一种对苯酚衍生物、多肽和蛋白质中酪氨酸进行硝基化的方法

1.本发明属于有机合成和应用领域，具体涉及对蛋白质、多肽或苯酚衍生物进行选择性硝基化的方法。


背景技术：

2.细胞蛋白的酪氨酸硝基化是指将酪氨酸转化为3-nt残基，是生命系统中最重要的氧化翻译后修饰(ptm)之一(ferrer-sueta g,campolo n,trujillo m,etal.biochemistry of peroxynitrite and protein tyrosine nitration[j].chemical reviews,2018,118(3):1338-1408.)。蛋白质中3-nt的出现通常被认为是人类疾病(包括癌症和神经系统疾病)的重要生物标志物。
[0003]
与其天然前体酪氨酸相比，3-nt具有显著改变的物理化学性质，包括氧化还原电位和酚部分的pka值，它对蛋白质的功能和物理行为有重大影响。尽管蛋白质硝基化具有生物学意义，但相关研究明显落后于其他ptm，主要是由于缺乏产生高质量硝基化蛋白质的方法。
[0004]
传统的蛋白质硝基化化学方法通常采用四硝基甲烷(tnm)和nano2等试剂，存在效率低、羟基化和蛋白质交联等副反应不可控的问题。最近，发明人团队报道了5-甲基-1,4-二硝基咪唑(dnim)作为一种光控、生物相容性和化学选择性的蛋白质酪氨酸硝基化试剂。尽管该方法具有快速的反应动力学和对酪氨酸的高化学选择性，但其生物适用性受限于相对较短的光辐照波长(390nm)以及在蛋白质和细胞水平上缺乏靶标选择性。因此，目前亟需在复杂的生物样品和生命系统中选择性硝基化天然靶蛋白的技术。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种对苯酚衍生物、多肽和蛋白质中酪氨酸进行硝基化的方法，以解决目前针对蛋白质、多肽或苯酚衍生物不能同时达到高效率、高选择性以及在可见光条件下进行硝基化的方法。为了解决上述问题，本发明提供了一种光催化硝基化方法，借助钌(ru)催化剂在可见光(460-465nm)下实现蛋白质或多肽的硝基化。
[0006]
本发明在一个方面，提供一种对底物进行硝基化的方法，所述方法在加入钌(ru)催化剂条件下在可见光下实现对底物的硝基化，所述硝基化通过5-甲基-1,4-二硝基咪唑(dnim)介导。
[0007]
在一个实施例中，所述底物包括多肽、蛋白质、苯酚衍生物。
[0008]
在一个实施例中，所述方法中多肽与dnim的摩尔比为1:1-5；优选为1:1.5；所述方法中苯酚衍生物与dnim的摩尔比为1:1-5；优选为1:1.2；蛋白质与dnim的摩尔比根据蛋白质的具体性质而定。
[0009]
在一个实施例中，所述多肽为不含有侧键裸露的半胱氨酸的多肽。
[0010]
在一个实施例中，所述蛋白质为不含有侧键裸露的半胱氨酸的蛋白质。
[0011]
在一个实施例中，所述苯酚衍生物的结构式如式ⅰ所示：
[0012]
所述r在化学领域里代表的是一个通式，代表任意基团的意思。
[0013]
在一个实施例中，所述对蛋白质的硝基化包括诱导蛋白质酪氨酸(tyr)硝基化。
[0014]
在一个实施例中，将ru催化剂与靶蛋白配体结合，实现对目标蛋白质的选择性硝基化。
[0015]
在一个实施例中，所述钌(ru)催化剂包括ru(bpy)3cl2。
[0016]
在一个实施例中，将[ru(bpy)3]cl2单元与苯磺酰胺连接基团(bs)结合作为催化剂。
[0017]
在一个实施例中，所述可见光的波长为460-465nm。
[0018]
技术效果：
[0019]
本发明提供了一种用于可见光控制的针对底物硝基化的光催化方法，所述底物包括多肽、蛋白质和或苯酚衍生物。该方法通过激发的[ru(bpy)3]cl2催化剂来引发dnim介导的硝基化反应，该反应发生在催化剂周围的局部空间中。由于该反应有很好的空间分辨率，可利用与靶蛋白配体结合的ru催化剂，在混合蛋白质样品和细胞裂解物中实现了选择性蛋白质硝基化修饰。
附图说明
[0020]
图1dnim介导的光催化。(a)dnim的光催化分解；(b)二肽1a的光催化硝基化；
[0021]
