一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料及制备方法

1.本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料及制备方法，具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料用于骨缺损修复，提供机械强度，同时促进骨生长。


背景技术：

2.因感染、创伤、肿瘤、骨关节疾患、骨不愈合或延迟性愈合等导致的骨缺损修复一直是临床治疗的难点，此时有必要通过临床骨移植术进行干预，植入生物材料辅助治疗。使用人工仿骨材料作为自体或异体骨移植供体的最佳替代品进行骨缺损治疗的方法，成为修复骨缺损与功能重建的主要研发方向，且需求量逐年递增。
3.随着先进材料研发的不断进步，骨微环境代谢机制研究逐渐深入，构建能整合和调控不同的生物学活性，体内降解与骨再生完美匹配，重建甚至加速骨修复过程的新型骨修复材料，是当前骨组织再生研究所致力达到的目标。可生物降解的柔性材料和硬性固体材料复合是目前较为有效的人工骨修复材料。
4.目前临床应用比较多骨缺损修复固体材料有金属、陶瓷、矿物质等，其中最广泛的生物金属材料有钛及其合金，具有良好的生物相容性、高机械强度和耐腐蚀等优点，经常用于骨缺损修复、骨折固定和硬组织替换等领域。但是，由于金属材料，例如钛是生物惰性材料以及力学性能与机体高度不匹配，临床上会出现植入材料难以与骨组织形成紧密结合或者进行性骨流失等现象，最终导致材料植入修复失败。
5.柔性材料例如水凝胶或者基因载体载入相关基因，在促进细胞粘附、迁移、增殖和分泌细胞外间质等方面发挥重要作用，是天然骨的主要有机基质, 参与调控成骨细胞的发育、分化活性和骨改建, 在组织修复和再生中起着主要作用。同时定向结构的水凝胶，例如胶原纤维对细胞除了以上作用，在组织修复领域取得了令人振奋的成果。骨是人体的重要承重组织，骨中胶原纤维的排列对骨的力学性能和生理功能有重要影响。定向胶原纤维支架不仅能促进骨细胞增殖分化，加速新骨的生长，还能诱导细胞分泌具有定向结构的细胞外间。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料及制备方法，属于生物材料技术领域。所述一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料，将具有定向结构的柔性材料连接到表面有定向结构的硬性材料上的，材料包括含有硬性材料的基底，含有柔性材料基体，使得基底和基体进行连接的界面连接层。其中硬性材料和柔性材料都具有定向结构，且定向尺寸都在10μm至约100μm之间，硬性材料提供高强度和高硬度支持骨的力学结构，柔性材料模拟骨细胞微环境，提供营养物质，此种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料不仅能促进骨细胞增殖分化，加速新骨的生长，还能诱导细胞分泌具有定向结构的细胞外间，在修复骨缺损与功能重建领域有极大的应用前
景。
7.为实现以上技术效果，采用如下技术方案：一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料，包括具有定向结构的柔软柔性材料作为基体，具有定向结构的高硬度高强度硬性材料作为基底，连接层为使得基底和基体进行连接的界面，所述基体植入组织中首先接触组织周边环境；所述基底在基体接触组织周围环境同时或之后接触到组织环境；所述连接层位于所述基底与所述基体相接触的区域；所述定向结构是材料具有指定方向的空间排列结构形貌，指定方向是在拓扑空间中指向或方向的一种选择；所述基体材料为胶原蛋白、壳聚糖、明胶中的一种或者多种。
8.所述基底材料为金属、陶瓷、矿物质中的一种或者多种。
9.进一步的，所述基底材料定向结构尺寸为10μm至100μm之间，所述基体材料定向结构尺寸为10μm至20μm之间；所述基底和基体具有与骨缺损部位相适应形状，形状包括正方体、圆柱体、球体、不规则形态；所述定向结构可以为卷曲结构，诱导齿骨生长。
10.进一步的，所述连接层连接形式为化学交联、层层组装、静电吸附、熔融连接中的一种或多种；所述连接层由聚合物形成；所述聚合物包括胶原蛋白、明胶、透明质酸、壳聚糖、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯、淀粉接枝共聚物及其衍生物和组合物中的一种或者多种；所述基底和所述基体存在部分重叠，且连接层存在于该重叠区域中。
11.进一步的，所述具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料为：将具有定向结构的柔性材料i型胶原col、壳聚糖cs、聚乳酸pla、明胶gel、基因载体rls接枝到表面有定向结构的硬性材料金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石ha、矿物质碳纳米管c上，可以支持骨的力学结构，促进骨细胞增殖分化，加快骨愈合的骨缺损修复材料；所述金属钛材料硬度大于等于7，强度大于等于20kpa，所述胶原材料硬度小于7,强度小于20kpa。
12.进一步的，所述基体材料由天然的聚合物或者合成的聚合物形成；所述聚合物包括糖胺聚糖、胶原蛋白、明胶、透明质酸、纤维蛋白、聚乳酸、几丁质、淀粉接枝共聚物及其衍生物和组合物中的一种或者多种；所述基体材料还包括分子量小或厚度为纳米级别的基因载体、生长因子、促进组织再生的药物；包括但成纤维细胞生长因子fgf、血管内皮生长因子vegf、骨形态发生蛋白bmp、骨钙素oc、骨特异性碱性磷酸酶bsap、淫羊藿苷ica中的一种或者多种；所述的基体材料与硬性基底定向交联、黏附或层层组装，形成定向柔性材料层，或者材料分子量小，或者基体材料厚度足够薄，能够充分暴露底部定向结构，形成类似双层定向结构特征；所述基体具有不同形状，包括正方体、圆柱体、球体、不规则形态；所述基体形状和大小同于基底或者不同于基底。
13.一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料的制备方法，包括以下步骤：步骤s1：材料制备：将金属钛材料加工制备出沿一定方向取向的金属钛材料；将陶瓷羟基磷灰石粉末材料利用3d打印技术按照特定程序打印出一定形状、沿一定方向的取向的陶瓷羟基磷灰石粉末材料；将矿物质碳纳米管材料采用化学气相沉积cvd技术制备定向碳纳米管阵列；步骤s2：材料表面氧化：将步骤s1中制备的沿一定方向取向的金属钛材料在氢氧化钠中浸泡一段时间，再放入去离子水中浸泡一段时间，然后在真空下干燥，得到了表面修
