一种重组贻贝粘蛋白及其制备方法

一种重组贻贝粘蛋白及其制备方法
1.技术领域
2.本发明涉及贻贝粘蛋白，具体地说，涉及一种重组贻贝粘蛋白及其制备方法。


背景技术：

3.海洋贻贝属于软体动物门瓣鳃纲，大多数隶属贻贝科（mytilidae），是沿岸和近海中普遍存在的一种生物。其足丝腺能分泌足丝并在足丝末端形成一个粘附盘附着于基体，使贻贝能在巨浪冲刷下仍紧紧附着于基体。这种粘附盘的主要成分是贻贝粘蛋白（mussel adhesive protein, map；也称贻贝足丝蛋白mussel footprotein，mfp）它具有高强度、高韧性和防水性，其粘度超过绝大多数的粘胶，具有广泛的应用前景：临床方面可用于粘接断裂骨骼、修复牙裂、粘合软组织、修复皮肤创伤等；也可做为细胞培养的吸附介质；在海水设备的防水、抗菌和密封等水下作业方面也存在潜在的应用价值。
4.maps 都是带正电的碱性蛋白，其等电点（pi）在 8～11 之间，含有高丰度的3,4-二羟基苯丙氨酸（多巴，dopa），是酪氨酸残基的羟基化形式。多巴作为邻羟基酚类衍生物，可以通过非共价键和共价键与多种基材表面键合，形成很强的粘附力。同时，多巴的氧化还原态对map粘附性能有很大影响，还原态的多巴与无机表面有很强的键合力。设计原位固化材料和粘附生物底物时则需要氧化态的多巴醌。
5.迄今为止，已经鉴定出与黏附功能相关的 6 种类型的贻贝粘蛋白，map-1 ~ map-6 蛋白，它们显示出功能的定位性并执行不同的功能。其中，map-1、map-3和map-5是主要的粘附功能分子。map-1是最早发现和研究最多的贻贝粘蛋白，其分子结构具有类似的十肤重复序列，其中的多巴是发挥粘附活性的结构基础。map-3在六种粘附蛋白中拥有最小的分子量，但其多巴含量较高，因此能直接附着于介质表面，产生强的表面相互作用。map-5是所有贻贝粘蛋白中多巴含量最高的，同时还带有较高的正电荷，是贻贝足丝粘胶界面的关键蛋白之一。
6.目前贻贝粘蛋白主要仍然依靠提取的获得，产量和效率极低，而天然的map-1，map-3和map-5序列重组表达、纯化等都存在表达量低、纯化得率较低等难以实现工业化的问题（【1】silverman h g , ff roberto. cloning and expression of recombinant adhesive protein mefp-1 of the blue mussel, mytilus edulis: us,us6987170 b1[p]. 2006. 【2】dong s h , gim y , cha h j . expression of functionalrecombinant mussel adhesive protein type 3a in escherichia coli[j]. biotechnolprog, 2010, 21(3). 【3】hwang ds, yoo hj, jun jh, moon wk, cha hj. expression of functional recombinant mussel adhesive protein mgfp-5 in escherichia coli.applenviron microbiol. 2004;70:3352
–
3359. 【4】吕玉伟,吕亚维,杨泽熵,王睿劼,张雨靖,王英娟.贻贝蛋白mgfp-5的原核表达与纯化[j].西北大学学报(自然科学版),2016,46(03):390-396. 【5】吕亚维,王睿劼,张雨靖,高文英,杨泽滳,王英娟.