图2nmr(400mhz，meod)和ms/ms分析证实硝基化选择性地发生在tyr残基的邻位；
[0022]
图3在存在或不存在自由基捕获试剂的情况下，底物二肽1a的酪氨酸硝基化；
[0023]
图4bht捕获在可见光介导的酪氨酸硝基化过程中产生的自由基物质；
[0024]
图5ethene-1,1-diyldibenzene捕获在可见光介导的酪氨酸硝基化过程中产生的自由基物质；
[0025]
图6使用光激发ru(bpy)3cl2的stern-volmer淬灭实验；
[0026]
图7dnim的循环伏安图；
[0027]
图8dnim介导的光催化tyr硝基化反应的机制途径；
[0028]
图9可见光诱导的多肽和蛋白质的酪氨酸硝基化。(a)多肽底物的酪氨酸硝基化；(b)模型蛋白质的酪氨酸硝基化；
[0029]
图10肽底物p-1的硝基化；
[0030]
图11肽底物p-2的硝基化；
[0031]
图12肽底物p-3的硝基化；
[0032]
图13肽底物p-4的硝基化；
[0033]
图14肽底物p-5的硝基化；
[0034]
图15肽底物p-6的硝基化；
[0035]
图16套索肽mccj25的硝基化；
[0036]
图17胰蛋白酶消化后(3-nt)-4-asn的ms/ms分析。seg 33-39、seg 114-125、seg 126-133和seg 134-140分别是包含y39、y125、y133和y136的片段；
[0037]
图18胰蛋白酶(a)或gluc(b、c)消化后(3-nt)
3-h2a的ms/ms分析。seg37-42、seg 42-56和seg 57-61分别是包含y39、y50和y57的段；
[0038]
图19配体导向的选择性蛋白质硝基化。(a)配体定向选择性蛋白质硝基化的示意图。(b)ca对bsa的选择性硝基化。(c)胎牛血清中ca的选择性硝基化。(d)ca在skov3细胞裂解物中的选择性硝基化；
[0039]
图20[ru(bpy)3]cl2催化的蛋白质硝基化作用特异性发生在细胞膜上；
[0040]
图21膜蛋白的细胞选择性硝基化。(a)含有等量skov3-cfse和skov3-ru细胞的混合细胞样品硝基化示意图；(b)cfse染色和抗(3-nt)抗体染色细胞的流式细胞术分析。(c)skov-ru细胞以剂量依赖性方式被dnim有效硝基化，
[0041]
而skov3-cfse细胞未被硝基化；
[0042]
图22(a)催化剂ru-1和竞争剂2的结构；(b)ca在bsa上的选择性硝基化。
具体实施方式
[0043]
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不局限于这些实施例。
[0044]
实施例1
[0045]
为了在可见光的控制下实现5-甲基-1,4-二硝基咪唑(dnim)介导的蛋白质硝基化，本发明筛选了一系列能够使dnim介导二肽模型底物tyr-ala(底物1a)的酪氨酸硝基化光催化剂(表1)。结果表明，以dnim(1.2eq.)为硝基化试剂，0.1mol％的ru(bpy)3cl2为光催化剂(各催化剂的含量均为0.1mol％)，对底物1a(1.0eq.)进行硝基化修饰，在pb缓冲液(ph 6.0)中，可见光(460-465nm)照射30min下近定量转化生成了相应的硝基化产物2a(参见图1，表1)，同时产生5-甲基-硝基咪唑(nim)作为第二种产物。nmr和ms/ms分析证实，硝基化作用选择性地发生在tyr残基的邻位(参见图2)。这表明光照和ru催化剂都是该反应进行所必需的。硝基化产物2a的1h nmr(a)、
13
c nmr(b)、hsqc(c)、hmbc(d)和ms/ms谱图(e)；1h nmr(400mhz,meod)δ8.05(d,j＝2.2hz,1h),7.58(dd,j＝8.6,2.2hz,1h),7.14(d,j＝8.6hz,1h),4.26(q,j＝7.2hz,1h),4.06(dd,j＝8.0,5.6hz,1h),3.26(dd,j＝14.4,5.6hz,1h),3.05(dd,j＝14.4,8.0hz,1h),1.40(d,j＝7.2hz,3h).
