可调节骨骼发育的长双歧杆菌婴儿亚种及其应用

1.本发明涉及可调节骨骼发育的长双歧杆菌婴儿亚种及其应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.骨发育在成长过程中是非常重要的。儿童和青少年期间，骨骼是不断生长和发育的阶段，骨量、骨密度和骨质都会随着年龄的增长而增加。成年后，骨骼的生长和发育将逐渐停止，此时骨骼将进入稳定的状态。在成长过程中，良好的骨发育能够带来诸多好处，如：预防骨折：良好的骨发育可以使骨骼更加强壮，从而减少骨折风险；预防骨质疏松症：骨质疏松症是一种骨质量过低的疾病，良好的骨发育可以减少其发生的可能性；提高运动能力：良好的骨发育可以提高骨骼的强度和稳定性，从而增强运动能力和体力；预防姿势异常和脊柱侧弯：良好的骨发育可以促进正常姿势和脊柱生长发育，减少姿势异常和脊柱侧弯等问题。因此，良好的骨发育在成长过程中扮演着非常重要的角色。在儿童和青少年期间应及时采取相关措施，以促进骨发育和维持骨健康。而成年后，也应保持健康饮食和合理的运动方式，以维持骨骼的健康状态。
3.骨的代谢由骨的形成和吸收来平衡。当骨形成占主导地位时，它的特点是骨形成和新陈代谢，否则，就以吸收和分解代谢为主。据了解，宿主的代谢途径、免疫系统和荷尔蒙环境可以影响这种骨代谢平衡。研究发现，益生菌在维持肠道微生物平衡、促进肠道健康、增强免疫力等方面起着极为重要的作用。而肠道健康和骨发育之间存在密切的关系。益生菌可以通过一系列机制来影响骨发育，包括促进钙吸收、改善肠道菌群、降低炎症反应等。因此，研究益生菌对骨发育的影响非常有意义。目前研究发现，鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌及嗜酸乳杆菌对骨骼肌肉参数有一定的调节作用，比如降低骨吸收、增加血清igf-1、增加treg细胞降低th17细胞数量，而对于双歧杆菌，目前研究主要集中于其对骨质流失的改善作用，例如：假小链双歧杆菌cect7765改善肥胖引起的骨量流失，长双歧杆菌通过调节bmp-2增加骨密度，而长双歧杆菌婴儿亚种作为婴儿肠道的优势菌株，如何影响骨骼发育并未有较多的报道，因此找到具有调节骨骼发育的长双歧杆菌婴儿亚种具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明提供了长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269在制备增强骨骼发育的产品中的应用。
5.在一种实施方式中，所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269，分类学命名为bifidobacterium longumsubsp.infantis，已公开于专利号为cn115820488a的专利中。
6.在一种实施方式中，所述增强骨骼发育是提高生命早期股骨长度及骨骼稳态，包括如下至少一种作用：
7.(1)提高生命早期哺乳动物股骨长度；
8.(2)提高生命早期哺乳动物血清生长激素水平；
9.(3)提高生命早期哺乳动物血清中类胰岛素1号生长因子水平；
10.(4)提高生命早期哺乳动物血清中骨保护素水平；
11.(5)提高生命早期哺乳动物血清中骨钙素水平；
12.(6)提高生命早期哺乳动物血清中i型胶原n端前肽水平；
13.(7)降低生命早期哺乳动物血清中i型胶原c端肽水平。
14.在一种实施方式中，所述产品包括食品、药品或保健品。
15.在一种实施方式中，所述食品包括促进骨骼发育。
16.在一种实施方式中，所述药品包括改善骨骼发育不良。
17.在一种实施方式中，所述保健品用于辅助改善骨密度。
18.在一种实施方式中，所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269的形态包括菌液、冻干粉或发酵组合物。
19.本发明还提供一种用于增强骨骼发育的产品，含有长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269，所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269的活菌数不低于1
×
109cfu/g。
20.在一种实施方式中，所述产品用于提高生命早期哺乳动物股骨长度及骨骼稳态。
21.在一种实施方式中，所述调节股骨长度及骨骼稳态包括如下至少一种作用：
