一种以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法

1.本发明属于植物分子生物学技术和基因工程技术领域，具体涉及一种以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法。


背景技术：

2.随着多组学测序技术在植物上的广泛应用，研究者们获得了海量的序列信息和差异表达基因/蛋白/代谢产物。如何在基因大数据时代利用好这些数据资源、进行功能基因的挖掘已成为新时代的重要课题。转基因技术是开展基因功能研究的重要手段，该技术基于一系列现代生物技术，将研究者们感兴趣的目标基因，经过克隆和重组后，导入并整合到受体生物的基因组中，从而达到改良受体性状或赋予其他优良性状的目的。但是对于大多数植物，尤其是多年生果树来说，除了苹果和柑橘等，大多数果树因转化效率低和植株难以再生等诸多因素，转基因体系尚不成熟。转基因体系的缺失，已经成为果树功能基因研究的主要限制因子，也是影响果树分子生物学发展的瓶颈。目前，国际高水平期刊日趋强调要基于同源物种开展基因功能验证，因此，耗时短、效率高的基因瞬时表达技术获得了越来越多的关注。
3.植物瞬时表达技术是一种获得目的基因短暂的高水平表达的技术。与稳定表达相比，瞬时表达转化效率高、所需时间短，在启动子分析、蛋白互作和基因功能验证等方面应用广泛。瞬时转化的方法主要有基因枪法和农杆菌介导法。
4.基因枪法对硬件设备的要求较高，只有较少部分的组织或细胞符合基因枪法的转化要求，且所得转基因植物组织较少，难以满足部分性状后续分析所需样品量。
5.农杆菌介导的转化属于纯生物学的过程，属于一种天然的植物基因转化系统，具有通用性高、可操作性强、转化频率高、表达效果好等特点。
6.基于农杆菌介导的基因瞬时表达技术，在近几年取得了迅速的发展和完善，但在部分果树的果实上的可行性较差，其应用仍然有限，目前仅在果皮肥厚的柑橘果实、膨压较小的梨果实等得以应用，在柑橘、梨果实中，研究者们均采用注射器直接注射到果实组织中，实现目的基因的瞬时表达。
7.葡萄是我国的重要经济作物，目前已经有了较完善的基因组数据和注释信息，为葡萄功能基因的研究提供了极大便利。但是由于葡萄的发育期长，缺乏完善的再生体系，因此，亟需开发葡萄果实中基于瞬时表达技术进行功能验证的方法。然而，基因枪法对硬件设备要求较高，且获得的转化材料较少，难以满足后续的实验分析；农杆菌介导技术中的注射法向葡萄果实注入外源液体，会使组织破裂，不适用于果皮单薄、膨压较大的葡萄果实。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，能够实现果皮单薄、膨压较大的葡萄基因的瞬时表达。
9.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
10.一种以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，包括以下步骤：
11.(1)选择成熟度在果实膨大期结束到商业采收期之间的果实，去除葡萄果皮，制作葡萄果肉组织切片；
12.(2)将葡萄果肉组织切片在ms固体培养基上进行易感培养，获得易感状态的葡萄果肉组织切片；
13.(3)将易感状态的葡萄果肉组织切片浸没于含有目标载体的农杆菌浸染液中，然后进行抽真空处理，保压，再释放真空至常压，取出浸染后的葡萄果肉组织切片；
14.(4)对浸染后的葡萄果肉组织切片进行清洗，然后培养，确定瞬时表达结果。
15.本发明的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，适用于果皮单薄、果肉组织膨压较大的葡萄果实，具有操作简单、转化效率高的优点，为在葡萄果实中开展基因功能研究及功能基因的筛选提供了技术支持。
16.进一步地，所述易感培养是将葡萄果肉组织切片放在ms固体培养基上，于24～26℃、黑暗条件下培养36～48h。易感培养让葡萄果肉更易接受外源基因，同时易感培养能够减少后续浸染对葡萄果肉的伤害，起到缓冲的作用。