13
c nmr(100mhz,meod)δ178.11,169.31,154.99,139.30,135.75,128.21,127.00,121.52,55.67,51.55,37.60,18.86.hrms(esi)[m+h]
+
m/z calcd.for 1a c
12h17
n2o
4+
253.1183,found 253.1175.hrms(esi)[m+h]
+
m/z calcd.for 2a c
12h16
n3o
6+
298.1034,found 298.1024.。
[0046]
表1
[0047][0048]
实施例2
[0049]
为了理解上述光催化酪氨酸硝基化反应的机理，自由基捕获试剂被用来捕获潜在的中间体。具体反应条件为：二肽模型底物tyr-ala底物1a(1.0mm)、dnim(1.2mm)、自由基捕获试剂(5.0mm)、ru(bpy)3cl2(0.1moll％)在pb缓冲液(ph 6.0)/mecn中，在460-465nm照射下40分钟；所述自由基捕获试剂选自2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(bht)或1,1-二苯基乙烯。结果表明，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(bht)和1,1-二苯基乙烯均对硝基化反应有显著抑制作用(参见图3)。hrms检测到自由基捕获试剂与酪氨酰自由基、硝基自由基和nim自由基的偶联合物，表明反应涉及这些自由基种类(参见图4-5)。
[0050][0051]
表2
[0052][0053][0054][0055]
关于bht捕获在可见光介导的酪氨酸硝基化过程中产生的自由基物质，具体参见
图4，通过hrms分析反应混合物。(a)反应混合物的hrms分析。3a：hrms(esi)m/z计算值c
15h23
no3na[m+na]
+
288.1576，实测值288.1559；误差5.9ppm；(b)反应混合物的hrms分析。4a：hrms(esi)m/z计算值c
27h39
n2o5[m+h]
+
471.2849，实测值471.2838，误差2.3ppm；c
27h38
n2o5na[m+na]
+
计算值493.2678，实测值493.2661，误差3.4ppm。
[0056][0057]
关于1,1-二苯基乙烯捕获在可见光介导的酪氨酸硝基化过程中产生的自由基物质，参见图5，通过hrms分析反应混合物。(a)反应混合物的hrms分析。5a：c
14h12
no2[m+h]
+
计算值226.0858，实测值226.0840，误差7.9ppm；c
14h11
no2na[m+na]
+
计算值248.0669，实测值248.0657，误差4.8ppm。(b)反应混合物的hrms分析。6a/7a：hrms(esi)m/z计算值c
18h19
n4o4[m+h]
+
353.2630，实测值353.2629，误差0.2ppm。
[0058]
lc-hrms分析进一步表明，自由基捕获剂与酪氨酰自由基、硝基自由基和nim自由基在反应过程中产生了加合物，表明反应遵循自由基途径。
[0059]
实施例3
[0060]
为了探究ru(bpy)3cl2在催化过程中的功能，进行了荧光猝灭实验以确定其相互作用的分子(参见图6)。pb缓冲液(ph 6.0)/h2o体系中的ru(bpy)3cl2溶液在λ＝470nm处被激发，并在610nm处测量发射(发射最大值)。对于每个淬火实验，通过horiba fluoromax-4分光光度计测量ru(bpy)3cl2(0.1mm)与不同浓度(0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0mm)的dnim或nim溶液配置在螺旋盖10.0mm石英比色皿中的发射强度。参见表2。
[0061]
表2
[0062][0063]
参见图6，将610nm处的荧光强度比(i0/i)与dnim或二肽底物1a的浓度作图。stern-volmer图结果显示dnim在测定条件下有效地猝灭了ru(bpy)3cl2的荧光发射。其中，猝灭速率常数kq＝0.63m-1
s-1
，这表明dnim和ru(bpy)3cl
