浆、鼻拭子或鼻咽的洗液、脊髓液、脑脊液、组织、喉拭子、创伤拭子、活检、胎盘液、羊水、脐带血、增强液(emphatic fluid)、腔液、痰、脓或其他创伤渗出物、来自创伤清创或切除的经感染组织样本、脑脊液、灌洗、白血球生成样本、腹膜透析液、乳汁和/或其他分泌物。
78.该样本可自受试者置入珠粒撞击管中或可在置于珠粒撞击管中前已经历一些类型的预处理(例如如于以下第4.3节中描述的)、储存或运送。该样本可未经历干扰或长时间就被加至珠粒撞击系统。
79.受试者可提供样本，和/或该样本可自受试者收集。受试者可是人类或非人类动物。该样本可自活或死受试者收集。该动物可是哺乳类动物，诸如农场动物(例如母牛、猪、绵羊)、运动动物(例如马)或宠物(例如狗或猫)。该受试者可是患者、临床受试者或临床前患者。受试者可正经历诊断、治疗和/或疾病治理或生活方式或预防性护理。该受试者可在或可不在健康护理专家的护理下。
80.于一些实施方式中，该样本可是环境样本。环境样本的实例可包括空气样本、水样本(例如地下水、地表水或废水)、土壤样本或植物样本。
81.其他样本可包括食物产品、饮料、制造材料、纺织品、化学品、治疗或任何其他样本。
82.4.3样本预处理
83.于一些实例中，在于本文的公开内容的珠粒撞击系统中处理前预处理样本可能是有益的。可在将样本置于珠粒撞击管中前使用的预处理步骤的实例包括过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、使干扰性组分失活、添加试剂和类似者，如于本文中讨论的或否则如所属技术领域中已知的。
84.以下会是尤其有利的：在将不想要的细胞类型与微粒物质置入本文的公开内容的珠粒撞击管中前自生物样本移除其等以最大化dna自所关注的细胞类型的回收。
85.如果期望于生物样本检测细菌，则以下是期望的：通过过滤器预处理该生物样本以使得微粒与非细菌细胞被保留在过滤器上而细菌细胞(包括其孢子，若期望)通过。用于本文中，“过滤器”是膜或装置，其允许颗粒与分子基于尺寸的差异性通过。通常，此是通过在过滤器中具有特殊标称尺寸的孔洞来完成。例如，所特别关注的用于细菌检测应用的过滤器具有孔洞，其等足够大以允许所关注的样本中存在的细菌通过但足够小以预防真核细胞通过。一般而言，细菌细胞直径范围在0.2至2μm(微米或微公尺)，大多数真菌细胞直径范围在1至10μm，血小板直径是大约3μm和大多数有核哺乳类动物细胞直径通常是10至200μm。因此，若意欲检测细菌，小于2μm或小于1μm的过滤器孔洞尺寸是尤其适合用于自生物样本移除非细菌细胞。
86.除了过滤步骤以外或替代过滤步骤，生物样本可在珠粒撞击前经受离心以自样本移除细胞与残骸。沉淀真核细胞但不沉淀细菌细胞的离心参数是所属技术领域中已知的。若期望，上清液可随后被过滤。
87.由过滤步骤产生的滤液可是“样本”和可被置入根据本文的公开内容的珠粒撞击管中，或经受进一步预处理步骤(例如浓缩或稀释)。
88.4.4珠粒撞击
89.作为核酸制备中的初步步骤，样本被放置至珠粒撞击管中以供珠粒撞击。该珠粒撞击步骤可利用本文的公开内容的珠粒撞击系统或标准珠粒撞击系统。于一些实例中，当使用标准珠粒撞击系统时，可添加一种或多种外源性封阻剂，但如果生物样本含有内源性封阻剂，添加外源性封阻剂并非必需。当添加一种或多种封阻剂时，其等可于添加该样本前或于添加该样本后加至珠粒撞击管或该样本与该封阻剂两者可被同时添加(例如，该样本与该封阻剂可被混合并随后转移至珠粒撞击管)。
90.于将该样本放置于该珠粒撞击管中后，该管经受搅动以机械性地裂解所述细胞。裂解可通过一般实验室涡旋机或均质机实现。虽然于涡旋机的处理时间比于专用均质机中的时间长3-10倍，涡旋可轻易地破坏细胞并且是不昂贵的。
91.许多适合用于珠粒撞击的均质机是商业上可购得的和可与本文的公开内容的撞击撞击系统一起使用。示例性均质机是beadbug与beadblaster 24(benchmark scientific)、powerlyzer 24(mo bio laboratories inc.)、fastprep-24、fastprep-24 5g与superfastprep-1(mp biomedicals)、及mini-beadbeater-16(biospec products)。
92.均质化参数可根据制造商的建议选择。一般而言，机械破坏(例如珠粒撞击)的持续时间可是小于1秒、1-5秒、5-10秒、10-25秒、25-60秒、1分钟-2分钟、2分钟-5分钟、5分钟或更长。机械破坏(例如珠粒撞击时段的次数)的重复次数可是2、3、4、5、6、7、7-10、10或更多次重复。破坏的速率(例如珠粒撞击的速率或设置)可是少于50、50-100、100-250、250-500、500-750、750-1000、1000-1500、1500-2000、2000或更多次旋转(振荡)每分钟。
93.4.5核酸纯化
94.于细胞裂解后，该液体样本是自所述珠粒分离，例如通过使用移液管或类似者自该样本管移出该液体样本，留下所述珠粒，其沉淀在该样本管的底部。
95.可能干扰所提取的dna的分析的杂质可被移除，例如通过透过已知的方法沉淀所述杂质，诸如使用醋酸铵或使用商业性试剂盒。
96.核酸可被回收并洗涤并任选地进一步纯化。核酸的回收和/或纯化可使用常规方法实现，诸如通过以异丙醇沉淀或使用商业性试剂盒或自动化仪器。
97.4.6核酸分析
98.针对所关注的核酸(诸如细菌或真菌dna)的存在的样本分析可使用任何核酸分析方法执行，该方法包括(但不限于)扩增技术、聚合酶链式反应(pcr)、等温扩增、反转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、定量性实时聚合酶链式反应(q-pcr)、数位pcr、凝胶电泳、毛细管电泳、质谱法、荧光检测、紫外光谱法、杂交分析、dna或rna测序、限制分析、反转录、nasba、等位基因特异性聚合酶链式反应、聚合酶循环组装(pca)、不对称聚合酶链式反应、指数后线性聚合酶链式反应(late-pcr)、解旋酶依赖性扩增(hda)、热起始聚合酶链式反应、序列间特异性聚合酶链式反应(issr)、反向聚合酶链式反应、连接介导性聚合酶链式反应、甲基化特异性聚合酶链式反应(msp)、多路聚合酶链式反应、巢式聚合酶链式反应、固相聚合酶链式反应或任何其组合。这样的技术对所属技术领域中普通技术人员而言是广为人知的。知道靶核酸的序列会使科学家能够构建允许靶的扩增和/或检测的引子和/或探针。pcr扩增
物还可被测序以确认其身份。
99.使用根据本文的公开内容的珠粒撞击系统，以下是可能的：使用本身已知的方法以足以直接微生物地检查dna和/或rna的浓度自该样本液中所含的微生物提取该dna和/或rna。这尤其可通过以下发生：将该样本液与固定在表面上的受体接触，所述受体特异性地与该dna和/或rna结合和/或与其中所含的dna和/或rna组分结合。该dna和/或rna和/或dna和/或rna组分与所述受体的结合可使用本身已知的方式以标记(特别是光学标记，诸如荧光染料)检测，和若需要进行定量。供选择地，来自该样本液中所含的微生物的dna和/或rna可于检查前被扩增(例如通过pcr)。
100.4.7试剂盒
101.本文的公开内容进一步提供含有(或适合用于获得)本文的公开内容的珠粒撞击系统的试剂盒。所述试剂盒可包含样本管(诸如于第4.1.1节中描述的样本管)、一种或多种或封阻剂(诸如所述于第4.1.2节中描述者)和/或一种或多种类型的珠粒(诸如所述于第4.1.3节中描述者)。该一种或多种封阻剂各自可经预冷冻干燥和可被包含在该管内或与该管分开。同样地，所述珠粒可被包含在该管内或与该管分开。
102.于一些实施方式中，该试剂盒包含样本管与一种或多种封阻剂。于进一步的实施方式中，该试剂盒进一步包含一种或多种类型的珠粒。
103.本文的公开内容的试剂盒可包括一种或多种用于样本预处理的组分，例如盐水、一种或多种缓冲液溶液、过滤器(如于第4.3节中描述的)、等等。
104.所述试剂盒可包括一种或多种用于扩增来自一种或多种例如以下的一种或多种的所关注的病原体的dna和/或rna的寡核苷酸：结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、鸟分枝杆菌副结核亚种(mycobacterium avium subsp paratuberculosis)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、二甲氧苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(mrsa)、酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(streptococcus agalactiae)、流行性感冒嗜血杆菌(haemophilus influenzae)、副流感嗜血杆菌(haemophilus parainfuluezae)、卡他摩氏菌(moraxella catarrhalis)、肺炎克留氏菌(klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌(escherichia coli)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、不动杆菌属(acinetobacter)物种、百日咳博德氏杆菌(bordetella pertussis)、脑膜炎双球菌(neisseria meningitidis)、炭疽杆菌(bacillus anthracis)、奴卡氏菌属(nocardia)物种、放线菌属(actinomyces)物种、肺炎霉浆菌(mycoplasma pneumoniae)、肺炎披衣菌(chlamydia pneumonia)、退伍军人杆菌属(legionella)物种、杰氏肺囊虫(pneumocystis jiroveci)、a型流行性感冒病毒、细胞巨大病毒、鼻病毒、屎肠球菌(enterococcus faecium)、鲍氏不动杆菌(acinetobaoter baumannii)、无霉菌酸棒状杆菌(corynebacterium amycolatum)、产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)ci 4413、萎垂沙雷氏菌(serratia marcescens)、马链球菌(streptococcus equi)和白色念珠菌(candida albicans)。