重组贻贝黏蛋白mgfp-5的表达及功能评价[j].基因组学与应用生物学,2017,36(10):4108-4115.）。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是克服天然贻贝粘蛋白提取得率低、成本高，重组贻贝粘蛋白表达量低、纯化困难且体外羟化率低粘性不佳的问题，提供一种表达水平高、羟化率高、纯化较简单、粘性高等的重组贻贝粘蛋白的制备方法。
[0008]
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种重组贻贝粘蛋白的制备方法，包括如下步骤：（1）制备bl21（de3）/ rmfp151感受态细胞；（2）rmfp151与酪氨酸酶（tyr）及其辅助因子（orf438）的共表达（共表达的rmfp151蛋白后文简称为co-rmfp151蛋白）；（3）co-rmfp151蛋白的纯化及co-rmfp151蛋白中酪氨酸的羟化鉴定；与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：（1）基于现有天然贻贝粘蛋白提取和重组贻贝粘蛋白表达纯化存在的问题，本发明从基因和蛋白序列出发进行设计，包含紫贻贝mefp-1肽段和厚壳贻贝mcfp5，该肽段包含了较高丰度的酪氨酸，同时在结构稳定性上也较高。此外，本发明在c端加入六聚组氨酸标签，方便后续的鉴定和纯化，最终得到贻贝粘蛋白新分子rmfp151。用protparam tool对fp151和rmfp151进行稳定性预测，结果表明，rmfp151的不稳定系数为37.18较现有分子fp151的44.19（》40为不稳定，《40为稳定）明显降低，结构稳定。
[0009]
（2）在表达上，本发明采用共表达酪氨酸酶（tyr）及其辅助因子（orf437）的胞内修饰方案。将rmfp151、tyr和orf438三个基因按e.coli密码子偏好进行优化，选用pacycduet1双表达框质粒表达酪氨酸酶（tyr）及其辅助因子（orf438），pet20b表达rmfp151蛋白，最终构建为双质粒表达系统，在bl21(de3)中实现对co-rmfp151（co-expression rmfp151）的高表达。500ml摇瓶（普通锥形瓶）规模诱导3.5h，co-rmfp151蛋白表达量即可达到菌体总蛋白的37.5%，ni亲和层析串联g25纯化后目的蛋白得率为70-80mg/l，hplc纯度达到94.69%。发酵罐5l培养，co-rmfp151蛋白纯化后得率为250-300mg/l。
[0010]
（3）本发明提供了一套完整的重组表达rmfp-151蛋白的工艺，从工程大肠杆菌的构建、发酵到纯化及鉴定，详细公开了每一步骤的具体操作和参数，工艺稳定。采用ni亲和层析色谱串联g25对重组co-rmfp-151蛋白进行纯化，最终可以获得纯度达到90%以上的目的蛋白。co-rmfp-151蛋白浓溶液可在室温下固化，完成对粘接物体的粘合。
附图说明
[0011]
图1为rmfp151表达条件优化图；1、未诱导；m、蛋白质分子量标准(14.4-116kd, 非预染)；2、37℃ 1.0mm iptg诱导3.5h；3、37℃ 0.5mm iptg诱导3.5h；4、37℃ 0.25mm iptg诱导3.5h；5、37℃ 0.1mm iptg诱导3.5h；6、30℃ 1.0mm iptg诱导6h；7、30℃ 0.5mm iptg诱导6h；8、30℃ 0.25mm iptg诱导6h；9、30℃ 0.1mm iptg诱导6h；10、20℃ 1.0mm iptg诱导过夜；11、20℃ 0.5mm iptg诱导过夜；12、20℃ 0.25mm iptg诱导过夜；13、20℃ 0.1mm iptg诱导过夜。
[0012]
图2为rmfp151表达条件优化结果的灰度分析图；1、未诱导；m、蛋白质分子量标准(14.4-116kd, 非预染)；2、37℃ 1.0mm iptg诱导3.5h；3、37℃ 0.5mm iptg诱导3.5h；4、37℃ 0.25mm iptg诱导3.5h；5、37℃ 0.1mm iptg诱导3.5h；6、30℃ 1.0mm iptg诱导6h；7、30℃ 0.5mm iptg诱导6h；8、30℃ 0.25mm iptg诱导6h；9、30℃ 0.1mm iptg诱导6h图3为co-rmfp151表达条件优化图；1、未诱导；m、蛋白质分子量标准(14.4-116kd, 非预染)；2、37℃ 1.0mm iptg诱导3.5h；3、37℃ 0.5mm iptg诱导3.5h；4、37℃ 0.25mm iptg诱导3.5h；5、37℃ 0.1mm iptg诱导3.5h；6、30℃ 1.0mm iptg诱导6h；7、30℃ 0.5mm iptg诱导6h；8、30℃ 0.25mm iptg诱导6h；9、30℃ 0.1mm iptg诱导6h；10、20℃ 1.0mm iptg诱导过夜；11、20℃ 0.5mm iptg诱导过夜；12、20℃ 0.25mm iptg诱导过夜；13、20℃ 0.1mm iptg诱导过夜（箭头所示从上到下依次为co-rmfp151、酪氨酸酶和酪氨酸酶辅助因子orf438）。