饰了-oh的金属钛材料；陶瓷羟基磷灰石粉末材料表面含有丰富-oh，无需氧化；定向碳纳米管阵列干燥用臭氧/紫外处理一段时间，得到表面修饰了-oh的碳纳米管材料；步骤s3：材料表面硅烷化：将上述步骤s2中处理好的金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料在硅烷偶联剂中浸泡一段时间，得到表面修饰-nh2的金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料，即aps 涂层样品；然后aps 涂层样品在甲醇溶液和去离子水中超声，然后在进一步改性前进行干燥。
14.步骤s4：定向水凝胶制备：将胶原蛋白、壳聚糖、聚乳酸、明胶四种材料溶解在六氟异丙醇hfip和乙酸的溶剂混合物中，制备静电纺丝溶液；将制备的静电纺丝溶液利用纺丝机器继续纺丝，得到定向水凝胶；将定向水凝胶电纺丝胶原膜切成一定尺寸进行后续步骤实验。
15.步骤s5：定向水凝胶固定到表面修饰-nh2的金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料：将步骤s4中处理好的电纺丝胶原膜分别放在步骤s3中处理好的表面修饰-nh2的金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料表面，并分别浸泡在交联液中一段时间；浸泡后，再置于pbs中浸泡，再用去离子水冲洗，最后冷冻干燥，得到最终具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料。
16.进一步的，所述步骤s1中金属钛材料加工制备包括高温挤压法、3d打印法、化学沉积法、磁控溅射法、电化学蚀刻法、激光烧蚀法中的一种或多种，得到所需特定结构；所述步骤s2中的金属钛材料表面氧化包括碱热处理、紫外活化法、电化学氧化法、酸蚀刻法中的一种或多种；所述步骤s3中的硅烷偶联剂是aps、乙烯基硅烷、氨基硅烷、环氧基硅烷、巯基硅烷其中一种或多种；所述步骤s4中的定向水凝胶制备方法包括静电纺丝、微流控系统法、反向旋转挤压法、旋涂法、表面接触、3d 打印、外加电场其中一种或多种；所述步骤s5中的交联液是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺edc、n-羟基琥珀酰亚胺nhs、戊二醛、京平尼、碳化二亚胺、己异二氰酸酯、叠氮二苯膦、双醛聚乙二醇其中一种或多种；
17.进一步的，所述步骤s3中金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料引入氨基、羧基、醛基至少其中一种或多种基团，与定向水凝胶上的氨基、羧基基团至少其中一种或多种化学交联，产生酰胺键、二硫键、缩醛键、缩酮键、腙键以及原酸酯键中的一种或几种，使得基底和基体紧密连接。
18.一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料的制备方法，包括以下步骤：步骤s1：材料表面相转变溶菌酶涂层的制备：称取粘合剂溶菌酶溶于缓冲溶液，与cep的缓冲溶液等体积比例混合，然后取适量相转变溶菌酶溶液滴加在金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料表面，在室温下孵育；去离子水冲洗，氮气流下干燥；最后在金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料表面得到稳定的溶菌酶涂层，即连接层；步骤s2：材料表面多层基因薄膜的制备：采用层层自组装lbl技术在步骤s1中得到的溶菌酶涂层金属钛材料、溶菌酶涂层陶瓷羟基磷灰石粉末材料、溶菌酶涂层碳纳米管材料表面组装多层基因薄膜；制备出rls阳离子自组装体；将溶菌酶涂层金属钛材料、溶菌酶涂层陶瓷羟基磷灰石粉末材料、溶菌酶涂层碳纳米管材料分别依次浸入dna溶液和rls溶液中，重复多次，最后去离子水冲洗，在氮流下干燥基材，得到最终具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料。
19.进一步的，所述步骤s2中的重复多次为重复6次；所述步骤s1中的粘合剂为溶菌酶、聚维酮、羟丙甲纤维素、羧甲纤维素钠中的一种或几种；所述步骤s2中溶菌酶涂层金属钛材料、溶菌酶涂层陶瓷羟基磷灰石粉末材料、溶菌酶涂层碳纳米管材料表面组装多层基因薄膜的制备采用层层组装方式和粘合剂粘接方式，或者采用静电吸附、熔融、化学交联连接方式中的一种或者多种。
20.所述术语“基底”，区别于基体，具有高硬度高强度特性，一般植入组织中，在基体接触组织周围环境同时或之后接触到组织环境。术语“基体”，区别于基底，一般较为柔软，植入组织中，首先接触组织周边环境。所述基底和所述基体之间的连接层，位于所述基底的支持基质与所述基体的基质相接触的区域。所述复合材料旨在模拟天然存在的骨组织结构和生理物理环境。高度模拟骨缺损形态使和周围组织更好促进骨细胞增殖分化，加快植入材料与周边组织边界的融合，促进骨生长。
21.本发明的有益效果为：与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1、本发明采用了先进制造技术，例如静电纺丝技术，优化了静电纺丝参数，采用转轴高转数模式，制备具有定向结构的胶原，使胶原呈纤维丝状，且宽度一般在10-30 um，与细胞尺寸高度匹配，可用于诱导细胞定向排列生长。将具有定向结构柔性如i型胶原接枝到表面有同方向定向结构的硬性材料如钛片、羟基磷灰石、碳纳米管材料上，双层定向结构高度模拟细胞外基质环境，从而使细胞在模拟细胞外基质上定向生长，同时又定向向硬性材料方向迁移，达到细胞加速增殖分化，诱导骨生成的目的；2、本发明的材料在基体部分允许从周围组织募集细胞。这提供了改善的组织再生。具体地，基底部分增强了骨向内生长到基质中以与骨形成强整合，从而为模拟细胞外基质的基体部分提供稳定的机械支持，并且可以承受关节负荷。
22.3、本发明通过将具有定向结构柔性材料i型胶原、壳聚糖、聚乳酸、明胶、基因载体接枝到表面有定向结构的硬性材料金属钛片、陶瓷羟基磷灰石、矿物质碳纳米管上，提供骨的结构特征，使得机械性能更强，并且可承受必要的物理负荷以实现稳定的机械固定，同时构建骨微环境，使材料具体骨诱导活性，促进骨细胞增殖分化，加速骨修复过程，使得强大的骨整合为形成提供支持，并使骨界面的细胞能够经受生理动态环境。能够极大推进骨修复材料的临床转化。
附图说明
23.图1为本发明实施例1中aps 涂层样品制备反应流程图；图2为本发明实施例1金属钛材料表面接胶原反应流程图；图3为本发明实施例1静电纺丝制备出定向胶原材料的图像；图4为本发明实施例1最终制备的材料的图像；图5为本发明实施例1定向金属钛材料表面扫描电镜示意图；图6为本发明实施例1定向胶原表面透射电镜示意图；图7为本发明实施例1最终制备的材料的流变实验结果；图8为本发明实施例1定向金属钛材料表面细胞生长共聚焦图像；图9为本发明实施例1定向金属钛材料表面连接胶原细胞生长共聚焦图像；