105.所述试剂盒可包括一种或多种用于检测来自一种或多种例如以下的一种或多种的所关注的病原体的dna和/或rna的探针：结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种、金黄色葡萄球菌、二甲氧苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(mrsa)、酿脓链球菌、肺炎链球菌、无乳链
球菌、流行性感冒嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、卡他摩氏菌、肺炎克留氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌属物种、百日咳博德氏杆菌、脑膜炎双球菌、炭疽杆菌、奴卡氏菌属物种、放线菌属物种、肺炎霉浆菌、肺炎披衣菌、退伍军人杆菌属物种、杰氏肺囊虫、a型流行性感冒病毒、细胞巨大病毒、鼻病毒、屎肠球菌、鲍氏不动杆菌、无霉菌酸棒状杆菌、产气肠杆菌、粪肠球菌ci 4413、萎垂沙雷氏菌、马链球菌和白色念珠菌。于实施方式中，该一种或多种探针包含以荧光染料标记的寡核苷酸。不同的探针可以不同的染料标记以使同时检测多种所关注的病原体成为可能。
106.5.示例性珠粒撞击系统
107.示例性珠粒撞击系统在附图中显示。于图1至3中以符号(1)指称的珠粒撞击系统包含样本管(2)，其具有内腔(3)与可封闭的孔洞(4)。该样本管优选是由塑料构成，但还可由另一生物惰性材料构成。
108.样本液(5)(其被假定为含有微生物)可通过该孔洞(4)充至该样本管(2)的内腔(3)中和自其移出。对于关闭该孔洞(4)，该样本管具有封闭物(6)，其适用于转运至开口位置与封闭位置和被设计成封闭盖，其包含内螺纹，其适用于旋拧至由该样本管(2)的外壁的边缘区域提供的外螺纹，其与该孔洞(4)结合。
109.于该内腔(3)中，珠粒(7)(例如2克的二氧化硅和/或锆珠粒)被进一步布置，其最大尺寸平均是大约100μm。所述珠粒(7)可以松散的团块的形式获得，于其中其相对于彼此是可移动的。冷冻干燥封阻剂(8)还被布置于该内腔(3)中。
110.当该样本液(5)被充至该内腔(3)中和该珠粒撞击管经受机械振荡(例如超声振荡)时，所述珠粒(7)可用于机械性地破坏该样本液(5)中所含的微生物的细胞壁。其可以用未在附图中以细节阐明的振荡产生器产生和可转传至该珠粒撞击系统(1)。这样的振荡产生器是商业上可自mp biomedicals以mpbio珠粒撞击器之名购得。由于细胞壁的破坏，所述微生物中所含的核酸(例如dna)被释放并溶解于该样本液(5)中。
111.6.实例研究
112.6.1使用珠粒撞击以自痰回收病原体dna
113.结核分枝杆菌(“mtb”)是分枝杆菌科的专性病原性细菌物种并且是大部分肺结核病例的病因。主要为哺乳类动物呼吸系统的病原体，其感染肺脏。证据提示分枝杆菌在例如营养不足或缺氧的压力期间能够进入非复制或休眠(孢子形成)状态。孢子的形成使裂解细菌细胞以提取细菌dna有挑战。
114.进一步使分枝杆菌dna的回收复杂化的是分枝杆菌菌株通常自受感染的患者的痰分离。痰是浓稠的和难以处理的。大多数用于分析的痰样本含有各种量的有机残骸与各种各样的污染、正常或短时间细菌丛。通常使用化学净化/处理以减少黏性并杀死污染物同时允许分枝杆菌的回收。
115.被怀疑含有mtb的样本对用户而言有潜在风险。因此，痰样本可通过加热和/或纳入适合用于使该样本中存在的微生物失活的试剂来预处理以减轻此风险。使微生物(诸如mtb)失活可通过以下实现：加热(例如90℃，5min)以变性活性蛋白质、酶促消化细胞壁结构、机械破坏以物理上地破坏细胞或使细胞失活、化学处理或其组合。
116.对于一致的样本处理，痰样本(通常是以介于1-10ml、5-10ml或更大的体积收集)可经初步液化以减少其的黏性与非均质性。痰样本造成特别的挑战。于痰中的mtb是最具挑
战性的欲处理的细胞和样本类型之一，这是由于该耐酸性杆菌的富含脂质的疏水性细胞壁与痰的黏性非均质性质。用于痰的标准提取方法通常以沉淀处理的程序开始，其往往包含以黏液分解剂(诸如n-乙酰基-l-半胱胺酸(nalc)、杀藻胺(zephiran)-磷酸三钠(z-tsp)或杀藻胺(benzalkonium))处理随后离心、倾析和再悬浮。
117.因此，当处理高黏性样本(诸如痰)时，可使该样本经受化学处理以减低黏性以使得随后的处理步骤不被妨碍。于实施方式中，痰样本透过使用黏液分解剂的化学处理的液化在60℃下实现20分钟。痰具有范围在约100-6,000cp(mpas)的黏性与于90s-1的剪切率。黏性(其以mpas测量)是由抗剪强度除以剪切率来决定。优选地，该样本被液化以减低痰的黏性达至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。
118.于再悬浮后，该样本被加至本文的公开内容的珠粒撞击系统(如于第4.1节中描述的)以裂解细胞，如于第4.4节中描述的。于裂解与核酸提取(参见第4.5节)后，mtb dna可通过pcr扩增mtb序列来分析和mtb药物抗性可通过扩增药物抗性基因来分析。可针对包括(但不限于)以下的其他细菌与病毒病原体分析痰样本：金黄色葡萄球菌、二甲氧苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(mrsa)、酿脓链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、流行性感冒嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、卡他摩氏菌、肺炎克留氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌属物种、百日咳博德氏杆菌、脑膜炎双球菌、炭疽杆菌、奴卡氏菌属物种、放线菌属物种、肺炎霉浆菌、肺炎披衣菌、退伍军人杆菌属物种、杰氏肺囊虫、a型流行性感冒病毒、细胞巨大病毒和鼻病毒。
119.6.2使用珠粒撞击以自兽医病原体回收dna
120.鸟分枝杆菌副结核亚种(map)是兽医病原体，其是造成副结核病或johne氏病(jd)(家养与野生反刍动物中的慢性肉芽肿胃肠炎)的原由。map于畜群中是透过精液、乳汁、初乳与子宫内直接传播与通过受污染的饲料、秣料、牧草、水等等通过口途径(粪口途径)间接传播。jd对家畜生产力有毁灭性影响(早熟淘汰与乳汁生产减少)并且家畜产业招致巨大的经济损失。jd控制工作已被map在土壤与水中的持续存在以及由亚临床与临床家畜的放出妨碍。
121.如于之前的章节中提及的，孢子的形成使得裂解分枝杆菌细胞以提取细菌dna有挑战性。因此，本文的公开内容的珠粒撞击系统可用于改善map回收。例如，所述珠粒撞击系统可用于自于乳汁、土壤、排泄物、精液、等等中存在的map回收dna。
122.乳汁样本可使用本文的公开内容的珠粒撞击系统直接处理或可经预处理，例如以增加该样本中的map(若存在)的浓度。示例性预处理方法包括离心乳汁的样本以提供乳油级分、乳清级分和沉淀小丸。该乳油级分与该沉淀小丸可被倒在一起并加至本文的公开内容的珠粒撞击系统以用于裂解细胞。
123.粪样本可经预处理，例如通过制备粪悬浮液，其可随后被加至本文的公开内容的珠粒撞击系统以用于裂解细胞。示例性粪悬浮液可通过以下制备：混合粪样本与水、盐水或缓冲液(例如磷酸钠、经磷酸盐缓冲的盐水、tris、等等)，允许该混合物澄清，分离并随后离心上清液，与最后将沉淀小丸再悬浮于适合的液体(诸如水、盐水或缓冲液)中。
124.土壤样本可被悬浮于液体(例如水、盐水或缓冲液)中并随后加至本文的公开内容的珠粒撞击系统以用于裂解。精液样本可于珠粒撞击前通过将精液样本与某量的水、盐水或缓冲液结合在一起来类似地预处理。
125.6.3使用珠粒撞击以自创伤回收病原体dna
126.对于创伤感染的检测，可将创伤拭子培养于盐水的溶液、细胞培养培养基或来自商业性试剂盒的样本制备溶液中。该拭子通常被培养一段大约5分钟-1个小时和更优选是0.25-1个小时(例如0.25个小时、0.5个小时或0.75个小时)的时期。溶液的适合体积是200μl至10ml和特别的实施方式是500μl、1ml、2ml、5ml、8ml或选自边界为以上实施方式的任两者的范围(例如1ml至5ml、500μl至10ml、200μl至8ml等。该溶液可被周期性地摇动或搅动以促进病原性细胞自该拭子释放。于培养时期的最后，该拭子可被挤拧并丢弃。
127.该溶液可随后被置于本文的公开内容的珠粒撞击系统中。任选地，其在珠粒撞击前被过滤和/或浓缩。
128.一般感染创伤的病原体包括(但不限于)大肠杆菌、铜绿假单胞菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌(包括mrsa)、肺炎克留氏菌、鲍氏不动杆菌、无霉菌酸棒状杆菌、产气肠杆菌、粪肠球菌ci 4413、萎垂沙雷氏菌、马链球菌与白色念珠菌。因此，可针对以上生物体的任一者(单一或组合)分析创伤拭子样本。