[0013]
图4为co-rmfp151表达条件优化结果的灰度分析图；m、蛋白质分子量标准(14.4-116kd, 非预染)； 1、37℃ 1.0mm iptg诱导3.5h；2、37℃ 0.5mm iptg诱导3.5h； 3、37℃ 0.25mm iptg诱导3.5h； 4、37℃ 0.1mm iptg诱导3.5h。
[0014]
图5为co-rmfp151的纯化图；1、上清；2、沉淀；3、流穿；4、洗杂；5、洗脱；m、蛋白质分子量标准(14.4-116kd, 非预染)。
[0015]
图6为co-rmfp151的hplc纯度测定图；图7为rmfp151和co-rmfp151的羟化验证图；图8为co-rmfp151蛋白对pp和ps材质的粘合情况图；图9为co-rmfp151蛋白样品的lc-ms总离子流色谱图。
[0016]
具体实施方式
[0017]
实施例1、rmfp151重组表达步骤如下：s1、克隆：将蛋白序列rmfp151按照大肠杆菌密码子偏好进行优化，在c端加入6xhis-tag序列，完整基因序列如seq id no.1所示的；将所述基因序列克隆至表达载体pet20b中，得到含有rmfp151蛋白序列的表达载体。采用冻融法将pet20b-rmfp151质粒转化bl21（de3）感受态，lb-amp平板筛选。挑取单菌落，进行菌液pcr。
[0018]
反应体系：菌液1 μl，rmfp151-f/r 0.5 μl，1.1xt3 mix(擎科生物) 18μl。
[0019]
引物序列：rmfp151-f：5
’‑
catatggctatcatgaatcacaaagag-3’、rmfp151-r：5
’‑
cttagtgatggtgatgatggtgcttatag-3’。反应条件： 98℃ 2min，98℃ 10s，59℃ 10s，72℃ 15s，72℃ 3min（30个循环）。反应结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外检视。
[0020]
s2、高表达菌株筛选将阳性单克隆按千分之一比例接种于5ml lb-amp培养基中，37℃200rpm过夜培
养，再按千分之五转接至5ml lb-amp培养基中，37℃220rpm培养3h左右，至od600为0.6-0.8时，加入终浓度1mm iptg进行诱导表达。37℃ 200rpm诱导3.5h，12000rpm收菌体，-20℃备用。
[0021]
全菌样品用50μl 5%sds裂解，加入50μl 2xloadingbuffer，沸水浴10min，12000rpm离心，取上清8μl点样（12%分离胶、5%浓缩胶），低压60v30min，高压120v66min电泳，考染检视。筛出表达量最高的菌株并冻存。
[0022]
s3、表达条件优化甘油菌按千分之一比例接种于5ml lb-amp培养基中，37℃ 200rpm过夜培养后按千分之五转接至5ml lb-amp培养基中，37℃ 220rpm培养至od600为0.6-0.8时，加入终浓度1mm、0.5 mm、0.25 mm、0.1 mm iptg进行诱导表达。37℃、30℃、20℃ 200rpm分别诱导3.5h、6h及过夜，收菌体进行sds-page电泳，结果见图1、图2。37℃表达水平最高，在iptg浓度0.5mm时，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40.5%。
[0023]
实施例2、co-rmfp151重组表达具体步骤如下：s1、克隆：将蛋白序列tyr和orf438按照大肠杆菌密码子偏好进行优化，完整基因序列如seq id no.2和seq id no.3所示的；将所述基因序列克隆至表达载体pacycduet1中，得到含有tyr和orf438蛋白序列的表达载体pacycduet-tyr-orf438。
[0024]
采用冻融法，将pacycduet-tyr-orf438质粒转化至高表达工程菌bl21（de3）/ rmfp151感受态（用cacl2法制备）中，lb-cm-amp平板筛选。挑取单菌落进行菌液pcr。反应体系：1）菌液1 μl，rmfp151-f/r 0.5 μl，1.1xt3 mix(擎科生物) 18μl。 2）菌液1 μl，tyr-f/r 0.5 μl，1.1xt3 mix(擎科生物) 18μl。引物序列：tyr-f：5