图10为本发明实施例1定向金属钛材料接枝定向胶原材料对骨生长增值相关基因骨钙素（ocn）和发育相关转录因子-2（runx）表达量与定向金属钛材料或定向胶原材料对骨生长增值相关基因骨钙素（ocn）和发育相关转录因子-2（runx）表达量的对比图；图11为本发明实施例2fgti、fgti-ptl、fgti-p-(dna@rls)1、fgti-p-(dna@rls)6、cgti-p-(dna@rls)6扫描电镜示意图；图12为本发明实施例2定向金属钛材料组装基因载体材料对骨形态发生蛋白2（bmp2）表达量与定向金属钛材料、非定向金属钛材料组装基因载体材料的相关基因表达量对比图；图13为本发明实施例2定向金属钛材料组装基因载体材料对i型胶原（col1a)表达量与定向金属钛材料、非定向金属钛材料组装基因载体材料的相关基因表达量对比图；图14为本发明实施例2定向金属钛材料组装基因载体材料对骨桥蛋白（opn）表达量与定向金属钛材料、非定向金属钛材料组装基因载体材料的相关基因表达量对比图；图15为本发明实施例2定向金属钛材料组装基因载体材料对碱性磷酸酶（alp）表达量与定向金属钛材料、非定向金属钛材料组装基因载体材料的相关基因表达量对比图。
具体实施方式
24.下面结合附图对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：实施例1：一种高强定向材料交联定向水凝胶材料的制备流程
25.一种高强定向材料交联定向水凝胶材料的制备方法，包括：（1）材料制备：将金属钛材料真空退火、高温挤压、常温旋转挤出步骤制备出沿一定方向的取向的材料；将陶瓷羟基磷灰石粉末材料利用3d打印技术按照特定程序打印出一定形状、沿一定方向的取向的材料；将矿物质碳纳米管材料采用化学气相沉积( cvd )技术制备定向碳纳米管阵列。
26.进一步，对于步骤（1），优先采用金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料作为基底材料，在一些实施案例中，所述基底，包括但不限于其他如钛合金、锶或钽等金属、生物活性玻璃陶瓷、矿物质等一定硬度刚度的一种或多种聚合物中的一种或者多种材料。
27.（2）基底材料表面改性：步骤（1）中制备的金属钛材料在氢氧化钠（naoh）中浸泡一段时间，再放入去离子水中浸泡一段时间，然后在真空下干燥，得到了表面修饰了-oh的金属钛材料；陶瓷羟基磷灰石粉末材料表面含有丰富-oh，无需氧化；定向碳纳米管阵列干燥用臭氧/紫外处理一段时间，得到了表面修饰了-oh的碳纳米管材料。
28.进一步，对于步骤（2），所述基底材料表面改性优选采用碱热处理、紫外活化法。此外可以采用电化学氧化法、酸蚀刻法等其中一种或多种：
①
电化学氧化法：在恒电流条件下进行的，其中金属阳极极化一段时间，或者在恒电位条件下进行，其中样品被极化形成电位。氧化样品用水彻底冲洗后，然后在真空中干燥。
②
酸蚀刻法：用硫酸(h2so
4 )和过氧化氢(h2o2)的 1:1 混合物进行化学蚀刻。蚀刻后，用蒸馏水和丙酮冲洗样品并用n 2
气干燥。
29.（3）材料表面硅烷化：将处理好的金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料在aps/甲苯溶液中浸泡一段时间，得到表面修饰-nh2的金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料，即aps涂层样品。然后aps 涂层样品在甲醇溶液和去离子水中
超声，然后在进一步改性前干燥。
30.进一步，对于步骤（3），优选使用硅烷偶联剂(3-氨丙基)三甲氧基硅烷（aps），在一些实施例中，采用偶联剂包括但不限于乙烯基硅烷、氨基硅烷、环氧基硅烷、巯基硅烷其中一种或多种。
31.进一步，对于步骤（3），有另外两种实施办法。
①
活化后，将样品放入n 2
饱和的玻璃容器中，并在室温下浸入含有n,n-二异丙基乙胺和3-氯丙基-(三乙氧基)硅烷 (cptes)的戊烷溶液中1小时。硅烷化后在干燥器中用硅胶干燥24小时。
②
浸泡在的硅烷偶联剂(aeaps或aps)溶液中。样品用乙醇冲洗，超纯水冲洗，氮气冲洗干燥。
32.（4）定向胶水凝胶制备：将胶原蛋白、壳聚糖、聚乳酸、明胶四种材料溶解在六氟异丙醇（hfip）和乙酸的溶剂混合物中，制备静电纺丝溶液。将制备的静电纺丝溶液利用纺丝机器继续纺丝。将电纺丝胶原蛋白、壳聚糖、聚乳酸、明胶的膜材料切成一定尺寸进行交联实验。
33.进一步，对于步骤（4），所述基体材料优先选用胶原蛋白，一些实施案例中，包括但不限于壳聚糖、几丁质等具有一定柔度的一种或多种聚合物中的一种或者多种材料；即基体材料可以由天然或合成聚合物形成；包括糖胺聚糖、胶原蛋白、明胶、透明质酸、纤维蛋白、聚乳酸、几丁质、淀粉接枝共聚物及其衍生物和组合物中的一种或者多种；所述基体材料还包括分子量小或厚度纳米级别的基因载体、生长因子、促进组织再生的药物；包括但成纤维细胞生长因子fgf、血管内皮生长因子vegf、骨形态发生蛋白bmp、骨钙素oc、骨特异性碱性磷酸酶bsap、淫羊藿苷ica中的一种或者多种。
34.合适的聚合物包括胶原蛋白、明胶、透明质酸、壳聚糖、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯、淀粉接枝共聚物及其衍生物和组合物中的一种或者多种；进一步，优选采用静电纺丝胶原成型。在一些实施例中，包括但不限于静电纺丝、微流控系统法、反向旋转挤压法、旋涂法、外加电场、表面接触、3d 打印等制备方式。
35.（5）定向水凝胶固定到金属钛材料：然后将处理好的胶原蛋白、壳聚糖、聚乳酸、明胶的膜材料样品放在处理好的金属钛材料表面，并浸泡在配置好的含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（edc）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）交联剂的交联液中一段时间。浸泡过程之后，再置于pbs中浸泡，再用去离子水冲洗，最后冷冻干燥，得到最终材料。
36.进一步，步骤（5）中，优选使用的交联剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（edc）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs），所述连接层可以由可化学交联的任何合适的材料形成。在一些实施例中，也采用包括但不限于戊二醛、京平尼、碳化二亚胺、己异二氰酸酯、叠氮二苯膦、双醛聚乙二醇等交联剂。
37.进一步，金属钛材料表面引入包括但不限于氨基、羧基、醛基至少其中一种或多种基团，接着与胶原上的氨基、羧基等基团至少其中一种或多种化学交联，产生包括但不限于酰胺键、二硫键、缩醛键、缩酮键、腙键以及原酸酯键中的一种或几种使得基底和基体紧密连接。