129.6.4使用珠粒撞击以自腹膜透析液回收病原体dna
130.腹膜透析是用于患有严重慢性肾脏疾病的患者的治疗。此类型的透析使用患者腹部中的腹膜作为跨越其液体与溶解物质自血液交换的膜。液体透过于腹部的固定管导入并随后洗出以清除过多的盐、尿酸与其他废物。通过跨越腹膜的渗透，溶质在血液与透析液间交换。在一适合的时间后，该透析液被自腹膜移除并丢弃。以此方式，血液变得平衡和终端代谢产物(诸如尿酸)于血液中的无限堆积被预防。
131.腹膜透析的主要并发症是归因于腹部中的固定管的存在的感染。至少感染位置在腹膜空间中，导致腹部疼痛、浑浊的透析排出液与在格兰氏染色或于来自导管内的培养物上找到病原体。进一步，组织通道或该导管的外表面是来自接触污染的一般感染点。于组织通道的感染最常是由于自皮肤位置的移动。感染可导致腹膜炎和于一些病例导致死亡。
132.腹膜感染可于自经历腹膜透析的个体移出的腹膜透析液中检测。虽然金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌是大多数感染的原由，还可涉及其他细菌(类白喉菌、厌气性生物体、非发酵性细菌、链球菌、非结核性分枝杆菌、退伍军人杆菌属、酵母和真菌)。因此，可针对以上生物体的任一者(单一或组合)分析腹膜透析液样本。
133.腹膜透析液可通过过滤与任选地浓缩预处理，如于第4.3节中描述的。
134.6.5使用珠粒撞击以自废水污染物回收dna
135.美国专利号9,290,796(其是针对于生物废水处理过程中检测造成问题的成泡与膨大细菌物种)的实施例1描述使用珠粒撞击方案自废水处理工厂收集的废水提取dna。该珠粒撞击方案可适用于并入本文的公开内容的珠粒撞击系统。
136.6.6使用珠粒撞击以自食物病原体回收dna
137.液体食物样本可于珠粒撞击前通过过滤和/或离心预处理，如于以上第4.3节中描述的。例如，饮料优选可通过过滤预处理以收集可能出现的微生物。通过过滤收集的微生物可于珠粒撞击前任选地洗涤与经受离心。关于从固体食物(诸如肉或鱼)检测病原体，该食物的样本可被擦拭以自该食物的表面收集微生物。所述微生物可随后自该拭子洗出并随后经受珠粒撞击。
138.于一些实例中，以下可是期望的：预培养食物样本一段时间以于珠粒撞击前促进
可能存在于该样本上或内的病原体(例如沙门氏杆菌属(salmonella))的生长。例如，固体食物样本可使用实验室混合器(例如循环器，seward limited，英国)磨碎并随后培养以促进微生物生长(例如共8至12小时)。该培养物的样本可随后经受珠粒撞击。
139.6.7使用珠粒撞击以自血液回收病原体dna
140.针对人类感染的快速分子诊断测试的开发是世界卫生组织于改善世界人口的健康的最高优先(daar等人，2002,nat.genet.32：229-232)。严重血液感染是全世界住院治疗的患者发病与死亡的一重要原因与重症加护的最重要挑战之一。例如，于美国的最近的败血症发生率的估计是每100000个病例240个病例。败血症的人类与经济负担是相当大的(grossi等人，2006,surg.infect.(larchmt)7：s87-s91)。尽管于感染性疾病与重症加护治理有进展和有为数众多的开发新治疗的尝试，败血症死亡率仍然是无法接受地高的，范围在20％至50％。识别严重血液感染和/或严重败血症的征候并作出早期和正确的诊断是改良护理与增加存活率的关键。确实，快速诊断可通过减少介于取样血液与施用抗微生物治疗之间的时间间隔而增加患者存活。
141.对于检测病原体的分子技术(例如pcr与dna序列分析)，病原体dna的适当分离对于确保成功的检测而言是关键性的。各种方法使用裂解缓冲液，有时伴随着物理破坏方法(诸如珠粒撞击)以改良病原体dna自血液的回收。
142.本文的公开内容利用血液中的天然存在的封阻剂的存在并提供用于自血液分离病原体dna的简化方法。该血液可在不被任何缓冲液或其他添加剂稀释下使用本文的公开内容的珠粒撞击系统(含有封阻剂的)或传统珠粒撞击系统(缺少封阻剂)经受珠粒撞击。于珠粒撞击后，可使用标准方法以回收病原体dna，诸如所述于第4.5节中描述者。任选地，所回收的病原体dna随后被分析，例如通过所述于第4.6节中描述的方法。
143.造成败血症的病原体通常是细菌或真菌。败血症的一般细菌病因是革兰氏阴性杆菌(例如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、啮蚀eikenella氏菌(e.corrodens)和流行性感冒嗜血杆菌)。其他还会造成败血症的细菌是金黄色葡萄球菌、链球菌属(streptococcus)物种、肠球菌属(enterococcus)物种与奈瑟氏球菌属(neisseria)。念珠菌属(candida)物种是最常见的造成败血症的真菌中的一些。因此，可针对以上生物体的任一者(单一或组合)分析血液样本。
144.7.实施例
145.7.1实施例1：珠粒撞击系统造成dna损失
146.7.1.1材料
147.于此研究中使用的材料是：
148.珠粒撞击管：件号：ary0007 opsdiagnostics，4.5ml冷冻小瓶，具有2.0gm的100μm sio2珠粒。
149.pd液：含有葡萄糖与na
+
、ca2
+
、mg2
+
的平衡的腹膜透析液。
150.be缓冲液：taigen bioscience。含有1μg的rna/μl。
151.尿素：acs级
152.7.1.2方法
153.以10mm的水平掺加edta和以5000ceu/ml掺加白色念珠菌的两(2)ml的pd液是标准基质。尿素与be缓冲液的十二(12)种不同组合被加至该样本，如于以下表1中所示：
[0154][0155]
所有样本被珠粒撞击共45秒。于珠粒撞击后，使用lab48核酸提取系统(taigen bioscience corporation，台北，中国台湾)使用制造商的试剂与方案自所述样本分离dna。于100μl的te(tris edta)缓冲液中洗脱从2.0ml的各个珠粒撞击样本分离的dna。使所分离的dna经受实时pcr扩增与定量以测定各个样本中靶dna的量。
[0156]
7.1.3结果
[0157]
各个样本的光学密度比率(其是所分离的dna的纯度的指标)与相应dna浓度在以下表2中显示：
[0158][0159]
以于pcr扩增与杂交后从成像来自该阵列的信号获得的信号强度反映的dna的产率在图6与图7以图示阐明。
[0160]
7.1.4结论
[0161]
于样本1(不含封阻剂)，白色念珠菌dna的回收仅仅是5.5ng/ml。包含尿素作为封阻剂增加回收3-4倍和包含rna作为封阻剂增加回收大约10-20倍，并且产率接近理论最大值。此回收的增加造成白色念珠菌pcr基因扩增的改良。
[0162]
7.2实施例2：使用本文的公开内容的珠粒撞击系统提取dna
[0163]
7.2.1本文的公开内容的珠粒撞击系统的制备
[0164]
于te(tris/edta)缓冲液中制备包含250mg/ml尿素、25mg/ml乙二胺四酸(edta)的四钠盐、125mg/ml腺苷单磷酸、125mg/ml鸟苷单磷酸、125mg/ml胞嘧啶单磷酸、125mg/ml胸苷单磷酸与75mg/ml月桂酰肌胺酸钠的储备封阻剂溶液。
[0165]
将200微升的该储备溶液加至4.5-至5-ml样本管并通过真空干燥，得到沉淀于该样本管的内壁的较低区域中的干燥封阻剂。预期该干燥封阻剂于至少一年内会是稳定的。
[0166]
随后将2.0克的100微米二氧化硅珠粒加至该样本管。
[0167]
7.2.2使用本文的公开内容的珠粒撞击系统
[0168]
通过0.4微米无菌过滤器过滤6ml的尿液与6ml的腹膜透析液并随后将生长于培养实验室中的10,000菌落形成单位每毫升的金黄色葡萄球菌加至该尿液滤液与该腹膜透析
液滤液。
[0169]
将2.9ml的经掺加(spiked)尿液与2.9ml的经掺加腹膜透析液转移至如于第7.2.1节中描述地制备的样本管或加至含有2.0克的100微米二氧化硅珠粒但缺少该封阻剂的样本管。
[0170]
盖上该管并将其夹在mpbio珠粒撞击器中并以全功率运行30秒。移除帽盖并放置在商业dna分离装置的样本架上。自各管取出2ml的各样本并随后添加dna提取剂随后执行dna提取。对各个样本获得100微升的dna提取物。
[0171]
于各个样本中所提取的金黄色葡萄球菌dna的量是通过实时聚合酶链式反应根据以下测的定：gillespie、等人，2005,“simultaneous detection of mastitis pathogens,staphylococcus aureus,streptococcus uberis,and streptococcus agalactiae by multiplex real-time polymerase chain reaction,”j.dairy sci.88：3510-3518。于20微升反应中扩增1微升的各个dna提取物。
[0172]
使用缺少该封阻剂的样本管处理的样本对于尿液具有32的循环阈值和对于腹膜透析液具有38的循环阈值，显示低dna回收。
[0173]
使用具有该封阻剂的样本管处理的样本对于尿液具有31的循环阈值和对于腹膜透析液具有32的循环阈值，显示在此等条件下对于腹膜透析液有改良的回收。
[0174]
7.3实施例3：血液作为封阻剂
[0175]
7.3.1概述
[0176]
执行此研究以鉴认用于血液样本的最理想珠粒撞击条件。以病原体金黄色葡萄球菌、大肠杆菌与白色念珠菌掺加培养阴性血液样本。进行阳性pcr对照。将此对照的浓度(基因组拷贝)设成所导入病原体的理论100％回收。此研究展现在添加剂(诸如缓冲液、清洁剂、等等)不存在下使用珠粒撞击自血液病原体提取dna是可能的。