’‑
atgaccgttcgcaaaaaccag-3’、tyr-r：5
’‑
cattaaacatcaaaggtataatgacgggtatg-3’。反应条件：98℃ 2min，98℃ 10s，59℃ 10s，72℃ 15s，72℃ 3min（30个循环）。反应结束后进行核酸电泳并紫外检视。
[0025]
s2、高表达菌株筛选强阳性单克隆接种于5ml lb-amp培养基中，37℃ 200rpm过夜培养，按千分之五转接至5ml lb-amp培养基中，37℃ 220rpm培养至od600为0.6-0.8时，加入终浓度1mm iptg进行诱导表达。37℃ 200rpm诱导3.5h，收集菌体进行sds-page电泳，筛出表达水平最高的菌株。
[0026]
s3、表达条件优化高表达菌按千分之一比例接种于5ml lb-cm-amp培养基中，37℃ 200rpm过夜培养，按千分之五转接至5ml lb-cm-amp培养基中，37℃ 220rpm培养至od600为0.6-0.8时，加入终浓度1mm、0.5 mm、0.25 mm、0.1 mm iptg进行诱导表达。37℃、30℃、20℃ 200rpm分别诱导3.5h、6h、过夜，取全菌样品进行sds-page电泳，结果见图3、图4。在37℃ 0.25mm iptg时，目的蛋白表达量相对最高，达到菌体总蛋白的37.5%。
[0027]
实施例3、co-rmfp151 500ml规模摇瓶、纯化及纯度检测s1、co-rmfp151纯化1、溶液配制：变性缓冲液：8m尿素、0.5m nacl、20mm pb（ph8-7.5），复性缓冲液：4m尿素、0.5m nacl、20mm pb（ph8-7.5），
洗杂缓冲液：500mm咪唑、0.5m nacl、20mm pb（ph6.6-ph6.0），洗脱缓冲液：600mm咪唑、0.5m nacl、20mm pb（ph5.0-ph2.0）；2、纯化步骤：以变性缓冲液平衡ni柱3个柱体积，按菌体:变性缓冲液=1:5混悬，4℃、800ba高压均质3次，15000rpm离心20min，收上清上样，过程中收集流穿液，上样完成后继续用变性缓冲液平衡ni柱5-8个柱体积。用复性缓冲液进行复性，洗柱3-5个柱体积。更换洗杂缓冲液洗3-5个柱体积，待基线平稳后，换洗脱缓冲液对目的蛋白进行洗脱，收集洗脱峰，结果见图5。
[0028]
s2、co-rmfp151的hplc纯度测定1、分离柱信息：5μm c18（2）100
å
lc column 250
×
4.6 mm2、流动相：流速：0.8 ml/mina相: 水b相: 甲醇c相: 0.1%tfa-乙腈d相: 0.1%tfa-水3、时间：35 min时间程序：0-30min c.conc 70% d.conc 30%；30-35min c.conc 5% d.conc 95%4、自动进样器：吸样速度：5.0 μl/sec进样量：80μl样品冷却器温度：4 ℃5、波长：波长采集范围：190nm—800nm6、结果：见图6。
[0029]
实施例4、co-rmfp151的羟化验证、ms鉴定及羟化率测定s1、羟化验证1、溶液配制：（1）2m甘氨酸钾溶液：46.9g甘氨酸溶于200ml纯化水后，用koh调ph至10.0，定容至250ml，4℃保存，备用；（2）0.16m硼酸钠溶液：15.6g硼酸钠溶于200ml纯化水后，定容至250ml，常温保存，备用。
[0030]
2、点样：取0.22μm水系膜，在点样位置用铅笔做好标记。取蛋白样品溶液（rmfp151样品溶液、co
‑ꢀ
rmfp151蛋白样品溶液、溶剂样品），每次2μl，点于标记处，待样品溶液干后，继续下一次点样，反复多次，直至点样量达到约6μg蛋白（溶剂组点样量与蛋白样品溶液点样体积相同即可）。
[0031]
3、前处理：待水分挥干后，将膜置于烧杯中，加入300ml纯化水，超声10min。
[0032]
4、染色：将膜转移至合适的容器中，加入nbt-甘氨酸钾染色液，锡箔包裹避光染色45min。
[0033]
5、洗膜、显影：弃去nbt-甘氨酸钾染色液，用硼酸钠溶液冲洗2次，在硼酸钠溶液中过夜。用纯化水冲洗膜，将膜保存于纯化水中，及时拍照保存结果，见图7。co
‑ꢀ
rmfp151样品点样处显明显的紫红色，未羟化样品紫红色几乎不可见，溶剂组点样处没有斑点。
[0034]
s2、粘合试验1、样品制备：将纯化后的co-rmfp151装入活化后的截流分子量10kd的透析袋中，用5%醋酸水溶液进行透析，每12h换透析液，透析上次后，将样品转移至合适的容器中，梯度降温后进行冷冻干燥。
[0035]