2*
之间存在能量或电子转移过程。
[0064]
实施例4
[0065]
在mpi-a多功能电化学和化学发光系统(上海ch仪器有限公司，中国)上进行循环
伏安法测量。抛光的pt板用作工作电极，铂丝用作辅助电极，在ch3cn中的ag-agno3(0.1m)用作参比电极。四丁基四氟硼酸铵(0.1m)用作电解质，使用fc+/fc作为内标。扫描速率设置为0.2v/s。参见图7，循环伏安实验表明dnim的电位为-1.13v(sce)，低于报道的ru(bpy)3cl
2*
[e
1/2
([ru(bpy)3cl2]
+
/ru(bpy)3cl
2*
)＝-0.81v(sce)]。因此，观察到的dnim对ru(bpy)3cl
2*
的荧光猝灭可能是由于能量转移过程而不是氧化还原过程。二肽底物1a对ru(bpy)3cl
2*
没有荧光猝灭作用(参见图6)。因此，本发明发现了dnim介导的光催化tyr硝基化反应的合理机制途径(参见图8)：可见光活化时产生的ru(bpy)3cl
2*
可以通过能量转移激发dnim，从而诱导dnim中的n(1)-no2键均裂生成一个nim自由基和一个no2自由基。nim自由基随后从tyr残基中攫取一个氢自由基以产生酪氨酰自由基，该自由基可与硝基自由基偶联以产生所需的3-nt产物。
[0066]
实施例5：肽的硝基化
[0067]
本实施例继续研究了上述光催化方法在多肽和蛋白质酪氨酸硝基化中的适用性。由lc-ms和ms/ms分析确定，序列长度范围为4至12个氨基酸的多肽p-1-p-6在标准条件下均能顺利硝基化，具有接近定量的转化和高化学选择性(参见图8-15)。功能性氨基酸，包括phe、gln、thr、ser、met、arg、asp和trp，保持未修饰，hplc和esi-ms未检测到由酪氨酸交联引起的对肽二聚化。热稳定的套索肽mccj25被选为具有两个酪氨酸残基tyr9和tyr20的环肽天然产物底物，它们位于拥挤的微环境中(参见图9)。在标准条件下用dnim对mccj25进行硝基化修饰产生产物(3-nt)
2-mccj25，该硝基化发生在mccj25的第9位和第20位的酪氨酸上，这由ms和ms/ms分析确定(参见图9，图16)。
[0068]
多肽底物p-1的硝基化。反应的hplc分析：p-1(1.0mm)、ru(bpy)3cl2(0.1mol％)和dnim(1.2mm)在50mm pb(ph 6.0)缓冲液中，在460-465nm光下反应40分钟。通过使用(p-1)在280nm处的峰auc和二苯甲酮作为内标来确定转化率。p-1的分析数据：hrms(esi)m/z计算值：c
25h32
n4o6na[m+na]
+
507.2220，实测值507.2206。(3-nt)-p-1的分析数据：hrms(esi)m/z计算值：c
25h31
n5o8na[m+na]
+
522.2070，实测值522.2056。具体参见图10。
[0069]
多肽底物p-2的硝基化。(a)hplc分析p-2(nh
2-qstv-oh，1.0mm)和dnim(1.2mm)与1μm ru(bpy)3cl2在室温下在50mm pb(ph 6.0)中反应，辐照30分钟。通过使用p-2在274nm处的峰值auc确定反应转化率(》95％)。(b)反应前后多肽的esi-ms谱图。没有观察到p-2由酪氨酸交联引起的二聚化。p-2的分析数据：hrms(esi)[m+h]+m/z计算值：c
26h41
n6o
10+
597.2879，实测值597.2879。3-nt-p-2的分析数据：hrms(esi)[m+h]+m/z计算值c
26h40
n7o
12+
642.2730，实测值642.2725。(c)酪氨酸硝基化通过3-nt-p-2的ms/ms分析得到证实。具体参见图11。
[0070]
多肽底物p-3的硝基化。反应的hplc分析：p-3(1.0mm)、ru(bpy)3cl2(0.1mol％)和dnim(1.2mm)在50mm pb(ph 6.0)缓冲液中，在460-465nm光下反应40分钟。通过使用(p-3)在280nm处的峰auc和二苯甲酮作为内标来确定转化率。p-3的分析数据：hrms(esi)m/z计算值：c
26h34
n5o8[m+h]
+