[0177]
7.3.2材料
[0178]
此研究中具体使用的材料是：
[0179]
珠粒撞击管：件号：ary0007 ops diagnostics，4.5ml冷冻小瓶，具有2.0gm的100μm sio2珠粒。
[0180]
血液：培养阴性，来自健康捐赠者
[0181]
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌与白色念珠菌培养物：皆来自atcc
[0182]
7.3.3方法
[0183]
制备一系列的三十八(38)个经掺加的血液样本，其由3.0ml的血液与15μl含有经培养病原体的盐水培养液组成。除了该含有经培养病原体的盐水培养液外无物被加至各个血液样本。使用fast-24均质机(mp biomedicals)以6.5m/s的速率处理该撞击管。随后使用lab48核酸提取系统(taigen bioscience corporation)使用制造商的试剂与方案自所述样本分离dna。以55个循环的pcr扩增dna并与阵列杂交，随后洗涤与成像。病原体的量与珠粒撞击时间在以下表3显示：
[0184]
[0185][0186]
对于在给定掺加水平的该三种不同的病原体，计算来自该dna分离的每μl基因组输出。将此基因组拷贝值用作为100％效率靶。
[0187]
7.3.4结果
[0188]
结果在图8至10以图示阐明，其显示以于pcr扩增与杂交后从成像来自该阵列的信号获得的信号强度反映的dna产率。图8呈现白色念珠菌时间系列以及100％靶。图9呈现金黄色葡萄球菌时间系列以及100％靶。图10呈现大肠杆菌时间系列以及100％靶。
[0189]
7.3.5结论
[0190]
对于该三种不同的病原体，没有由病原体dna与所述珠粒结合造成的信号丧失的证据。于所有实施例中，至少100％的理论值被展现。于2个实施例中，超过100％被回收，其可能是由于来自掺加物中的死细菌的dna的存在。
[0191]
8.例示的具体的实施方式
[0192]
本文的公开内容是通过以下具体的实施方式例示。
[0193]
1.一种珠粒撞击系统，其包含(i)样本管，其具有可透过孔洞进入的内腔、(ii)珠粒和(iii)干封阻剂，其中所述珠粒与干封阻剂是置于该样本管的内腔内。
[0194]
2.根据实施方式1的珠粒撞击系统，其中该封阻剂包含一种或多种离散剂、肌酐、一种或多种核苷酸、一种或多种寡核苷酸或其组合。
[0195]
3.根据实施方式2的珠粒撞击系统，其中该封阻剂包含一种或多种离散剂，包含尿素、一种或多种胍盐、一种或多种锂盐、一种或多种镁盐、一种或多种清洁剂或其组合。
[0196]
4.根据实施方式3的珠粒撞击系统，其中该封阻剂包含一种或多种胍盐，包含异氰酸胍、氯化胍或其组合。
[0197]
5.根据实施方式3或实施方式4的珠粒撞击系统，其中该封阻剂包含一种或多种锂盐，包含过氯酸锂、醋酸锂或其组合。
[0198]
6.根据实施方式3至5中的任一者的珠粒撞击系统，其中该封阻剂包含氯化镁。
[0199]
7.根据实施方式3至6中的任一者的撞击系统，其中该封阻剂包含一种或多种清洁剂，包含十二烷基硫酸钠、月桂酰基硫酸肌胺酸钠、聚氧乙烯(20)去水山梨醇单月桂酸酯或其组合。
[0200]
8.根据实施方式2至7中的任一者的珠粒撞击系统，其中该封阻剂包含一种或多种核苷酸，包含天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸或其组合。
[0201]
9.根据实施方式8的珠粒撞击系统，其中该一种或多种核苷酸包含一种或多种天然存在的脱氧核糖核苷酸、一种或多种天然存在的核糖核苷酸或其组合。
[0202]
10.根据实施方式9的珠粒撞击系统，其中该封阻剂包含一种或多种脱氧核糖核苷酸，包含脱氧腺苷单磷酸、脱氧鸟苷单磷酸、脱氧胞嘧啶单磷酸、脱氧胸苷单磷酸或其组合。
[0203]
11.根据实施方式9或实施方式10的珠粒撞击系统，其中该封阻剂包含一种或多种核糖核苷酸，包含腺苷单磷酸、鸟苷单磷酸、胞嘧啶单磷酸、胸苷单磷酸或其组合。
[0204]
12.根据实施方式2至11中的任一者的珠粒撞击系统，其中该封阻剂包含一种或多种寡核苷酸，包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物或其组合。
[0205]
13.根据实施方式12的珠粒撞击系统，其中该封阻剂包含一种或多种寡核苷酸，其各自独立是2至120个核苷酸长、2至100个核苷酸长、2至50个核苷酸长、2至25个核苷酸长、5至40个核苷酸、2至15个核苷酸长、8至120个核苷酸长、8至80个核苷酸长、10至100个核苷酸长、15至50个核苷酸长、50至100个核苷酸长或100至120个核苷酸长。
[0206]
14.根据实施方式12或实施方式13的珠粒撞击系统，其中该寡核苷酸包含dna和/或rna。
[0207]
15.根据实施方式1至14中的任一者的珠粒撞击系统，其中该样本管的内腔是以该封阻剂的层或薄膜至少部分地涂覆。
[0208]
16.根据实施方式1至15中的任一者的珠粒撞击系统，其中所述珠粒中的一些或全部是以该封阻剂的层或薄膜部分地或完全地涂覆。
[0209]
17.根据实施方式1至16中的任一者的珠粒撞击系统，其包含含有该封阻剂的粉末。
[0210]
18.根据实施方式17的珠粒撞击系统，其中该粉末是含有该封阻剂的经冷冻干燥的粉末。
[0211]
19.根据实施方式1至18中的任一者的珠粒撞击系统，其中所述珠粒是适用于裂解细菌、酵母、丝状真菌、孢子、植物细胞或动物细胞。
[0212]
20.根据实施方式1至19中的任一者的珠粒撞击系统，其中所述珠粒包含矿物质珠粒、陶瓷珠粒、玻璃珠粒、金属珠粒或其组合。
[0213]
21.根据实施方式20的珠粒撞击系统，其中所述珠粒包含锆珠粒、锆石珠粒、氧化锆珠粒、石英珠粒、氧化铝珠粒、碳化硅珠粒、陶瓷珠粒、二氧化硅玻璃珠粒、不锈钢珠粒、铬钢珠粒或其组合。
[0214]
22.根据实施方式1至21中的任一者的珠粒撞击系统，其中所述珠粒具有范围在50μm至3mm的直径。
[0215]
23.根据实施方式1至22中的任一者的珠粒撞击系统，其进一步包含置于该样本管的内腔内的乙二胺四乙酸(edta)和/或其钠盐。
[0216]
24.根据实施方式1至22中的任一者的珠粒撞击系统，其进一步包含置于该样本管的内腔内的肌酐。
[0217]
25.一种用于裂解液体样本中所含的细胞(例如以自所述细胞提取核酸)的方法，其包括在足以裂解所述细胞的条件下搅动在根据实施方式1至24中的任一者的珠粒撞击系统的样本管内的该液体样本。
[0218]
26.一种用于裂解含有外源性封阻剂的液体样本中所含的细胞(例如以自所述细胞提取核酸)的方法，其包括在裂解缓冲液和/或添加剂不存在下搅动在包含珠粒撞击管与珠粒的珠粒撞击系统内的该液体样本。
[0219]
27.一种用于裂解尚未以裂解缓冲液培养的液体样本中所含的细胞(例如以自所述细胞提取核酸)的方法，其包括搅动在包含珠粒撞击管与珠粒的珠粒撞击系统内的该液体样本与一种或多种封阻剂，任选其中该一种或多种封阻剂是存在于根据实施方式1至24中的任一者的珠粒撞击管中的封阻剂。
[0220]
28.根据实施方式26或实施方式27的方法，其中所述珠粒是适用于裂解细菌、酵母、丝状真菌、孢子、植物细胞或动物细胞。
[0221]
29.根据实施方式26至28中的任一者的方法，其中所述珠粒包含矿物质珠粒、陶瓷珠粒、玻璃珠粒、金属珠粒或其组合。
[0222]
30.根据实施方式29的方法，其中所述珠粒包含锆珠粒、锆石珠粒、氧化锆珠粒、石英珠粒、氧化铝珠粒、碳化硅珠粒、陶瓷珠粒、二氧化硅玻璃珠粒、不锈钢珠粒、铬钢珠粒或其组合。
[0223]
31.根据实施方式26至30中的任一者的方法，其中所述珠粒具有范围在50μm至3mm
的直径。
[0224]
32.根据实施方式25至26中的任一者的方法，其进一步包括于搅动该液体样本前将该液体样本放置在该样本管内的步骤。
[0225]
33.根据实施方式25或实施方式32的方法，其中该搅动包含使该珠粒撞击系统经受振荡运动。
[0226]
34.根据实施方式25至33中的任一者的方法，其中该样本是生物样本、环境样本或食物产品。
[0227]
35.根据实施方式34的方法，其中该样本是选自以下的生物样本：血液、血清、唾液、尿液、胃液、消化液、眼泪、粪便、精液、阴道分泌物、组织间隙液、源自肿瘤性组织的液体、眼液、汗液、黏液、耳垢、油、腺体分泌物、呼吸、脊髓液、毛发、指甲、皮肤细胞、血浆、自鼻拭子获得的液体、自鼻咽洗液获得的液体、脑脊液、组织样本、自喉拭子获得的液体或组织、自创伤拭子获得的液体或组织、活检组织、胎盘液、羊水、腹膜透析液、脐带血、淋巴液、腔液、痰、脓、微生物群、胎粪、母乳或将以上的任一项处理、提取或分离的样本。
[0228]
36.根据实施方式35的方法，其中该生物样本是尿液、痰或将尿液处理、提取或分离的样本。
[0229]
37.根据实施方式35的方法，其中该生物样本是痰或将痰处理、提取或分离的样本。
[0230]
38.根据实施方式35的方法，其中该生物样本是创伤拭子或将创伤拭子处理、提取或分离的样本。
[0231]
39.根据实施方式35的方法，其中该生物样本是血液或将血液处理、提取或分离的样本。
[0232]
40.根据实施方式35的方法，其中该生物样本是腹膜透析液或将腹膜透析液处理、提取或分离的样本。
[0233]
41.根据实施方式34的方法，其中该样本是选自以下的环境样本：土壤、地下水、地表水、废水或将以上的任一项处理、提取或分离的样本。
[0234]
42.根据实施方式25至41中的任一者的方法，其中所述细胞包含一种或多种病原体。
[0235]