38.具体的，定向金属钛材料表面接枝定向胶原材料的制造及其性能评价：1、材料制备1.1 表面定向样品的制备1.1.1 定向金属钛材料样品的制备
首先将商业纯钛棒材在1073k下真空退火2小时，得到完全再结晶的均匀粗晶材料，经450℃高温挤压，获得直径为20mm的细棒。再将其常温旋转挤出，获得直径为8mm的细棒。最后，将细棒在475
°
c高温下进一步退火6分钟，成功获得纤维状晶粒纯钛（ti），所制备的纤维状材料的纤维状晶粒沿长轴方向的织构取向（纵向截面）。陶瓷羟基磷灰石材料、碳纳米管材料用此制备方法制备困难、得到材料定向效果不稳定，因此在此制备方法下采用商业纯钛棒材进一步实验。
39.将ti加工成8
×8×
1.5mm3的薄片，加工完后用丙酮、乙醇和去离子水超声清洗15min。60
°
c烘箱烘干后，表面分别经过180、800、1500和2000目的砂纸进行打磨抛光。之后用丙酮、乙醇和去离子水各清洗3次，每次15min，经60℃烘箱干燥。然后用8%(v/v)氢氟酸与5.5%（v/v）硝酸配制的酸液对钛片进行酸蚀约30s，再用去离子水清洗3 次，干燥备用。
40.1.1.2 定向陶瓷羟基磷灰石样品的制备取直径50 um左右的羟基磷灰石粉末（ha）44 g，将1.2g丙烯酰胺、0.16gn,n'-亚甲基双丙烯酰胺和0.9g柠檬酸铵溶解在10ml去离子水中，然后ha粉末加入到配制好的预混液中并搅拌，配制成流动性优异、稳定性高的浆料。
41.使用 3d 建模软件创建 3d 模型，并将模型导出为 stl（立体光刻）文件格式。 然后，将stl文件导入切片软件并设置适当的打印参数，导出g代码文件，并将其保存在sd卡上。g 代码文件从 sd 卡导入 3d 打印机。 此后，将配制好的浆料装入滚筒中，由计算机文件控制浆料的印刷。 本研究中打印ha支架的具体过程如下。使用creo软件创建18
ꢁ×ꢁ
18
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mm3模型，并将模型保存为stl文件。 将stl文件导入cure软件中，打印速度、层高、针直径和基板加热温度分别设置为5 mm/s、0.3 mm、0.5 mm和25℃。 将切片模型保存为g代码文件，从sd卡输入3d打印机，然后使用文件程序打印ha支架。
42.1.1.3 定向矿物质碳纳米管样品的制备采用化学气相沉积( cvd )技术制备定向碳纳米管（c）阵列。以电阻炉作为加热器具，以石英玻璃管作为反应器，以石英玻璃片作为排列的碳纳米管的生长反应器，安装在石英舟上，并安装在反应室的中部。 碳源、催化剂和载气（蒸汽和氧气）从石英管的一端引入，废气从另一端排出。 碳源为一氧化物或碳氢化合物，如苯乙烯、乙烷、丙烯、丙烯等，碳源的流量由质量流量计控制阀控制。 为了得到定向控制纳米管的生长，用氢气或其他气体清洗反应器，直至反应器达到反应温度，然后切换气体为碳源，开始生长定向碳纳米管阵列，结束后然后切换回惰性气体，等待冷却，取出样品。
43.1.2 定向结构水凝胶制备将i型胶原（col）、壳聚糖(cs)、聚乳酸（pla）、明胶（gel）四种材料溶解在hfip和乙酸的溶剂混合物中，以50：50(v/v)，在4℃下磁性搅拌4h，制备静电纺丝溶液(120mg/ml)。将制备的静电纺丝溶液装入10ml注射器，并将21号钝针连接到注射器泵上。将溶液以1.0ml/h的流速通过钝性钢针。采用20kv高压直流电，气隙距离为12cm。纤维膜被收集在放置在车轮上的铝箔上。为了获得定向纤维，将旋转转速设置为1800rpm/min，每30min用湿布摩擦车轮以去除静电。将电纺丝胶原膜切成10
×
10mm的尺寸进行交联实验。将电纺丝膜浸泡在交联液(20mmedc和10mmnhs在90%乙醇中)中24小时。将交联膜置于0.1mpbs(ph=7.4)中2小时，然后用去离子水洗涤5次。
44.1.3 材料表面氧化
1.3.1 金属钛材料表面氧化fg-ti样品在80
°
c的5 mnaoh中浸泡12小时。样品在60
°
c去离子水中浸泡7天，每天换水，然后在真空下干燥。
45.1.3.2碳纳米管表面氧化将碳纳米管在80 ℃下干燥4小时，然后在室（jelight 144ax-220 uv/臭氧清洁系统）中 进行uv/o3处理2小时。该清洁器装有低压汞蒸气格栅灯，可释放28w/cm2的紫外线辐射。紫外光的波长为253.7nm，紫外灯与样品台之间的距离固定为20mm，处理后得到氧化的碳纳米管，然后在真空下干燥。
46.1.4 材料表面硅烷化表面氧化好的金属钛材料、碳纳米管材料样品、无需氧化的陶瓷羟基磷灰石样品在沸腾的(3-氨丙基)三甲氧基硅烷（aps）/甲苯溶液(aps 浓度为10%)中浸泡12小时。aps 涂层样品在甲醇中超声洗涤一次，在去离子水中超声洗涤两次，然后在进一步改性前干燥，aps 涂层样品制备方法如图1所示。
47.1.5 材料表面接水凝胶将未交联过后的几种干燥的电纺丝膜分别放置在处理好后的金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料上，将样品浸入配制好的溶液12小时，溶液包括20 mmedc和10 mmnhs。然后将金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料置于0.1 mpbs(ph=7.4)中2小时，后用去离子水洗涤5次，最后冷冻干燥，其中一反应过程如图2所述。
48.2、扫描电镜观察通过扫描电子显微镜(sem) (捷欧路公司生产的jeol jsm-840f)检测所得材料微观结构：金属钛材料及其接枝水凝胶后的ti、ti-col、ti-cs、ti-pla、ti-gel；陶瓷羟基磷灰石材料及其接枝水凝胶后的ha、hacol、ha-cs、ha-pla、ha-gel；碳纳米管材料及其接枝水凝胶后的c、c-col、c-cs、c-pla、c-gel。通过在15kv电压和145ma电流下运行的高分辨率微x射线计算机断层扫描(μ-ct)系统(瑞士scanco医疗生产的μct40)分析样品的孔尺寸和尺寸分布。dualbeamtm-sem/fib系统(fei nova 600nanolab)，配备有能量色散x射线分析(edax) (edax genesis)，结合了超高分辨率场发射sem和精确聚焦离子束(fib)蚀刻和沉积，该系统用于内部微观结构检测和局部元素分析。
49.图3为其中静电纺丝制备出定向胶原膜材料的图像；图4为其中最终制备的定向金属钛材料接枝定向胶原材料的图像；表明了定向胶原接枝在定向钛材料表面，形成材料的框架；图5为定向金属钛材料表面扫描电镜示意图，展现了定向钛表面的定向结构了，定向尺寸在10μm至约100μm；图6为定向胶原表面透射电镜示意图，展现了定向胶原表面的定向结构了，定向尺寸在10μm至约20μm。