17.进一步地，所述含有目标载体的农杆菌浸染液包括含有目标载体的农杆菌、浸染液和表面活性剂。所述浸染液为含有氯化镁、2-(n-吗啡啉)乙磺酸、乙酰丁香酮的水溶液。所述氯化镁、2-(n-吗啡啉)乙磺酸、乙酰丁香酮的摩尔比为50:50:1。所述浸染液的ph为5.6～5.7。所述氯化镁的摩尔浓度为10mm。
18.进一步地，所述含有目标载体的农杆菌的培养包括以下步骤：将目标基因构建到植物表达载体上，得到基因表达载体，将基因表达载体转入农杆菌gv3101，在含有相应抗生素的lb固体培养基上28℃培养2d后，挑取单克隆，经pcr鉴定后，用含有相应抗生素的lb液体培养基培养，扩大培养体系至50～100ml，培养至od
600
＝0.8～1.0后，在常温下离心。更进一步地，离心的转速为6000rpm，时间为10min。
19.本发明中的载体是常规载体形式，应用时无特殊要求，所用载体包含表达载体的基本构成元件：目的基因、启动子、终止子、标记基因。本发明中使用的载体是包含组成型启动子的表达载体。
20.进一步地，所述植物表达载体为pcambia0390。
21.进一步地，利用冻融法将基因表达载体转入农杆菌gv3101。
22.进一步地，所述表面活性剂为聚环醚改性聚二甲基硅氧烷。所述表面活性剂在浸染液中的体积分数为0.03％～0.05％。
23.进一步地，所述表面活性剂为南京沃博生物科技有限公司的silwet l-77。
24.进一步地，所述含有目标载体的农杆菌浸染液采用包括以下步骤的方法制得：将浸染液与占浸染液0.05wt％的聚环醚改性聚二甲基硅氧烷混合，得到混合液，然后将混合液与所述含有目标载体的农杆菌混合，在摆动式振荡摇床或往复式振荡摇床上，90rpm下孵育4h。
25.进一步地，所述抽真空处理是抽真空至-70～-80kpa。
26.进一步地，所述保压的时间为5～15min。更进一步地，保压的时间优选为15min。
27.进一步地，步骤(4)中，所述培养是将清洗后的葡萄果肉组织切片放在ms固体培养基上，于24～26℃培养72～78h。
28.进一步地，步骤(1)中，所述葡萄果肉组织切片的厚度为0.5～1cm，面积为1cm2。
29.进一步地，在去除葡萄果皮前，用无菌蒸馏水清洗葡萄果实，然后用乙醇溶液浸泡葡萄果实，再用次氯酸钠溶液浸泡葡萄果实，最后用无菌蒸馏水清洗。更进一步地，用乙醇溶液浸泡葡萄果实的时间为1min，用次氯酸钠溶液浸泡葡萄果实的时间为20min。
30.进一步地，所述乙醇溶液为等体积的无菌蒸馏水和无水乙醇混合均匀后的溶液，乙醇溶液的体积分数为50％。所述次氯酸钠溶液的有效氯含量为2.5wt％。
31.进一步地，所述确定瞬时表达结果选择gus染色法或实时荧光定量反转录-pcr(real-time reverse transcription-pcr，rt-qpcr)的方法。
32.进一步地，所述gus染色法包括以下步骤：将步骤(4)中培养后的葡萄果肉组织切片置于gus染色液中，在37℃下孵育12h后，用75vol％的乙醇进行脱色处理，观察染色情况。
33.本发明的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，可用于检测目的基因的表达模式分析，以及用于检测可能受目的基因影响的基因表达水平；本发明还可以通过基于瞬时表达的基因共表达分析，挖掘与目的基因互作的基因或受目标基因调控的下游靶基因，为构建以目的基因为中心的基因表达调控网络提供基础，最终实现目的基因的瞬时过表达及本发明在基因功能和作用机制研究上的应用。
附图说明
34.图1：pcambia0390::35s-gus：以pcambia为骨架的含gus报告基因的表达载体的葡萄果实组织切片进行瞬时表达后的染色图；empty：不含gus报告基因的表达载体的葡萄果实组织切片的染色图；
35.图2：本发明实施例1、2、3中不同保压时间的葡萄果实组织切片的gus染色结果图；
36.图3：用本发明实施例1(易感状态)和对比例1(非易感状态)的葡萄果实组织切片进行瞬时表达后的gus染色对比结果图。
具体实施方式