43.根据实施方式42的方法，其中该一种或多种病原体包括一种或多种细菌病原体、病毒病原体、真菌病原体或其组合。
[0236]
44.根据实施方式42或实施方式43的方法，其中该一种或多种病原体包括以下的一种或多种：结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种、金黄色葡萄球菌、二甲氧苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(mrsa)、酿脓链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、流行性感冒嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、卡他摩氏菌、肺炎克留氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌属物种、百日咳博德氏杆菌、脑膜炎双球菌、炭疽杆菌、奴卡氏菌属物种、放线菌属物种、肺炎霉浆菌、肺炎披衣菌、退伍军人杆菌属物种、杰氏肺囊虫、a型流行性感冒病毒、细胞巨大病毒、鼻病毒、屎肠球菌、鲍氏不动杆菌、无霉菌酸棒状杆菌、产气肠杆菌、粪肠球菌ci 4413、萎垂沙雷氏菌、马链球菌和白色念珠菌。
[0237]
45.根据实施方式42的方法，其中该样本是痰或将痰处理、提取或分离的样本和该一种或多种病原体包括以下的一种或多种：结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、二甲氧苯青霉
素抗性金黄色葡萄球菌(mrsa)、酿脓链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、流行性感冒嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、卡他摩氏菌、肺炎克留氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌属物种、百日咳博德氏杆菌、脑膜炎双球菌、炭疽杆菌、奴卡氏菌属物种、放线菌属物种、肺炎霉浆菌、肺炎披衣菌、退伍军人杆菌属物种、杰氏肺囊虫、a型流行性感冒病毒、细胞巨大病毒和鼻病毒。
[0238]
46.根据实施方式45的方法，其中该一种或多种病原体包括结核分枝杆菌。
[0239]
47.根据实施方式42的方法，其中该样本是乳汁或精液或将乳汁、土壤、排泄物或精液处理、提取或分离的样本，和该一种或多种病原体包括鸟分枝杆菌副结核亚种。
[0240]
48.根据实施方式42的方法，其中该样本是创伤拭子或将创伤拭子处理、提取或分离的样本和该一种或多种病原体包括以下的一种或多种：大肠杆菌、铜绿假单胞菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克留氏菌、鲍氏不动杆菌、无霉菌酸棒状杆菌、产气肠杆菌、粪肠球菌ci 4413、萎垂沙雷氏菌、马链球菌与白色念珠菌。
[0241]
49.根据实施方式42的方法，其中该样本是腹膜透析液或将腹膜透析液处理、提取或分离的样本和该一种或多种病原体包括金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌。
[0242]
50.根据实施方式25至49中的任一者的方法，其中该液体样本包含来自多种物种的细胞。
[0243]
51.根据实施方式25至50中的任一者的方法，其进一步包括在细胞裂解后从该样本管回收该液体样本。
[0244]
52.根据实施方式51的方法，其进一步包括自所回收的液体样本纯化所述核酸。
[0245]
53.根据实施方式25至52中的任一者的方法，其进一步包括分析所述核酸的一种或多种。
[0246]
54.根据实施方式53的方法，其中该分析是使用微阵列或通过测序该一种或多种核酸来执行。
[0247]
55.根据实施方式53或实施方式54的方法，其中于执行该分析前靶序列被扩增。
[0248]
56.根据实施方式55的方法，其中该靶序列是通过pcr扩增。
[0249]
57.根据实施方式25至56中的任一者的方法，其中该核酸包含dna。
[0250]
58.根据实施方式25至57中的任一者的方法，其中该核酸包含rna。
[0251]
59.一种用于裂解液体样本中所含的细胞(例如以自所述细胞提取核酸)的试剂盒，其包含根据实施方式1至24中的任一者的珠粒撞击系统与任选的：(i)一种或多种用于制备该液体样本的组分、(ii)一种或多种用于扩增所述核酸的一种或多种的寡核苷酸、(iii)一种或多种用于检测所述核酸的一种或多种的探针或(iv)(i)至(ii)的任何组合。
[0252]
60.根据实施方式59的试剂盒，其包含一种或多种用于制备该液体样本的组分，和其中该一种或多种用于制备该液体样本的组分包含水、盐水、缓冲液、过滤器或其组合。
[0253]
61.根据实施方式59或实施方式60的试剂盒，其包含一种或多种用于扩增所述核酸的一种或多种的寡核苷酸。
[0254]
62.根据实施方式59至61中的任一者的试剂盒，其包含一种或多种用于检测所述核酸的一种或多种的探针。
[0255]
63.一种用于获得根据实施方式1至24中的任一者的珠粒撞击系统的试剂盒，其包含样本管、珠粒和干封阻试剂。
[0256]
64.根据实施方式63的试剂盒，其中所述珠粒和/或干封阻试剂是与该样本管分开地包含在该试剂盒中。
[0257]
65.根据实施方式63的试剂盒，其中所述珠粒和/或干封阻试剂是在该样本管内包含在该试剂盒中。
[0258]
66.根据实施方式63至65中的任一者的试剂盒，其进一步包含一种或多种用于制备含有供使用该珠粒撞击系统来提取核酸的用的细胞的样本的组分、一种或多种用于扩增一种或多种核酸的寡核苷酸、一种或多种用于检测一种或多种核酸的探针或其组合。
[0259]
67.一种珠粒撞击管(1)，其包含样本管，该样本管包含容器构件(2)，该容器构件(2)具有内腔(3)、孔洞(4)，该孔洞(4)是用于将潜在含有微生物的样本液(5)充至该内腔(3)中和封闭物(6)，该封闭物(6)是用于关闭该孔洞(4)，其中多个肉眼可见的矿物质颗粒(7)被布置于该内腔(3)中，其是适用于在该样本液(5)被充至该内腔(3)中和该珠粒撞击管(1)经受机械振荡时机械性地破坏该样本液中所含的微生物的细胞壁(5)，其特征在于包含尿素和/或至少一种胍盐和/或至少一种清洁剂的封阻剂(8)被以干燥形式布置于该样本管的内腔(3)中。
[0260]
68.根据实施方式67的珠粒撞击管(1)，其特征在于该封阻剂(8)包含脱氧腺苷单磷酸、脱氧鸟苷单磷酸、脱氧胞嘧啶单磷酸、脱氧胸苷单磷酸或此等单磷酸的至少二者的混合物。
[0261]
69.根据实施方式67或68的珠粒撞击管(1)，其特征在于该封阻剂(8)包含腺苷单磷酸、鸟苷单磷酸、胞嘧啶单磷酸、胸苷单磷酸或此等单磷酸的至少二者的混合物。
[0262]
70.根据实施方式67至69中的任一者的珠粒撞击管(1)，其特征在于至少一种该封阻剂(8)中所含的单磷酸是至少2个和至多120个核苷酸的寡核苷酸。
[0263]
71.根据实施方式67至70中的任一者的珠粒撞击管(1)，其特征在于该至少一种清洁剂包含十二烷基硫酸钠、月桂酰基硫酸肌胺酸钠和/或聚氧乙烯(20)去水山梨醇单月桂酸酯。
[0264]
72.根据实施方式67至71中的任一者的珠粒撞击管(1)，其特征在于该干燥封阻剂被松散地布置于该容器构件(2)的内腔(3)中，优选是呈粉末形式。
[0265]
73.根据实施方式67至72中的任一者的珠粒撞击管(1)，其特征在于该容器构件(2)的内壁是至少部分地以封阻剂的层或封阻剂的薄膜涂覆。
[0266]
74.根据实施方式67至73中的任一者的珠粒撞击管(1)，其特征在于伸乙二胺四乙(edta)酸和/或其钠盐被布置于该样本管的内腔(3)中。
[0267]
75.根据实施方式67至74中的任一者的珠粒撞击管(1)，其特征在于肌酐被布置于该样本管的内腔(3)中。
[0268]
76.一种根据实施方式67至75中任一者的珠粒撞击管(1)的用途，其是用于自微生物提取脱氧核糖核酸和/或核糖核酸。
[0269]
77.一种用于自微生物提取脱氧核糖核酸和/或核糖核酸的方法，其中提供被假定为含有所述微生物的样本液(5)，其中多个相对于彼此是可移动的矿物质颗粒(7)被导入至该样本液(5)中和该其中含有所述颗粒(7)的样本液(5)被振荡以使得所述颗粒(7)能够机械性地破坏该样本液中所含的微生物的细胞壁(5)，其特征在于包含尿素和/或至少一种胍盐和/或至少一种清洁剂的封阻剂(8)于所述颗粒(7)被振荡前和/或于所述颗粒(7)被振荡
时被导入该样本液(5)中。
[0270]
78.根据实施方式77的方法，其特征在于尿素的量是与该样本液(5)的量匹配以使得溶解于该样本液中的尿素的浓度(5)范围在10与100克每升之间，特别是在20与50克每升之间，和优选是在25与35克每升之间。
[0271]
79.根据实施方式77或78的方法，其特征在于在所述颗粒(7)被振荡前和/或于所述颗粒(7)被振荡时，以下单磷酸的至少一者被导入至该样本液(5)中：脱氧腺苷单磷酸、脱氧鸟苷单磷酸、脱氧胞嘧啶单磷酸、脱氧胸苷单磷酸。
[0272]
80.根据实施方式77至79中的任一者的方法，其特征在于在所述颗粒(7)被振荡前和/或于所述颗粒(7)被振荡时，以下单磷酸的至少一者被导入至该样本液(5)中：腺苷单磷酸、鸟苷单磷酸、胞嘧啶单磷酸、胸苷单磷酸。
[0273]
81.根据实施方式77至80中的任一者的方法，其特征在于肌酐和/或乙二胺四乙酸(edta)和/或其钠盐于所述颗粒(7)被振荡前和/或于所述颗粒(7)被振荡时被导入该样本液(5)中。
[0274]
9.文献的引用
[0275]