50.图7为最终制备的材料的流变实验结果，显示定向钛接枝定向胶原使得储能模量和损耗模量都降低。
51.3、细胞共聚焦观察通过免疫荧光染色，测定mc3t3-e1的形态和分布。将材料以下原材料放入48孔板：金属钛材料及其接枝水凝胶后的ti、ti-col、ti-cs、ti-pla、ti-gel；陶瓷羟基磷灰石材料及其接枝水凝胶后的ha、hacol、ha-cs、ha-pla、ha-gel；矿物质碳纳米管材料及其接枝水凝胶后的c、c-col、c-cs、c-pla、c-gel，将mc3t3-e1以1
×
10 5
个细胞/cm 2
的密度在48孔板的
内表面上培养48小时。将获得的细胞在 4
°
c 下固定在4%（w/v）多聚甲醛中10分钟，接着细胞在 0.25% (v/v) triton x-100 (sigma-aldrich, usa) 中透化 10 分钟，并在室温下与 5% (w/v) bsa 孵育 1 小时以阻断非特异性结合位点。然后，将细胞与罗丹明-鬼笔环肽（molecular probes，invitrogen，美国）在 4
ꢀ°
c 下孵育过夜以进行 f-肌动蛋白染色，然后与dapi（sigma-aldrich，美国）在 25
ꢀ±ꢀ3°
c 下孵育 5 分钟以进行 f-肌动蛋白染色核染色。用 pbs 冲洗后，然后用 clsm（tcs sp5，leica，germany）拍照。
52.图8为其中定向金属钛材料表面细胞生长共聚焦图像；图9为其中定向金属钛材料表面连接胶原细胞生长共聚焦图像；结果表明，细胞培养两天后，细胞骨架和细胞核染色共聚焦结果，可以看出细胞都定向生长，且定向钛接枝定向胶原相对于定向钛，使得细胞生长更多，且使细胞变形少，细胞核压缩少，加快了细胞增值。
53.4、qpcr为了评估纤维取向对成骨分化的影响，将材料定向胶原、定向金属钛材料和定向金属钛材料接枝定向胶原材料放入48孔板，同时设置对照组，不加入仍和材料培养细胞。将mc3t3-e1在样品的上表面以1
ꢀ×ꢀ
10 5
个细胞/cm 2 上培养48小时后，在mrna 水平上检测骨生长增殖相关标记物的表达生长。根据制造商的方案，用trizol（invitrogen，美国）提取总细胞 rna 。在相同条件下在空白培养基上培养的 mc3t3-e1 作为对照。然后，使用带有 gdna 擦除器（takara，日本）的 primescript
™ꢀ
rt 试剂盒对每个样品的约 500 ng rna 进行逆转录。
54.qrt-pcr 使用 sybr green premix（takara，日本）在 light cycler 设备（roche，switzerland）上进行。pcr 循环包括 40 个循环的模板dna 扩增，引物在 60
ꢀ°
c 退火。所有引物（invitrogen，美国）均使用 primer 5.0 软件设计并总结于表 1中。gapdh被用作参考管家基因，然后使用 2 ‑
δδct
方法计算目标基因的相对表达水平。最终数据表示为相对于对照表达水平的倍数变化。
55.表1用于qpcr引物基因引物序列(5'-3')ocnf:ccccctctagcctaggaccr:accaggtaatgccagtttgcrunxf:ccgagctacgaaatgcctctr:ggaccgtccactgtcactttbmp2f:gactaccagaaacgagtgggaar:gcatctgttctcggaaaacctcol1af:caagggcattaggggacacar:acccacacttccatcgcttcopnf:agttgcggacaactcctttgr:tgccttctccctctgagtalpf:gacccttgacccccacaatr:gctcgtactgcatgtcccctgapdhf:ggagcgagatccctccaaaatr:ggctgttgtcatacttctcatgg
56.图10为定向金属钛材料接枝定向胶原材料对骨生长增值相关基因骨钙素（ocn）和发育相关转录因子-2（runx）表达量与定向钛或定向胶原材料对骨生长增值相关基因骨钙素（ocn）和发育相关转录因子-2（runx）表达量的对比图；结果表明，细胞培养两天后，对骨生长增值相关基因骨钙素（ocn）和发育相关转录因子-2（runx）表达量进行检测。定向金属钛材料接枝定向胶原材料相关基因表达量明显高于定向金属钛材料或定向胶原材料相关基因表达量，远远高于对不加任何材料的照组的细胞的相关基因表达量。
57.实施例2：一种高强定向材料层层组装基因载体材料的制备流程
一种高强定向材料层层组装基因载体材料的制备方法，包括：（1）材料表面相转变溶菌酶（p）涂层的制备：称取溶菌酶溶于缓冲溶液，与cep的缓冲溶液等体积比例混合，然后取适量相转变溶菌酶溶液（p）滴加在钛片上，在室温下孵育。去离子水冲洗，氮气流下干燥。最后在钛表面得到了稳定的p涂层。
58.进一步，对于步骤（1），优选使用的所述基底材料金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料可以替换为其他如钛合金、锶或钽等金属、生物活性玻璃陶瓷、矿物质等一定硬度刚度的一种或多种聚合物中的一种或者多种材料；进一步，所述基体材料相转变溶菌酶涂层可以替换成壳聚糖、明胶等具有一定柔度的一种或多种聚合物中的一种或者多种材料；即基体材料可以由天然或合成聚合物形成；包括糖胺聚糖、胶原蛋白、明胶、透明质酸、纤维蛋白、聚乳酸、几丁质、淀粉接枝共聚物及其衍生物和组合物中的一种或者多种；所述基体材料还包括分子量小或厚度纳米级别的基因载体、生长因子、促进组织再生的药物；包括但成纤维细胞生长因子fgf、血管内皮生长因子vegf、骨形态发生蛋白bmp、骨钙素oc、骨特异性碱性磷酸酶bsap、淫羊藿苷ica中的一种或者多种。
59.（2）材料表面多层基因薄膜的制备：采用层层自组装（lbl）技术在金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料表面组装多层基因薄膜。制备出rls阳离子自组装体。将纯钛底物依次浸入 dna溶液和rls溶液中，重复6次，最后去离子水冲洗，在氮流下干燥基材，得到最终材料。
60.进一步，对于步骤（2），所述连接层连接形式为层层自组装可以替换为化学交联、静电吸附、熔融连接方式其中一种或多种；所述连接层还可以由聚合物形成；所述连接层可以由天然或合成聚合物形成；合适的聚合物包括胶原蛋白、明胶、透明质酸、壳聚糖、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯、淀粉接枝共聚物及其衍生物和组合物中的一种或者多种；具体的，定向金属钛材料表面接枝基因载体材料的制造及其性能评价：1、材料制备1.1 表面定向样品的制备1.1.1 定向金属钛材料样品的制备首先将商业纯钛棒材在1073k下真空退火2小时，得到完全再结晶的均匀粗晶材料，经450℃高温挤压，获得直径为20mm的细棒。再将其常温旋转挤出，获得直径为8mm的细棒。最后，将细棒在475