37.以下结合实施例对本发明做进一步地说明。本发明实施例中的silwet l-77(货号为m0642，南京沃博生物科技有限公司，中国，南京)是一种高效有机硅表面活性剂，有效成分为聚环醚改性聚二甲基硅氧烷，纯度≥99％。本发明实施例中涉及的载体是常规载体形式，应用时无特殊要求，所用载体包含表达载体的基本构成元件：目的基因、启动子、终止子、标记基因。本发明实施例中使用包含组成型启动子的表达载体。
38.一、以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法的实施例
39.实施例1
40.本实施例的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，包括以下步骤：
41.(1)葡萄果肉组织切片的制作：选择果穗端正、果粒大小均匀、果面光洁、无机械损伤、无病虫害，且成熟度在果实膨大期结束到商业采收期之间的“阳光玫瑰”葡萄进行实验。以下操作均严格按照超净工作台的使用方法，在超净工作台中完成：首先，用无菌蒸馏水清洗葡萄果实，去除表面污物，然后用50vol％的乙醇溶液浸泡1min，之后，用有效氯为2.5wt％的次氯酸钠溶液浸泡20min，最后，用无菌蒸馏水清洗5次，用无菌滤纸吸干多余水分，在超净工作台中，开启无菌风，晾干果实，去除葡萄果皮，将果肉组织切成厚度为0.5cm，
面积约为1cm2的切片。
42.(2)葡萄果肉组织易感状态的培养：将制备好的果肉切片放置在ms固体培养基上，于25℃、黑暗条件下培养48h。
43.(3)含有目标载体的农杆菌的培养：将目标基因构建到植物表达载体pcambia0390上，利用冻融法将上述重组质粒转入农杆菌gv3101，在含有相应抗生素的lb固体培养基上28℃培养2d后，挑取单克隆，经pcr鉴定后，用含有相应抗生素的lb液体培养基培养，扩大培养体系至50ml，培养至od
600
＝0.8后，在常温下6000rpm离心10min，收集菌体沉淀，备用。本发明以实验室保存的含有pcambia0390::35s-gus的农杆菌菌液进行浸染，以不含gus报告基因的表达载体(pcambia0390::35s-empty)为对照。
44.(4)含有目标载体的农杆菌浸染液的制备：浸染液为含有10mm mes(2-(n-吗啡啉)乙磺酸)、10mm mgcl2(氯化镁)、200μm乙酰丁香酮(acetosyringone，as)、ph约为5.6的水溶液。在浸染液中加入0.05vol％的silwet l-77，混匀待用；向步骤(3)获得的菌体沉淀中加入等体积的浸染液，重悬菌体，在往复式振荡摇床上，90rpm孵育4h后，即得含有目标载体的农杆菌浸染液。
45.(5)抽真空浸染：将葡萄果肉组织切片完全浸没于含有目标载体的农杆菌浸染液，然后抽真空处理，利用水环式真空泵抽真空至-70kpa，保持压强10min，直至果肉组织表面无明显气泡渗出。
46.(6)释放真空：用5min缓慢释放真空，使含有目的基因的农杆菌进入葡萄果肉组织切片。
47.(7)培养：对浸染后的葡萄果肉组织切片进行继续培养之前，需用无菌蒸馏水漂洗5次，无菌滤纸吸干多余水分，晾干后放置在ms固体培养基上，于25℃培养72h。
48.(8)gus组织化学染色：取步骤(7)培养后葡萄果肉组织切片置于gus染色液中，37℃孵育12h后，用75vol％的乙醇进行脱色处理。以pcambia为骨架的含gus报告基因的表达载体(pcambia0390::35s-gus)为实验组，以不含gus报告基因的表达载体(pcambia0390::35s-empty)为对照组，观察并拍照保存，结果如图1所示，实验组中的组织切片整体染色明显，可直接观察到，对照组的组织切片则完全没有上色，可见本发明的方案能够实现目的基因的转化。
49.实施例2
50.本实施例的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，在实施例1的基础上，将保压的时间调整为5min，未述及内容参照实施例1中的步骤进行。
51.实施例3