544.2407，实测值544.2394。(3-nt)-p-3：hrms(esi)m/z计算值：c
26h32
n6o
10
na[m+na]
+
611.2078，实测值611.2063。具体参见图13。
[0071]
多肽底物p-4的硝基化。反应的hplc分析：50mm pb(ph 6.0)缓冲液中的p-4(1.0mm)、ru(bpy)3cl2(0.1mol％)、抗坏血酸钠(2.0mm)和dnim(2.4mm)，460-465nm光下反应40分钟。转化率是通过使用(p-4)在280nm处的峰auc和二苯甲酮作为内标来确定的。p-4的
分析数据：hrms(esi)m/z计算值：c
37h53
n9o
11
sna[m+na]
+
832.3663，实测值832.3628。(3-nt)-p-4的分析数据：hrms(esi)m/z计算值：c
37h52n10o13
sna[m+na]
+
877.3514，实测值877.3497。具体参见图13。
[0072]
多肽底物p-5的硝基化。反应的hplc分析：p-5(1.0mm)、ru(bpy)3cl2(0.1mol％)、抗坏血酸钠(2.0mm)和dnim(2.4mm)在50mm pb(ph 6.0)缓冲液中，在460-465nm光下反应40分钟转化率是通过使用(p-5)在280nm处的峰auc和二苯甲酮作为内标来确定的。p-5的分析数据：hrms(esi)m/z计算值：c
41h48
n7o
11
[m+h]
+
798.3463，实测值798.3434。(3-nt)-p-5的分析数据：hrms(esi)m/z计算值：c
41h47
n8o
12
[m+h]
+
843.3313，实测值843.3346。具体参见图14。
[0073]
多肽底物p-6的硝基化。(a)hplc分析p-6(nh
2-tenlyfqsgtrr-nh2,0.5mm)和dnim(0.75mm)与0.5μm ru(bpy)3cl2在室温下在50mm pb(ph6.0)中的反应，辐照30分钟。反应转化率(》95％)通过使用p-6在274nm处的峰auc来确定。(b)反应前后肽的esi-ms谱图。没有观察到p-6的二聚化。p-5的分析数据：hrms(esi)[m+h]+m/z计算值：c
63h100n21o20+
1470.7448，实测值1470.7403。3-nt-p-6的分析数据：hrms(esi)[m+h]+m/z计算值：c
63h99n22o22+
1515.7299，实测值1515.7275。(c)酪氨酸硝基化位点通过3-nt-p-6的ms/ms分析得到证实。具体参见图15。
[0074]
套索肽mccj25的硝基化。(a)hplc分析mccj25(0.5mm)和dnim(1.25mm)与0.5μm ru(bpy)3cl2在室温下50mm ph 6.0pb中的反应，照射30分钟。反应转化率(》95％)是通过使用mcj25在274nm处的峰值auc来确定的。(b)反应前后肽的esi-ms谱图。mccj25的分析数据：hrms(esi)[m+2h]
+
m/z计算值：c
101h141n23o272+
1054.0178，实测值1054.0158。hrms(esi)[m+2h]
+
m/z计算值。(3-nt)
2-mccj25的分析数据:c
101h139n25o312+
1099.0029，实测值1099.0026。(c)酪氨酸硝基化通过(3-nt)
2-mccj25的ms/ms分析得到证实。参见图16。
[0075]
总之，这些数据表明dnim介导的光催化tyr硝基化反应是一种生物相容且稳健的方法，对复杂多肽中的酪氨酸残基具有高度特异性。
[0076]
实施例5
[0077]
为了继续研究上述光催化硝基化方法将3-nt引入蛋白质中的适用性，选择α-synuclein(asn)作为模型蛋白。α-synuclein(asn)包含四个酪氨酸残基，其硝基化是与神经退行性疾病(包括帕金森病)相关的重要生物学事件。因此，本发明选择asn作为模型蛋白质来检验光催化硝基化方法的效率。由lc-ms/ms分析确定，5eq.dnim(相对于总蛋白质)和0.1mol％ru催化剂加入到ph 6.0的pb缓冲液中，由lc-ms/ms分析确定，asn在60分钟内在460nm照射下接近定量转化为具有高残留特异性的完全酪氨酸硝基化产物(3-nt)