于本技术中引用的所有公开、专利、专利申请与其他文件在此为所有目的以其整体并入本文，其程度与每个个别公开、专利、专利申请或其他文件被个别指出是为所有目的并入本文相同。于一个或多个并入本文中的文献的教导内容与本文的公开内容之间有不一致的情况下，应使用本说明书的教导内容。
[0276]
9.1ep16153540的并入
[0277]
本发明是关于珠粒撞击管，其包含样本管，该样本管包含容器构件，该容器构件具有内腔、用于将含有微生物的样本液充至该内腔中的孔洞和用于关闭该孔洞的封闭物，其中多个肉眼可见的矿物质颗粒被布置于该内腔中，其等是适用于在该样本液被充至该内腔中和该撞击撞击管经受机械振荡时机械性地破坏该样本液中所含的微生物的细胞壁。本发明进一步是关于用于自微生物提取脱氧核糖核酸(dna)和/或核糖核酸(rna)的方法，其中样本液(其被假定为含有所述微生物)被提供，其中相对于彼此是可移动的多个矿物质颗粒被导入该样本液中和于其中含有所述颗粒的该样本液被振荡以使得所述颗粒能够机械性地破坏该样本液中所含的微生物的细胞壁。
[0278]
感染性疾病的遗传测试与诊断于临床微生物学的领域中扮演重要角色。为克服基于培养的方法学固有的偏差与限制，遗传测试越来越常被用于检测样本中所含的微生物。为了使这样的遗传测试可被执行，dna和/或rna首先必须以越高越好的浓度自微生物提取。于由zhongtang yu等人于“improved extraction of pcr-quality community dna from digesta and fecal samples”,biotechniques,vol.36,no.5,p.808-812(2004年5月)中提出的方法中，0.25g的取自母牛的胃肠系统的样本液被提供，其被假定为含有微生物，即细菌。该样本液首先与1ml的含有500mm氯化钠、50mm tris盐酸盐，ph 8.0、50mm乙二胺四乙酸和4％十二烷基硫酸钠的缓冲液混合。此外，0.4g无菌锆石珠粒被导入该样本液中。所获得的混合物随后于样本管中以mini-beadbeater
tm
振荡三分钟，使得珠粒破坏微生物的细胞壁。于此程序中，细胞所含的dna被释放。该缓冲液还可用于保护dna免于被样本液中所含的dna酶降解。
[0279]
于执行该珠粒撞击后，杂质是通过以醋酸铵沉淀来自样本移除。核酸是通过以异
丙醇沉淀来获得。于进一步方法步骤中，dna是依序以rna酶与蛋白酶k消化并随后以管柱纯化。
[0280]
该方法有以下不利：其是相对复杂的。因为样本液由于该缓冲液的添加而被稀释，样本中的dna浓度减低。因此，该方法仅允许有限的检测正确性与敏感性。
[0281]
因此靶为提供开头提及的类型的珠粒撞击管与方法，其使脱氧核糖核酸和/或核糖核酸可自样本液中所含的微生物快速地并以足以用于检测的量提取。
[0282]
有关撞击撞击管，此靶是利用以下描述的实施方式1’的特征解决。其等规定包含尿素和/或至少一种胍盐和/或至少一种清洁剂的封阻试剂被以干燥形式布置于该样本管的内腔中。
[0283]
令人意外地，结果是当使用这样的撞击撞击管以自样本液中所含的微生物提取脱氧核糖核酸(dna)和/或核糖核酸(rna)时，相较于当使用不含有该封阻试剂的相应珠粒撞击管时，可实现较大的dna和/或rna提取率。假定该封阻试剂封阻该样本管的内腔中所含的矿物质颗粒的结合位置和因此预防自所述微生物提取的dna和/或rna与此等结合位置结合。于自该样本液移除所述颗粒后(其可例如被执行以使得沉淀于该样本管的底部的所述颗粒与位于所述颗粒上面的该样本液被以移液管或类似者自该样本管移出)，该样本管中所含的dna和/或rna的相对大部分会随后造成该样本液。该至少一种清洁剂封阻位于该样本管的内壁的结合位置至与预防核糖核(rna)酸和/或脱氧核糖核酸(dna)与此等结合位置结合。此还会使dna和/或rna的高提取率成为可能。
[0284]
由于该封阻试剂的存在，甚至可能可不需于珠粒撞击前以提取缓冲液稀释该样本液。于此实例中，该样本液仅被可于该样本液中以比通常于提取缓冲液中者低相当多的浓度存在的封阻试剂稀释。
[0285]
矿物质颗粒是结晶颗粒、陶瓷颗粒和/或玻璃。当其等被布置于该样本液中时，所述颗粒相对于彼此是可移动的。所述颗粒优选包含石英颗粒和/或锆石颗粒。这样的颗粒可便宜地以大量获得和对于脱氧核糖核酸或核糖核酸而言是化学惰性的。石英和/或颗粒具有相对高的比重，是坚硬的和可具有锐边。因此，其等在暴露至机械震动时极适合用于打开细胞膜。
[0286]
该干封阻试剂优选是长期稳定的，即该珠粒撞击管可被无问题地运输与储存一段较长的时期而该封阻试剂的封阻性功效不会减少相当大。该干封阻试剂可被松散地布置于该容器构件的内腔内，和/或该容器构件的内壁可以该封阻试剂的层或该封阻试剂的薄膜涂覆。该封阻试剂优选是经冷冻干燥。
[0287]
使用根据本发明的珠粒撞击管，以下者是可能的：使用本身已知的方法以足以直接微生物地检查dna和/或rna的浓度自该样本液中所含的微生物提取该dna和/或rna。此可特别通过以下者发生：将该样本液与固定在表面上的受体接触，所述受体特异性地与该dna和/或rna结合和/或与其中所含的dna和/或rna组分结合。该dna和/或rna和/或dna和/或rna组分与所述受体的结合可使用本身已知的方式以标记(特别是光学标记，诸如荧光染料)检测和若需要定量。
[0288]
该至少一种胍盐优选包含异氰酸胍和/或氯化胍。
[0289]
于本发明的优选实施方式中，该封阻试剂包含脱氧腺苷单磷酸、脱氧鸟苷单磷酸、脱氧胞嘧啶单磷酸、脱氧胸苷单磷酸或此等单磷酸的至少二者的混合物。此等单磷酸可封
阻脱氧核糖核酸(dna)可与的结合的所述颗粒的结合位置。
[0290]
于本发明的优选实施方式中，该封阻试剂包含腺苷单磷酸、鸟苷单磷酸、胞嘧啶单磷酸、胸苷单磷酸或此等单磷酸的至少二者的混合物。此等单磷酸可封阻核糖核酸(rna)可与的结合的所述颗粒的结合位置。核糖核酸比脱氧核糖核酸容易降解和因此较适用于样本制备。
[0291]
若该封阻试剂中所含的至少一单磷酸是至少2个和至多120个的寡核苷酸(例如rna和/或dna核苷酸)，则其是有益的。该至少一单磷酸随即是易于合成地产生。
[0292]
于本发明的便利的实施方式中，该至少一种清洁剂包含十二烷基硫酸(dodecylsulafte)钠、月桂酰基硫酸肌胺酸钠和/或聚氧乙烯-(20)-去水山梨醇单月桂酸酯。聚氧乙烯-(20)-去水山梨醇单月桂酸酯还以聚山梨糖醇酯20为人所知。此封阻位于该样本管的内壁的结合位置至与预防核糖核酸和/或脱氧核糖核酸与此等结合位置结合。
[0293]
于本发明的有利实施方式中，该干燥封阻试剂是松散地布置于该容器构件的内腔中，优选是呈粉末形式。该粉末可与所述颗粒混合。
[0294]
于本发明的优选实施方式中，该容器构件的内壁至少部分地以该封阻试剂的层或该封阻试剂的薄膜涂覆。该封阻试剂随后捕捉性地与该容器构件连接。
[0295]
若肌酐被布置于该样本管的内腔中，则其是有利的。于该样本管的内腔中肌酐的存在对该样本液中所含的脱氧核糖核酸和/或核糖核酸的降解起反作用。此外，肌酐预防该dna和/或rna非特异性地与所述珠粒和/或该样本管的内壁结合。此在使用该珠粒撞击管自该样本液中所含的微生物提取dna和/或rna时使较大的产率成为可能。
[0296]
于本发明的便利的实施方式中，乙二胺四乙酸和/或其钠盐被布置于该样本管的内腔中。乙二胺四乙酸与钙、镁及铁结合和因此使脱氧核糖核酸酶与核糖核酸酶失活。此方法还对该样本液中所含的脱氧核糖核酸与核糖核酸的降解起反作用。因此，测量结果的较高的检测敏感性与再现性在检查使用根据本发明的珠粒撞击管自微生物提取的脱氧核糖核酸和/或核糖核酸的期间成为可能。
[0297]
有关该方法，以上提及的靶是以实施方式11’的特征解决。其等规定包含尿素、至少一种胍盐和/或至少一种清洁剂的封阻试剂于所述颗粒被振荡前和/或被振荡时被导入该样本液中。
[0298]
于本发明的优选实施方式中，尿素的量是与该样本液的量匹配以使得溶解于该样本液中的尿素的浓度范围在-介于10与100克每升之间，特别是-介于20与50克每升之间，和优选是-介于25与35克每升之间。
[0299]
此在提取该脱氧核糖核酸和/或该核糖核酸时使高产率成为可能。
[0300]
于本发明的优选实施方式中，清洁剂的量是与该样本液的量匹配以使得溶解于该样本液中的清洁剂的浓度是介于1与50mg/ml之间。
[0301]
于以下，本发明的实施方式会通过附图详细解释。
[0302]
于图1至3中以1指称的珠粒撞击管包含样本管，其包含容器构件2，该容器构件2具有内腔3与可封闭的孔洞4。该样本管优选是由塑料构成，但还可由另一生物惰性材料构成。
[0303]
被假定为含有微生物的样本液5可透过该孔洞4充至该容器构件2的内腔3中与自其移除。对于关闭该孔洞4，该样本管具有封闭物6，其适用于转运至开口位置与封闭位置和被设计成封闭盖，其包含内螺纹，其适用于旋拧上由该样本管2的外壁的边缘区域提供的外
螺纹，其与该孔洞4结合。
[0304]
于该内腔3中，2克的二氧化硅被进一步布置，其包含多个颗粒7，其最大尺寸平均是大约100μm。所述珠粒7可以松散的团块的形式获得，于其中其等相对于彼此是可移动的。代替该等二氧化硅的颗粒7或除了其等外，该内腔3中还可含有适当尺寸的锆颗粒。
[0305]
当该样本液5被充至该内腔中和该珠粒撞击管经受机械振荡(例如超声振荡)时，所述颗粒7可用于机械性地破坏该样本液5中所含的微生物的细胞壁。其等可以未于附图中以细节阐明的振荡产生器产生和可转传至该珠粒撞击管1。这样的振荡产生器是商业上可自mp biomedicals以mpbio珠粒撞击器的名购得。由于细胞壁的破坏，所述微生物中所含的脱氧核糖核酸被释放并溶解于该样本液5中。
[0306]