52.本实施例的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，在实施例1的基础上，将保压的时间调整为15min，未述及内容参照实施例1中的步骤进行，实施例1中的实验组、实施例2、实施例3的gus染色结果如图2所示，可以看到，3个组织切片均染色成功，其中，保压15min后的组织切片染色效果最好。
53.二、对比例
54.本对比例的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，与实施例1的区别仅在于，本对比例省去步骤(2)的葡萄果肉组织易感状态的培养步骤，直接进行浸染，未述及内容同实施例1。
55.将实施例1中易感状态的葡萄果实组织切片(即实验组)和本对比例中的非易感状态葡萄果实组织切片进行gus组织化学染色，结果如图3所示，可以看到，易感状态的组织切片整体成功染色，而非易感状态的组织切片的中部几乎未见蓝色，仅边缘见弱蓝色，转化效率低，表明培养易感状态的果肉切片是本发明必不可少的步骤。

技术特征：
1.一种以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)选择成熟度在果实膨大期结束到商业采收期之间的果实，去除葡萄果皮，制作葡萄果肉组织切片；(2)将葡萄果肉组织切片在ms固体培养基上进行易感培养，获得易感状态的葡萄果肉组织切片；(3)将易感状态的葡萄果肉组织切片浸没于含有目标载体的农杆菌浸染液中，然后进行抽真空处理，保压，再释放真空至常压，取出浸染后的葡萄果肉组织切片；(4)对浸染后的葡萄果肉组织切片进行清洗，然后培养，确定瞬时表达结果。2.根据权利要求1所述的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，所述易感培养是将葡萄果肉组织切片放在ms固体培养基上，于24～26℃、黑暗条件下培养36～48h。3.根据权利要求1所述的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，所述含有目标载体的农杆菌浸染液包括含有目标载体的农杆菌、浸染液和表面活性剂；所述浸染液为含有氯化镁、2-(n-吗啡啉)乙磺酸、乙酰丁香酮的水溶液；所述氯化镁、2-(n-吗啡啉)乙磺酸、乙酰丁香酮的摩尔比为50:50:1；所述浸染液的ph为5.6～5.7；所述氯化镁的摩尔浓度为10mm。4.根据权利要求3所述的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，所述表面活性剂为聚环醚改性聚二甲基硅氧烷；所述表面活性剂在浸染液中的体积分数为0.03％～0.05％。5.根据权利要求1所述的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，所述抽真空处理是抽真空至-70～-80kpa。6.根据权利要求1或5所述的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，所述保压的时间为5～15min。7.根据权利要求1所述的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤(4)中，所述培养是将清洗后的葡萄果肉组织切片放在ms固体培养基上，于24～26℃培养72～78h。8.根据权利要求1或2所述的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，步骤(1)中，所述葡萄果肉组织切片的厚度为0.5～1cm，面积为1cm2。9.根据权利要求1所述的以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，其特征在于，在去除葡萄果皮前，用无菌蒸馏水清洗葡萄果实，然后用乙醇溶液浸泡葡萄果实，再用次氯酸钠溶液浸泡葡萄果实，最后用无菌蒸馏水清洗。

技术总结
本发明涉及一种以葡萄果实为材料的基因瞬时表达方法，属于植物分子生物学技术和基因工程技术领域。该方法包括以下步骤：


技术研发人员：裴茂松 刘海楠 韦同路 郭大龙 余义和
受保护的技术使用者：河南科技大学
技术研发日：2022.02.24
技术公布日：2023/9/7