4-asn(参见图9b，图17)。组蛋白-h2a被选为具有三个tyr残基的第二个模型蛋白质。在标准条件下处理组蛋白-h2a导致组蛋白-h2a在60分钟内发生三个酪氨酸硝基化(参见图9b，图18)。总之，这些数据表明dnim是一种在天然条件下用于多肽和蛋白质的高效和化学选择性酪氨酸硝基化试剂。
[0078]
实施例6：目标蛋白的配体定向选择性硝基化
[0079]
以往的蛋白质硝基化方法通常依赖于氧化试剂，例如nano2，它会非选择性地修饰所有蛋白质中暴露的tyr残基。因此，非常需要在复杂的生物样品和生命系统中选择性硝基化目标蛋白质的技术。就本发明中的光催化方法而言，硝基自由基仅在ru催化剂附近产生，并且在细胞环境中的扩散距离小于0.8μm。因此，以配体为导向的蛋白质修饰策略通常利用
蛋白质特异性配体将交联的催化剂或反应单元特异性递送至靶蛋白，从而使修饰发生在靶蛋白表面的局部。本发明合成了催化剂ru-1，其中[ru(bpy)3]cl2单元与苯磺酰胺连接基团(bs)结合，苯磺酰胺连接基团(bs)是碳酸酐酶(ca)的配体(参见图19a)。预计bs会将ru-1专门传递给目标ca蛋白，从而允许在ca蛋白表面局部发生修饰。当ca蛋白和牛血清白蛋白(bsa)的混合样品在460nm照射下用[ru(bpy)3]cl2和dnim处理时，两种蛋白质都被硝基化(参见图19b，条带4)。当使用催化剂ru-1代替[ru(bpy)3]cl2时，只有ca以高选择性硝基化(参见图19b，条带3)。添加ca结合竞争剂2(100eq.到催化剂ru-1)消除了对bsa和ca蛋白质中的ca蛋白质硝基化的选择性(参见图19b，条带5)。在没有dnim或ru-1的情况下，没有观察到bsa或ca的蛋白质硝基化。这些结果表明，结合配体导向策略，本发明的光催化酪氨酸硝基化方法能够实现蛋白质选择性酪氨酸硝基化。
[0080]
其中ru-1的合成方法如下：
[0081][0082]
化合物c1和c2根据文献程序制备(s.sato,h.nakamura,angewandtechemie 2013,52,8681-8684)。向c1(0.012mmol)、(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷磷鎓六氟磷酸盐)(pyaop)(0.0144mmol)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(hoat)(0.0144mmol)在dmf中的溶液中加入化合物c2(0.016mmol)。将混合物在冰浴中冷却，然后一次性加入n,n-二异丙基乙胺(dipea)(0.036mmol)。室温反应2h后，减压浓缩所得溶液，经hplc进一步纯化得到产物ru-1(8.9mg，76％收率)。hplc梯度：1％ ch3cn 10分钟，然后1％-80％ch3cn 40分钟，产物ru-1在约24分钟时洗脱。1h nmr(400mhz,dmso)δ9.68(s,1h),9.31(s,1h),8.89(s,1h),8.83(d,j＝8.1hz,4h),8.53(s,2h),8.23
–
[0083]
8.08(m,4h),7.98(d,j＝8.5hz,2h),7.91
–
7.82(m,4h),7.80
–
7.67(m,4h),7.59
–
7.45(m,6h),7.39(d,j＝5.2hz,1h),3.35
–
3.22(m,4h),2.53(s,3h),1.64
–
[0084]
1.43(m,4h),1.41
–
1.26(m,4h).
13
c nmr(100mhz,dmso)δ165.61,165.18,162.91,157.37,156.63,156.47,155.84,151.85,151.26,150.30,150.08,146.15,142.26,138.03,137.61,128.92,127.84,125.63,125.40,124.55,121.70,28.94,28.83,26.18,20.73.hrms(esi)[m+h]
+
m/z calcd.for c
45h45
n9o4rus
2+
454.6174,found454.6161.