°
c高温下进一步退火6分钟，成功获得纤维状晶粒纯钛（ti），所制备的纤维状材料的纤维状晶粒沿长轴方向的织构取向（纵向截面）。陶瓷羟基磷灰石材料、矿物质碳纳米管材料用此制备方法制备困难、得到材料定向效果不稳定，因此在此制备方法下采用商业纯钛棒材进一步实验。
61.将ti加工成8
×8×
1.5mm3的薄片，加工完后用丙酮、乙醇和去离子水超声清洗15min。60
°
c烘箱烘干后，表面分别经过180、800、1500和2000目的砂纸进行打磨抛光。之后用丙酮、乙醇和去离子水各清洗3次，每次15min，经60℃烘箱干燥。然后用8%(v/v)氢氟酸与5.5%（v/v）硝酸配制的酸液对钛片进行酸蚀约30s，再用去离子水清洗3 次，干燥备用。
62.1.1.2 定向陶瓷羟基磷灰石样品的制备取直径50 um左右的羟基磷灰石粉末（ha）44 g，将1.2g丙烯酰胺、0.16gn,n'-亚甲
基双丙烯酰胺和0.9g柠檬酸铵溶解在10ml去离子水中，然后ha粉末加入到配制好的预混液中并搅拌，配制成流动性优异、稳定性高的浆料。
63.使用 3d 建模软件创建 3d 模型，并将模型导出为 stl（立体光刻）文件格式。 然后，将stl文件导入切片软件并设置适当的打印参数，导出g代码文件，并将其保存在sd卡上。g 代码文件从 sd 卡导入 3d 打印机。 此后，将配制好的浆料装入滚筒中，由计算机文件控制浆料的印刷。 本研究中打印ha支架的具体过程如下。使用creo软件创建18
ꢁ×ꢁ
18
ꢁ×ꢁ5ꢁ
mm3模型，并将模型保存为stl文件。 将stl文件导入cure软件中，打印速度、层高、针直径和基板加热温度分别设置为5 mm/s、0.3 mm、0.5 mm和25℃。 将切片模型保存为g代码文件，从sd卡输入3d打印机，然后使用文件程序打印ha支架。
64.1.1.3 定向碳纳米管样品的制备采用化学气相沉积( cvd )技术制备定向碳纳米管阵列。以电阻炉作为加热器具，以石英玻璃管作为反应器，以石英玻璃片作为排列的碳纳米管的生长反应器，安装在石英舟上，并安装在反应室的中部。 碳源、催化剂和载气（蒸汽和氧气）从石英管的一端引入，废气从另一端排出。 碳源为一氧化物或碳氢化合物，如苯乙烯、乙烷、丙烯、丙烯等，碳源的流量由质量流量计控制阀控制。 为了得到定向控制纳米管的生长，用氢气或其他气体清洗反应器，直至反应器达到反应温度，然后切换气体为碳源，开始生长定向碳纳米管阵列，结束后然后切换回惰性气体，等待冷却，取出样品。
65.1.2 材料表面相转变溶菌酶（p）涂层的制备为赋予金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料表面正电荷，本发明采用相变溶菌酶溶液对其进行表面改性。通俗地说，称取50mg溶菌酶溶于10mm的hepes缓冲溶液，使其终浓度为5.0mg/ml；同样地，称取143.3mgtcep溶于10mm的hepes缓冲溶液，使其终浓度为50mm，然后将两种溶液等体积比例混合，在tcep的作用下溶菌酶发生相转变，这一过程在几分钟内快速形成。然后取适量相转变溶菌酶溶液（p）分别滴加在金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料上，在室温下孵育2h以实现完全的相转变涂层。然后，将钛片取出，置于去离子水中冲洗，并在氮气流下干燥。最后，在金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料表面得到了一层无色透明的稳定的p涂层。
66.1.3 材料表面多层基因薄膜的制备可采用层层自组装（lbl）技术在金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料表面组装多层基因薄膜。具体的实验步骤如下：（1）首先采用注入法制备1mg/ml的rls阳离子自组装体。具体过程如下：取1mgrls溶解于100μldmso，将其滴加入搅拌下的900μl去离子水中，滴加完后继续搅拌0.5~1h，使rls形成自组装体。
67.（2）将金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料底物浸入100ng/μldna溶液中20min，用去离子水冲洗3 次，每次冲洗1min。
68.（3）然后将上一步的金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料浸入rls溶液中20min，用去离子水冲洗3 次。
69.（4）重复（2）、（3）过程6次，形成（dna@rls）n膜（n表示薄膜层数）。分别得到了fgti-p-(dna@rls)1、fgti-p-(dna@rls)6、cgti-p-(dna@rls)6、ha-p-(dna@rls)1、ha-p-(dna@rls)6、c-p-(dna@rls)1、c-p-(dna@rls)6材料，最后冲洗步骤后，在氮流下干燥基材并保存
在4℃冰箱中。
70.2、扫描电镜观察通过扫描电子显微镜(sem) (捷欧路公司生产的jeol jsm-840f)检测所得材料fgti、fgti-ptl、fgti-p-(dna@rls)1、fgti-p-(dna@rls)6、cgti-p-(dna@rls)6、ha-p-(dna@rls)1、ha-p-(dna@rls)6、c-p-(dna@rls)1、c-p-(dna@rls)6的微观结构。通过在15kv电压和145ma电流下运行的高分辨率微x射线计算机断层扫描(μ-ct)系统(瑞士scanco医疗生产的μct40)分析样品的孔尺寸和尺寸分布。dualbeamtm-sem/fib系统(fei nova 600nanolab)，配备有能量色散x射线分析(edax) (edax genesis)，结合了超高分辨率场发射sem和精确聚焦离子束(fib)蚀刻和沉积，该系统用于内部微观结构检测和局部元素分析。
71.图11为本发明实施例2 fgti、fgti-ptl、fgti-p-(dna@rls)1、fgti-p-(dna@rls)6、cgti-p-(dna@rls)6扫描电镜示意图；展现了定向金属钛材料表面，以及定向金属钛材料组装基因载体rls表面的定向结构，在非定向钛层层组织基因载体rls则无法形成定向结构。
72.3、qpcr为了评估纤维取向对成骨分化的影响，将fgti、fgti-p-(dna@rls)
1、
fgti-p-(dna@rls)
6、
cgti-p-(dna@rls)6、ha-p-(dna@rls)1、ha-p-(dna@rls)6、c-p-(dna@rls)1、c-p-(dna@rls)6材料放入48孔板。将bmsc细胞在样品的上表面培养3天、7天、14天后，在mrna 水平上检测骨生长增殖相关标记物的表达生长。根据制造商的方案，用trizol（invitrogen，美国）提取总细胞 rna 。在相同条件下在空白培养基上培养的 mc3t3-e1 作为对照。然后，使用带有 gdna 擦除器（takara，日本）的 primescript