2、粘合实验：取冻干后的co-rmfp151蛋白0.5-1mg，溶于2 μl 5%的醋酸水溶液中，将溶解后的蛋白溶液涂于10 μl和200 μl吸头的基部（吸头材质为聚丙烯（polypropylene，pp）），再将吸头放置于材质为聚苯乙烯（polystyrene，缩写ps）的培养皿上，室温固化3h左右。固化后可观察到吸头粘合于培养皿表面，倒置培养皿吸头依然保持于培养皿粘合的状态，见图8。
[0036]
s3、质谱鉴定及羟化率测定1、样品前处理（1）sds-page切胶纯化（2）胰蛋白（trypsin）酶解2、lc-ms/ms检测co-rmfp151蛋白样品经过lc-ms/ms采集数据生成的raw文件，经过软件byonic数据库检索，得到鉴定结果，结果显示蛋白覆盖度98.3%；检测到酪氨酸（y）羟化位点22个，占该蛋白所有y的38.6%，占该蛋白总氨基酸数的7.48%。lc-ms总离子流色谱图见图9。

技术特征：
1.一种重组贻贝粘蛋白，其特征在于，将来源于厚壳贻贝mytilus coruscus的mcfp-5成熟肽两端融合紫贻贝mytilus edulis 的mefp-1肽段，得到贻贝粘蛋白新分子rmfp151，其氨基酸序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述的重组贻贝粘蛋白，其还包括用于蛋白纯化的his标签。3.编码根据权利要求1或2所述的重组贻贝粘蛋白的核酸，并进行大肠杆菌偏好密码子优化，优化序列有seq id no.2、seq id no.3或seq id no.4。4.根据权利要求1所述的核酸，其序列如seq id no.4所示。5.根据权利要求3所述的核酸，其还包括用于蛋白纯化的his标签。6.一种用于表达上述重组贻贝粘蛋白的载体，其特征在于为pet28a、pet20b或pqe30。7.一种宿主细胞，其包括权利要求6中所述的表达载体，其特征在于为bl21（de3）、origami（de3）或m15。8.一种权利要求1或2所述的重组贻贝粘蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）rmfp151感受态细胞的制备：将蛋白序列rmfp151按大肠杆菌密码子偏好性进行优化，将得到的基因序列克隆至表达载体中，采用冻融法将pet20b-rmfp151转化表达菌株感受态细胞中，并将筛得到的高表达菌株用cacl2法制备成rmfp151感受态细胞；（2）co-rmfp151重组蛋白的表达：将蛋白序列tyr和orf438分别按照大肠杆菌密码子偏好进行优化，得到基因序列如seq id no.6和seq id no.7所示；将两个基因序列克隆至表达载体pacycduet1中，得到含有tyr和orf438蛋白序列的表达载体pacycduet-tyr-orf438；将pacycduet-tyr-orf438质粒转化至步骤（1）所得bl21（de3）/ rmfp151感受态细胞中，并筛选得到co-rmfp151高表达菌株；（3）co-rmfp151蛋白的纯化：采用ni亲和层析色谱串联g25进行纯化，得到高纯度的co-rmfp-151重组蛋白。9.如权利要求2所述重组贻贝粘蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述co-rmfp151蛋白的纯化包括在洗杂缓冲液（500mm咪唑、0.5m nacl、20mm pb，ph7.0-ph6.0）条件下对杂蛋白进行洗脱，在洗脱缓冲液（600mm咪唑、0.5m nacl、20mm pb，ph5.0-ph1.0）条件下对目的蛋白进行洗脱。10.根据以上1-5所述的重组贻贝粘蛋白在制备生物粘合剂或细胞培养吸附介质中的应用，所述粘合剂组合物用于粘接断裂骨骼、修复牙裂、粘合软组织、修复皮肤创伤。

技术总结
本发明公开了一种重组贻贝粘蛋白及其制备方法。所述rMfp151蛋白的氨基酸序列结构如下：来源于厚壳贻贝Mytilus coruscus的Mcfp-5成熟肽两端融合紫贻贝Mytilus edulis Mefp-1的天然肽段，并在C端加入六聚组氨酸标签。本发明将rMfp151、TYR和ORF438三个基因构建为双质粒表达系统，实现对羟化修饰后的co-rMfp151蛋白的高表达。本发明的纯化方法可获得纯度达到90%以上的目的蛋白，可在室温下固化，完成对粘接物体的粘合。克服了天然贻贝粘蛋白提取得率低、成本高，重组贻贝粘蛋白表达量低、纯化困难且体外羟化率低导致粘性不佳的问题。且体外羟化率低导致粘性不佳的问题。且体外羟化率低导致粘性不佳的问题。


技术研发人员：项琪 黄亚东 黄伟展 张期容
受保护的技术使用者：广州暨南大学医药生物技术研究开发中心有限公司
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/9/7