[0085]
接下来，将方法应用于更复杂的生物样本。在ca蛋白与胎牛血清(fbs)的混合物中，催化剂ru-1和dnim存在的优化条件下观察到ca的选择性硝基化(参见图19c，条带3)。用[ru(bpy)3]cl2替换ru-1或添加竞争剂2导致fbs衍生蛋白质的非选择性蛋白质硝基化，证明苯磺酰胺配体对蛋白质靶向的重要性。
[0086]
最后，本发明在skov3细胞的细胞裂解物中挑战了这种以配体为导向的选择性硝基化方法。惊喜的是，酪氨酸硝基化在其与skov3细胞裂解物的混合样品中对ca蛋白具有高选择性，这种选择性依赖于配体与ca蛋白的结合。膜蛋白的酪氨酸硝基化通常会诱发下游生物事件。例如，cd40膜受体的硝基化可以阻止cd40与其配体(cd154)结合并介导其正常的信号转导。相反，cd40的硝基化导致其被20s蛋白酶体内化和降解。然而，评估活细胞中膜蛋
白硝基化的生物学后果具有挑战性，主要是因为小分子硝基化试剂通常具有膜渗透性，并且会自发地硝酸化膜蛋白和细胞内蛋白。在本发明的光催化方法中使用的[ru(bpy)3]cl2催化剂具有非常差的膜渗透性，并且几乎完全位于低微摩尔浓度的细胞外，因此限制了硝基化反应专门发生在膜蛋白上。然后将skov3细胞与dnim(0.5mm)和[ru(bpy)3]cl2(1.0μm)孵育并用460nm光照射15分钟，然后依次与抗3-nt抗体和抗小鼠igg h&l孵育(alexa 647)。共聚焦分析表明酪氨酸硝基化特异性作用于细胞膜(参见图20)。
[0087]
膜蛋白的细胞选择性硝基化可以帮助剖析膜蛋白硝基化对细胞命运的影响，但目前缺乏该领域方法。本发明成功使用h.pyloriα(1,3)-fucosyltransferase和gdp-fucose-[ru(bpy)3]cl2将ru催化剂结合到skov3细胞的细胞表面(skov3-ru细胞)，(参见图21，图22)。作为对照组，在无ru催化剂条件下，使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)荧光标记skov3细胞(skov3-cfse细胞)。然后将skov3-ru和skov3-cfse细胞混合在含有0～1mm dnim的培养基中，并在460nm下照射10分钟以允许膜蛋白硝基化。用抗3-nt抗体染色后，用流式细胞术对两组细胞表面硝基化选择性进行表征。结果表明，只有skov3-ru细胞以剂量依赖性方式被硝基化，而skov3-cfse细胞不受影响。本发明实现了混合细胞样品中膜蛋白的细胞选择性硝基化。总之，本发明证明通过本发明提供的光催化配体定向硝基化方法可以实现蛋白质的目标选择性硝基化。
[0088]
综上，本发明提供了一种用于可见光控制的多肽、蛋白质或苯酚衍生物中酪氨酸硝基化的光催化方法。该方法通过激发的[ru(bpy)3]cl2催化剂来引发dnim介导的硝基化反应，该反应发生在催化剂周围的局部空间中。受益于该反应的空间分辨率，通过利用与靶蛋白配体结合的ru催化剂，在混合蛋白质样品和细胞裂解物中实现了选择性蛋白质硝基化。此外，通过将ru催化剂结合到混合细胞样品中特定细胞群的表面，实现了膜蛋白的细胞选择性硝基化。总的来说，这种光催化蛋白质硝基化方法可能有助于研究特定蛋白质酪氨酸硝基化在细胞水平上的生物学影响。

技术特征：
1.一种对底物进行硝基化的方法，其特征在于，所述方法为加入钌(ru)催化剂在可见光条件下实现对底物的硝基化修饰，所述硝基化通过5-甲基-1,4-二硝基咪唑(dnim)介导。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物包括多肽、蛋白质、苯酚衍生物。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中多肽与dnim的摩尔比为1:1-5；优选为1:1.5。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中苯酚衍生物与dnim的摩尔比为1:1-5；优选为1:1.2。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苯酚衍生物的结构式如式ⅰ所示：所述r在化学领域里代表的是一个通式，代表任意基团。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对蛋白质的硝基化包括诱导蛋白质酪氨酸(tyr)硝基化。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将ru催化剂与靶蛋白配体结合，实现对目标蛋白质的选择性硝基化。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述钌(ru)催化剂包括ru(bpy)3cl2。9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将[ru(bpy)3]cl2单元与苯磺酰胺连接基团(bs)结合作为催化剂。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可见光的波长为460-465nm。

技术总结
本发明属于有机合成和应用领域，具体涉及对蛋白质、多肽或苯酚衍生物进行硝基化的方法。本发明提供了一种光催化硝基化方法，借助钌(Ru)催化剂在可见光(460-465nm)下实现蛋白质、多肽或苯酚衍生物的硝基化。该方法通过激发的光催化剂来引发DNIm介导的硝基化反应，该反应发生在催化剂周围的局部空间中。由于该反应有很好的空间分辨率，可利用与靶蛋白配体结合的Ru催化剂，在混合蛋白质样品和细胞裂解物中实现了选择性蛋白质硝基化修饰。中实现了选择性蛋白质硝基化修饰。中实现了选择性蛋白质硝基化修饰。


技术研发人员：王欢 刘雷 龙腾芳 范鑫龙 陶友琦
受保护的技术使用者：南京大学
技术研发日：2023.03.09
技术公布日：2023/9/7