于该管1的内腔3中，经冷冻干燥封阻试剂8还被布置，其是如下制备：提供5毫克乙二胺四酸的四钠盐(na4-edta)、25毫克腺苷单磷酸、25毫克鸟苷单磷酸、25毫克胞嘧啶单磷酸、25毫克胸苷单磷酸与15mg月桂酰肌胺酸钠。为使此等统治者稳定，将其等以5x的浓度溶解于te缓冲液中。为了溶解度的原因，使用乙二胺四酸的四钠盐，因为其良好地溶于水中。1毫升随即由250毫克尿素、25毫克乙二胺四酸的四钠盐、125毫克腺苷单磷酸、125毫克鸟苷单磷酸、125毫克胞嘧啶单磷酸、125毫克胸苷单磷酸及75mg月桂酰肌胺酸钠组成。
[0307]
将200微升的此溶液置于该容器构件2中并通过真空干燥。该经干燥中封阻试剂8稳定至少一年。如可于图4中看到的，该封阻试剂8被施用在该容器构件2的内壁上，呈于内腔3的较低部分区域中的薄层，其与该孔洞4在空间上分开。
[0308]
实施方式：
[0309]
通过0,4微米无菌过滤器过滤6毫升尿液与腹膜透析液并随后添加10.000菌落形成单位每毫升于培养实验室中生长的金黄色葡萄球菌。
[0310]
本发明的方法：
[0311]
将2.9毫升的经掺加尿液与经掺加腹膜透析液转移至以上描述的管1中。以螺旋盖6密封该管并将其夹在mpbio珠粒撞击器中并以全功率运行30秒。移除封闭物6并放置在商业dna分离装置的样本架上。取出2毫升的各样本并随后添加dna提取剂(labturbo)并执行dna提取。产生100微升的dna提取物。
[0312]
标准方法：
[0313]
将2,9毫升的经掺加尿液与经掺加腹膜透析液转移至管子中以用于使用2,0克的100微米硅石(sio2)珠粒来珠粒撞击。该管不含有该封阻试剂8和无添加其他试剂。通过封闭物密封该管并将其夹在mpbio珠粒撞击器中并以全功率运行30秒。移除该封闭物并放置在商业dna分离装置的样本架上。取出2毫升的各样本并随后添加dna提取剂(labturbo)并执行dna提取。产生100微升的dna提取物。
[0314]
所提取的dna的检测
[0315]
所提取的金黄色葡萄球菌dna的量是通过实时聚合酶链式反应根据以下者测定：gillespie,g.e.等人，"simultaneous detection of mastitis pathogens,staphylococcus aureus,streptococcus uberis,and streptococcus agalactiae by multiplex real-time polymerase chain reaction",j.dairy sci.88：3510-3518(2005)。于20微升反应中扩增1微升的所提取dna。该标准方法对于尿液产生32的循环阈值和对于腹膜透析液产生38的循环阈值，显示差的dna回收。
[0316]
本发明的方法对于尿液产生31的循环阈值和对于腹膜透析液产生32的循环阈值，显示在此等条件下对于腹膜透析液有远优选的回收。
[0317]
本文的公开内容是通过以下特殊实施方式例示。
[0318]1’
.一种珠粒撞击管(1)，其包含样本管，该样本管包含容器构件(2)，该容器构件(2)具有内腔(3)、孔洞(4)，该孔洞(4)是用于将潜在含有微生物的样本液(5)充至该内腔(3)中和封闭物(6)，该封闭物(6)是用于关闭该孔洞(4)，其中多个肉眼可见的矿物质颗粒(7)被布置于该内腔(3)中，其是适用于在该样本液(5)被充至该内腔(3)中与该珠粒撞击管(1)经受机械振荡时机械性地破坏该样本液(5)中所含的微生物的细胞壁，其特征在于包含以下的封阻试剂(8)被以干燥形式布置于该样本管的内腔(3)中-尿素和/或-至少一种胍盐和/或-至少一种清洁剂。
[0319]2’
.根据实施方式1’的珠粒撞击管(1)，其特征在于该封阻试剂(8)包含-脱氧腺苷单磷酸、-脱氧鸟苷单磷酸、-脱氧胞嘧啶单磷酸、-脱氧胸苷单磷酸或此等单磷酸的至少二者的混合物。
[0320]3’
.根据实施方式1’或2’的珠粒撞击管(1)，其特征在于该封阻试剂(8)包含-腺苷单磷酸、-鸟苷单磷酸、-胞嘧啶单磷酸、-胸苷单磷酸或此等单磷酸的至少二者的混合物。
[0321]4’
.根据实施方式1’至3’中的任一者的珠粒撞击管(1)，其特征在于该封阻试剂(8)中所含的至少一种单磷酸是至少2个和至多120个核苷酸的寡核苷酸。
[0322]5’
.根据实施方式1’至4’中的任一者的珠粒撞击管(1)，其特征在于该至少一种清洁剂包含十二烷基硫酸钠、月桂酰基硫酸肌胺酸钠和/或聚氧乙烯-(20)-去水山梨醇单月桂酸酯。
[0323]6’
.根据实施方式1’至5’中的任一者的珠粒撞击管(1)，其特征在于该干燥封阻试剂被松散地布置于该容器构件(2)的内腔(3)中，优选是呈粉末形式。
[0324]7’
.根据实施方式1’至6’中的任一者的珠粒撞击管(1)，其特征在于该容器构件(2)的内壁是至少部分地以该封阻试剂的层或该封阻试剂的薄膜涂覆。
[0325]8’
.根据实施方式1’至7’中的任一者的珠粒撞击管(1)，其特征在于乙二胺四乙酸和/或其钠盐被布置于该样本管的内腔(3)中。
[0326]9’
.根据实施方式1’至8’中的任一者的珠粒撞击管(1)，其特征在于肌酐被布置于该样本管的内腔(3)中。
[0327]
10’.一种根据实施方式1’至9’中的任一者的珠粒撞击管(1)的用途，其是用于自微生物提取脱氧核糖核酸和/或核糖核酸。
[0328]
11’.一种用于自微生物提取脱氧核糖核酸和/或核糖核酸的方法，其中提供被假定为含有所述微生物的样本液(5)，其中多个相对于彼此是可移动的矿物质颗粒(7)被导入至该样本液(5)中和该其中含有所述颗粒(7)的样本液(5)被振荡以使得所述颗粒(7)能够机械性地破坏该样本液中所含的微生物的细胞壁(5)，其特征在于包含以下的封阻试剂(8)于所述颗粒(7)被振荡前和/或于所述颗粒(7)被振荡时被导入该样本液(5)中-尿素和/或-至少一种胍盐和/或-至少一种清洁剂。
[0329]
12’.根据实施方式11’的方法，其特征在于尿素的量是与该样本液(5)的量匹配以使得溶解于该样本液(5)中的尿素的浓度范围-在10与100克每升之间，特别是-在20与50克每升之间，和优选是-在25与35克每升之间。
[0330]
13’.根据实施方式11’或12’的方法，其特征在于在所述颗粒(7)被振荡前和/或于所述颗粒(7)被振荡时，以下单磷酸的至少一者被导入至该样本液(5)中：-脱氧腺苷单磷酸、-脱氧鸟苷单磷酸、-脱氧胞嘧啶单磷酸、-脱氧胸苷单磷酸。
[0331]
14’.根据实施方式11’至13’中的任一者的方法，其特征在于在所述颗粒(7)被振荡前和/或于所述颗粒(7)被振荡时，以下单磷酸的至少一者被导入至该样本液(5)中：-腺苷单磷酸、-鸟苷单磷酸、-胞嘧啶单磷酸、-胸苷单磷酸。
[0332]
15’.根据实施方式11’至14’中的任一者的方法，其特征在于肌酐和/或乙二胺四乙酸和/或其钠盐于所述颗粒(7)被振荡前和/或于所述颗粒(7)被振荡时被导入该样本液(5)中。

技术特征：
1.一种用于自液体样本中所含的细胞产生裂解产物的方法，其包括在裂解缓冲液不存在下和在一种或多种封阻剂存在下在足以裂解所述细胞的条件下搅动珠粒撞击系统内的所述液体样本，所述珠粒撞击系统包含珠粒撞击管与珠粒。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述液体样本含有内源性封阻剂。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述搅动是在添加剂不存在下实现。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种封阻剂对所述液体样本而言是外源性。5.根据权利要求2或4所述的方法，其中所述珠粒：a)是适用于裂解细菌、酵母、丝状真菌、孢子、植物细胞或动物细胞；b)包含：i.矿物质珠粒、陶瓷珠粒、玻璃珠粒、金属珠粒或其组合；ii.锆珠粒、锆石珠粒、氧化锆珠粒、石英珠粒、氧化铝珠粒、碳化硅珠粒、陶瓷珠粒、二氧化硅玻璃珠粒、不锈钢珠粒、铬钢珠粒或其组合；c)具有范围在50μm至3mm的直径；或d)a)-c)的任何组合。6.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其进一步包括于搅动所述液体样本前将所述液体样本放置在样本管内的步骤。7.根据权利要求1至6中的任一项所述的方法，其中所述搅动包含使所述珠粒撞击系统经受振荡运动。8.根据权利要求1至7中的任一项所述的方法，其中所述样本是生物样本、环境样本或食物产品。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述样本是选自以下的生物样本：血液、血清、唾液、尿液、胃液、消化液、眼泪、粪便、精液、阴道分泌物、组织间隙液、源自肿瘤性组织的液体、眼液、汗液、黏液、耳垢、油、腺体分泌物、呼吸、脊髓液、毛发、指甲、皮肤细胞、血浆、自鼻拭子获得的液体、自鼻咽洗液获得的液体、脑脊液、组织样本、自喉拭子获得的液体或组织、自创伤拭子获得的液体或组织、活检组织、胎盘液、羊水、腹膜透析液、脐带血、淋巴液、腔液、痰、脓、微生物群、胎粪、母乳或将以上的任一项处理、提取或分离的样本。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述生物样本是：a)尿液、痰或将尿液处理、提取或分离的样本；b)痰或将痰处理、提取或分离的样本；c)创伤拭子或将创伤拭子处理、提取或分离的样本；d)血液或将血液处理、提取或分离的样本；或e)腹膜透析液或将腹膜透析液处理、提取或分离的样本。11.根据权利要求8所述的方法，其中所述样本是选自以下的环境样本：土壤、地下水、地表水、废水或将以上的任一项处理、提取或分离的样本。12.根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中所述细胞包含一种或多种病原体。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种病原体包括：a)一种或多种细菌病原体、病毒病原体、真菌病原体或其组合；或