™ꢀ
rt 试剂盒对每个样品的约 500 ng rna 进行逆转录。
73.qrt-pcr 使用 sybr green premix（takara，日本）在 light cycler 设备（roche，switzerland）上进行。pcr 循环包括 40 个循环的模板dna 扩增，引物在 60
ꢀ°
c 退火。所有引物（invitrogen，美国）均使用 primer 5.0 软件设计并总结于表2中。gapdh被用作参考管家基因，然后使用 2 ‑
δδct
方法计算目标基因的相对表达水平。最终数据表示为相对于对照表达水平的倍数变化。
74.表2用于qpcr引物基因引物序列(5'-3')ocnf:ccccctctagcctaggaccr:accaggtaatgccagtttgcrunxf:ccgagctacgaaatgcctctr:ggaccgtccactgtcactttbmp2f:gactaccagaaacgagtgggaar:gcatctgttctcggaaaacctcol1af:caagggcattaggggacacar:acccacacttccatcgcttcopnf:agttgcggacaactcctttgr:tgccttctccctctgagtalpf:gacccttgacccccacaatr:gctcgtactgcatgtcccctgapdhf:ggagcgagatccctccaaaatr:ggctgttgtcatacttctcatgg
75.如图12-图15所示，为其中定向金属钛材料组装基因载体材料对成骨相关基因表达包括骨形态发生蛋白2（bmp2）、i型胶原（col1a)、骨桥蛋白（opn）表达量和碱性磷酸酶（alp）与定向金属钛材料、非定向金属钛材料组装基因载体材料的相关基因表达量对比，结果表明，细胞培养3天、7天、14天后，对成骨相关基因表达包括i型胶原（col1a)、碱性磷酸酶（alp）、骨形态发生蛋白-2（bmp2）和骨桥蛋白（opn）表达量进行检测。定向金属钛材料组装
基因载体材料相关基因表达量明显高于定向金属钛材料、非定向金属钛材料组装基因载体材料的相关基因表达量。
76.综上所述，本发明公开一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料及制备方法，属于生物材料技术领域。所述一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料，将具有定向结构的柔性材料连接到表面有定向结构的硬性材料上的，材料包括含有硬性材料的基底，含有柔性材料基体，使得基底和基体进行连接的界面连接层。其中硬性材料和柔性材料都具有定向结构，且定向尺寸都在10μm至约100μm之间，硬性材料提供高强度和高硬度支持骨的力学结构，柔性材料模拟骨细胞微环境，提供营养物质，此种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料不仅能促进骨细胞增殖分化，加速新骨的生长，还能诱导细胞分泌具有定向结构的细胞外间，在修复骨缺损与功能重建领域有极大的应用前景。
77.至此，本领域技术人员认识到，虽然本文已详尽展示和描述了本发明的实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导符合本发明原理的许多其他变形或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变形或修改。

技术特征：
1.一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料，其特征在于，所述具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料包括具有定向结构的柔软柔性材料作为基体，具有定向结构的高硬度高强度硬性材料作为基底，连接层为使得基底和基体进行连接的界面，所述基体植入组织中首先接触组织周边环境；所述基底在基体接触组织周围环境同时或之后接触到组织环境；所述连接层位于所述基底与所述基体相接触的区域；所述定向结构是材料具有指定方向的空间排列结构形貌，指定方向是在拓扑空间中指向或方向的一种选择；所述基体材料由天然的聚合物或者合成的聚合物形成；所述聚合物包括糖胺聚糖、胶原蛋白、明胶、透明质酸、纤维蛋白、聚乳酸、几丁质、淀粉接枝共聚物及其衍生物和组合物中的一种或者多种；所述基体材料还包括分子量小或厚度为纳米级别的基因载体、生长因子、促进组织再生的药物；包括成纤维细胞生长因子fgf、血管内皮生长因子vegf、骨形态发生蛋白bmp、骨钙素oc、骨特异性碱性磷酸酶bsap、淫羊藿苷ica中的一种或者多种；所述基底材料为金属、陶瓷、矿物质中的一种或者多种。2.如权利要求1所述的一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料，其特征在于，所述基底材料定向结构尺寸为10μm至100μm之间，所述基体材料定向结构尺寸为10μm至20μm之间；所述基底和基体具有与骨缺损部位相适应形状，形状包括正方体、圆柱体、球体、不规则形态；所述定向结构可以为卷曲结构，诱导齿骨生长。3.如权利要求1所述的一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料，其特征在于，所述连接层连接形式为化学交联、层层组装、静电吸附、熔融连接中的一种或多种；所述连接层由聚合物形成；所述聚合物包括胶原蛋白、明胶、透明质酸、壳聚糖、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯、淀粉接枝共聚物及其衍生物和组合物中的一种或者多种；所述基底和所述基体存在部分重叠，且连接层存在于该重叠区域中。4.如权利要求1所述的一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料，其特征在于，所述具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料为：将具有定向结构的柔性材料i型胶原col、壳聚糖cs、聚乳酸pla、明胶gel、基因载体rls接枝到表面有定向结构的硬性材料金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石ha、矿物质碳纳米管c上；所述金属钛材料硬度大于等于7，强度大于等于20kpa；所述i型胶原col硬度小于7，强度小于20kpa。5.如权利要求1所述的一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料，其特征在于，所述基体材料与基底材料定向交联、黏附或层层组装，形成定向柔性材料层，或者基体材料分子量小，或者基体材料厚度足够薄，能够充分暴露底部定向结构，形成类似双层定向结构特征；所述基体具有不同形状，包括正方体、圆柱体、球体、不规则形态；所述基体形状和大小同于基底或者不同于基底。6.一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：步骤s1：材料制备：将金属钛材料加工制备出沿一定方向取向的金属钛材料；将陶瓷羟基磷灰石粉末材料利用3d打印技术按照特定程序打印出一定形状、沿一定方向取向的陶瓷羟基磷灰石粉末材料；将矿物质碳纳米管材料采用化学气相沉积 cvd 技术制备定向碳纳米管阵列；步骤s2：材料表面氧化：将步骤s1中制备的沿一定方向取向的金属钛材料在氢氧化钠