b)结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、鸟分枝杆菌副结核亚种(mycobacterium avium subsp paratuberculosis)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、二甲氧苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(mrsa)、酿脓链球菌(streptococcus pyogeues)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(streptococcus agalactiae)、流行性感冒嗜血杆菌(haemophilus influenzae)、副流感嗜血杆菌(haemophilus parainfuluezae)、卡他摩氏菌(moraxella catarrhalis)、肺炎克留氏菌(klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌(escherichia coli)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、不动杆菌属(acinetobacter)物种、百日咳博德氏杆菌(bordetella pertussis)、脑膜炎双球菌(neisseria meningitidis)、炭疽杆菌(bacillus anthracis)、奴卡氏菌属(nocardia)物种、放线菌属(actinomyces)物种、肺炎霉浆菌(mycoplasma pneumoniae)、肺炎披衣菌(chlamydia pneumonia)、退伍军人杆菌属(legionella)物种、杰氏肺囊虫(pneumocystis jiroveci)、a型流行性感冒病毒、细胞巨大病毒、鼻病毒、屎肠球菌(enterococcus faecium)、鲍氏不动杆菌(acinetobacter baumannii)、无霉菌酸棒状杆菌(corynebacterium amycolatum)、产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)ci 4413、萎垂沙雷氏菌(serratia marcescens)、马链球菌(streptococcus equi)和白色念珠菌(candida albicans)的一种或多种。14.根据权利要求12所述的方法，其中所述样本是痰或将痰处理、提取或分离的样本并且所述一种或多种病原体包括以下的一种或多种：结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、二甲氧苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(mrsa)、酿脓链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、流行性感冒嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、卡他摩氏菌、肺炎克留氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌属物种、百日咳博德氏杆菌、脑膜炎双球菌、炭疽杆菌、奴卡氏菌属物种、放线菌属物种、肺炎霉浆菌、肺炎披衣菌、退伍军人杆菌属物种、杰氏肺囊虫、a型流行性感冒病毒、细胞巨大病毒和鼻病毒。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种病原体包括结核分枝杆菌。16.根据权利要求12所述的方法，其中所述样本是乳汁或精液或将乳汁、土壤、排泄物或精液处理、提取或分离的样本，和所述一种或多种病原体包括鸟分枝杆菌副结核亚种。17.根据权利要求12所述的方法，其中所述样本是创伤拭子或将创伤拭子处理、提取或分离的样本并且所述一种或多种病原体包括以下的一种或多种：大肠杆菌、铜绿假单胞菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克留氏菌、鲍氏不动杆菌、无霉菌酸棒状杆菌、产气肠杆菌、粪肠球菌ci 4413、萎垂沙雷氏菌、马链球菌与白色念珠菌。18.根据权利要求12所述的方法，其中所述样本是腹膜透析液或将腹膜透析液处理、提取或分离的样本并且所述一种或多种病原体包括金黄色葡萄球菌和/或铜绿假单胞菌。19.根据权利要求1至18中的任一项所述的方法，其中所述液体样本包含来自多种物种的细胞。20.根据权利要求1至19中的任一项所述的方法，其进一步包括在细胞裂解后自所述样本管回收所述裂解产物，和任选进一步包括自所述裂解产物纯化核酸。21.根据权利要求1至20中的任一项所述的方法，其进一步包括分析所述核酸的一种或多种，任选地其中：a)所述分析是使用微阵列或通过测序所述一个或多个核酸来执行；
b)于执行所述分析前扩增靶序列，其任选通过pcr进行。22.根据权利要求1-21所述的方法，其中所述核酸包含dna和/或rna。23.一种珠粒撞击系统，其包含(i)样本管，其具有可透过孔洞进入的内腔，(ii)珠粒，和(iii)干封阻剂，其中所述珠粒与干封阻剂是位于所述样本管的内腔内。24.根据权利要求23所述的珠粒撞击系统，其中所述封阻剂包括：a)一种或多种离散剂(chaotropic agent)、肌酐、一种或多种核苷酸、一种或多种寡核苷酸或其组合；b)一种或多种离散剂，包括尿素、一种或多种胍盐、一种或多种锂盐、一种或多种镁盐、一种或多种清洁剂或其组合；c)一种或多种胍盐，包括异氰酸胍、氯化胍或其组合；d)一种或多种锂盐，包括过氯酸锂、醋酸锂或其组合；e)包含氯化镁；f)一种或多种清洁剂，包括十二烷基硫酸钠、月桂酰基硫酸肌胺酸钠(sodium lauroylsulfate sarcosinate)、聚氧乙烯(20)去水山梨醇单月桂酸酯或其组合；g)一种或多种核苷酸，包括天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸或其组合；h)一种或多种天然存在的脱氧核糖核苷酸、一种或多种天然存在的核糖核苷酸或其组合；i)一种或多种脱氧核糖核苷酸，包括脱氧腺苷单磷酸、脱氧鸟苷单磷酸、脱氧胞嘧啶单磷酸、脱氧胸苷单磷酸或其组合；j)一种或多种核糖核苷酸，包括腺苷单磷酸、鸟苷单磷酸、胞嘧啶单磷酸、胸苷单磷酸或其组合；k)一种或多种寡核苷酸，包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物或其组合；或l)一种或多种寡核苷酸，其各自独立是2至120个核苷酸长、2至100个核苷酸长、2至50个核苷酸长、2至25个核苷酸长、5至40个核苷酸、2至15个核苷酸长、8至120个核苷酸长、8至80个核苷酸长、10至100个核苷酸长、15至50个核苷酸长、50至100个核苷酸长或100至120个核苷酸长，任选其中所述寡核苷酸包含dna和/或rna。25.根据权利要求23或24所述的珠粒撞击系统，其中所述样本管的内腔是以所述封阻剂的层或薄膜至少部分地涂覆。26.根据权利要求23或24所述的珠粒撞击系统，其中所述珠粒中的一些或全部是以所述封阻剂的层或薄膜部分地或完全地涂覆。27.根据权利要求23或24所述的珠粒撞击系统，其包含含有所述封阻剂的粉末，其任选是含有所述封阻剂的经冷冻干燥的粉末。28.根据权利要求23至27中的任一项所述的珠粒撞击系统，其中所述珠粒：a)是适用于裂解细菌、酵母、丝状真菌、孢子、植物细胞或动物细胞；b)包含：i.矿物质珠粒、陶瓷珠粒、玻璃珠粒、金属珠粒或其组合；或ii.锆珠粒、锆石珠粒、氧化锆珠粒、石英珠粒、氧化铝珠粒、碳化硅珠粒、陶瓷珠粒、二氧化硅玻璃珠粒、不锈钢珠粒、铬钢珠粒或其组合；
c)具有范围在50μm至3mm的直径；或d)a)-c)的任何组合。29.根据权利要求23至28中的任一项所述的珠粒撞击系统，其进一步包含：a)位于所述样本管的内腔内的乙二胺四乙酸(edta)和/或其钠盐；和/或b)位于所述样本管的内腔内的肌酐。30.一种用于裂解液体样本中所含的细胞的方法，其包括在足以裂解所述细胞的条件下搅动在根据权利要求23至29中的任一项所述的珠粒撞击系统的样本管内的所述液体样本。31.一种用于裂解液体样本中所含的细胞的试剂盒，其包含(i)根据权利要求23至29中的任一项所述的珠粒撞击系统与(ii)一种或多种用于制备所述液体样本的组分、一种或多种用于扩增所述核酸的一种或多种的寡核苷酸、一种或多种用于检测所述核酸的一种或多种的探针或其组合，任选其中所述一种或多种用于制备所述液体样本的组分包含水、盐水、缓冲液、过滤器或其组合。32.一种用于获得根据权利要求23至29中的任一项所述的珠粒撞击系统的试剂盒，其包含样本管、珠粒和干封阻试剂，任选地(i)其中所述珠粒和/或干封阻试剂是与所述样本管分开地包含在所述试剂盒中，或(ii)其中所述珠粒和/或干封阻试剂是在所述样本管内包含在所述试剂盒中。

技术总结
本文的公开内容提供用于珠粒撞击的改良方法和可用于其的珠粒撞击系统。所述珠粒撞击系统包含样本管、珠粒和干封阻剂，以及使用所述珠粒撞击系统以自含有核酸的细胞提取核酸的方法。的方法。的方法。


技术研发人员：H
受保护的技术使用者：保障生物系统控股有限公司
技术研发日：2017.01.30
技术公布日：2023/9/7