中浸泡一段时间，再放入去离子水中浸泡一段时间，然后在真空下干燥，得到了表面修饰了-oh的金属钛材料；陶瓷羟基磷灰石粉末材料表面含有丰富-oh，无需氧化；定向碳纳米管阵列干燥用臭氧/紫外处理一段时间，得到表面修饰了-oh的碳纳米管材料；步骤s3：材料表面硅烷化：将上述步骤s2中处理好的金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料在硅烷偶联剂中浸泡一段时间，得到表面修饰-nh2的金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料，即aps 涂层样品；然后aps 涂层样品在甲醇溶液和去离子水中超声，然后在进一步改性前进行干燥；步骤s4：定向水凝胶制备：将胶原蛋白、壳聚糖、聚乳酸、明胶四种材料溶解在六氟异丙醇hfip和乙酸的溶剂混合物中，制备静电纺丝溶液；将制备的静电纺丝溶液利用纺丝机器继续纺丝，得到定向水凝胶；将定向水凝胶电纺丝胶原膜切成一定尺寸进行后续步骤实验；步骤s5：定向水凝胶固定到表面修饰-nh2的金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料：将步骤s4中处理好的电纺丝胶原膜分别放在步骤s3中处理好的表面修饰-nh2的金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料表面，并分别浸泡在交联液中一段时间；浸泡后，再置于pbs中浸泡，再用去离子水冲洗，最后冷冻干燥，得到最终具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料；所述步骤s2中的金属钛材料表面氧化包括碱热处理、紫外活化法、电化学氧化法、酸蚀刻法中的一种或多种；所述步骤s4中的定向水凝胶制备方法包括静电纺丝、微流控系统法、反向旋转挤压法、旋涂法、表面接触、3d 打印、外加电场中的一种或多种。7.如权利要求6所述的一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中金属钛材料加工制备包括高温挤压法、3d打印法、化学沉积法、磁控溅射法、电化学蚀刻法、激光烧蚀法其中一种或多种，得到所需特定结构；所述步骤s3中的硅烷偶联剂是aps、乙烯基硅烷、氨基硅烷、环氧基硅烷、巯基硅烷其中一种或多种；所述步骤s5中的交联液是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺edc、n-羟基琥珀酰亚胺nhs、戊二醛、京平尼、碳化二亚胺、己异二氰酸酯、叠氮二苯膦、双醛聚乙二醇其中一种或多种。8.如权利要求6所述的一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料引入氨基、羧基、醛基至少其中一种或多种基团，与定向水凝胶上的氨基、羧基基团至少其中一种或多种化学交联，产生酰胺键、二硫键、缩醛键、缩酮键、腙键以及原酸酯键中的一种或几种，使得基底和基体紧密连接。9.一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：步骤s1：材料表面相转变溶菌酶涂层的制备：称取粘合剂溶菌酶溶于缓冲溶液，与cep的缓冲溶液等体积比例混合，然后取适量相转变溶菌酶溶液滴加在金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料表面，在室温下孵育；去离子水冲洗，氮气流下干燥；最后在金属钛材料、陶瓷羟基磷灰石粉末材料、碳纳米管材料表面得到稳定的溶菌酶涂层，即连接层；步骤s2：材料表面多层基因薄膜的制备：采用层层自组装lbl技术在步骤s1中得到的溶菌酶涂层金属钛材料、溶菌酶涂层陶瓷羟基磷灰石粉末材料、溶菌酶涂层碳纳米管材料表
面组装多层基因薄膜；制备出rls阳离子自组装体；将溶菌酶涂层金属钛材料、溶菌酶涂层陶瓷羟基磷灰石粉末材料、溶菌酶涂层碳纳米管材料分别依次浸入 dna溶液和rls溶液中，重复多次，最后去离子水冲洗，在氮流下干燥基材，得到最终具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料；所述步骤s1中的粘合剂为溶菌酶、聚维酮、羟丙甲纤维素、羧甲纤维素钠中的一种或几种；所述步骤s2中溶菌酶涂层金属钛材料、溶菌酶涂层陶瓷羟基磷灰石粉末材料、溶菌酶涂层碳纳米管材料表面组装多层基因薄膜的制备采用层层组装和粘合剂的方式，或者采用静电吸附、熔融、化学交联连接方式中的一种或者多种。10.如权利要求9所述的一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中的重复多次为重复6次。

技术总结
本发明公开一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料及制备方法，属于生物材料技术领域。所述一种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料，将具有定向结构的柔性材料连接到表面有定向结构的硬性材料上的，材料包括含有硬性材料的基底，含有柔性材料基体，使得基底和基体进行连接的界面连接层。其中硬性材料和柔性材料都具有定向结构，且定向尺寸都在10μm至约100μm之间，硬性材料提供高强度和高硬度支持骨的力学结构，柔性材料模拟骨细胞微环境，提供营养物质，此种具有多层定向结构的骨缺损修复复合材料不仅能促进骨细胞增殖分化，加速新骨的生长，还能诱导细胞分泌具有定向结构的细胞外间质，在修复骨缺损与功能重建领域有极大的应用前景。有极大的应用前景。有极大的应用前景。


技术研发人员：聂宇 李明珠 金蓉蓉 李娟 黄崇湘 张兴栋
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2023.08.02
技术公布日：2023/9/7