22.(1)提高生命早期哺乳动物股骨长度；
23.(2)提高生命早期哺乳动物血清生长激素水平；
24.(3)提高生命早期哺乳动物血清中类胰岛素1号生长因子水平；
25.(4)提高生命早期哺乳动物血清中骨保护素水平；
26.(5)提高生命早期哺乳动物血清中骨钙素水平；
27.(6)提高生命早期哺乳动物血清中i型胶原n端前肽水平；
28.(7)降低生命早期哺乳动物血清中i型胶原c端肽水平。
29.有益效果：
30.1、本发明筛选出了具有调节股骨长度及骨骼稳态的长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacterium longumsubsp.infantis)ccfm1269，具体体现在：
31.(1)提高生命早期哺乳动物股骨长度；
32.(2)提高生命早期哺乳动物血清生长激素水平；
33.(3)提高生命早期哺乳动物血清中类胰岛素1号生长因子水平；
34.(4)提高生命早期哺乳动物血清中骨保护素水平；
35.(5)提高生命早期哺乳动物血清中骨钙素水平；
36.(6)提高生命早期哺乳动物血清中i型胶原n端前肽水平；
37.(7)降低生命早期哺乳动物血清中i型胶原c端肽水平。
38.2、本发明的长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269为食品安全菌株，可用于制备调节股骨长度及骨骼稳态的产品，具有巨大的应用前景。
39.3、本发明的长双歧杆菌婴儿亚种的培育过程仅需培养基以及一些培养条件的控制，成本相对低廉，易于实现工业化生产。
附图说明
40.图1：不同组生命早期哺乳动物股骨长度；*,与control组相比，p《0.05；
41.图2：不同组生命早期哺乳动物血清生长激素水平；*,与control组相比，p《0.05；
42.图3：不同组生命早期哺乳动物血清中类胰岛素1号生长因子水平；*,与control组相比，p《0.05；
43.图4：不同组生命早期哺乳动物血清中骨保护素水平；*,与control组相比，p《0.05；
44.图5：不同组生命早期哺乳动物血清中骨钙素水平；*,与control组相比，p《0.05；
45.图6：不同组生命早期哺乳动物血清中i型胶原n端前肽水平；*,与control组相比，p《0.05；
46.图7：不同组生命早期哺乳动物血清中i型胶原c端肽水平；*,与control组相比，p《0.05。
具体实施方式
47.下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
48.下述实施例中涉及的balb/c小鼠购自浙江维通利华公司；下述实施例中涉及的长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269由江南大学食品学院食品生物技术中心分离得到；
49.下述实施例中涉及的检测试剂如下：
50.生长激素、骨钙素、骨保护素等指标的elisa试剂盒购自福麦斯。
51.下述实施例中涉及的培养基如下：
52.mrs固体培养基：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·
3h2o2.6g/l、mgso4·
7h2o0.1g/l、mnso40.05g/l、吐温80 1ml/l、琼脂15g/l。
53.mrs液体培养基：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·
3h2o2.6g/l、mgso4·
7h2o0.1g/l、mnso40.05g/l、吐温80 1ml/l。
54.下述实施例中所使用的长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269已公开于专利号为cn115820488a的专利中，保藏编号为gdmccno：62839。长双歧杆菌婴儿亚种种bifidobacteriumlongumsubsp.infantisi5ti，原始编号：fjswxi5tim1，已公开于论文《长双歧杆菌婴儿亚种的功能基因组及其对dss诱导的结肠炎的影响研究》中。
55.实施例1：长双歧杆菌婴儿亚种菌悬液的制备
56.长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269菌液按如下方法制备：
57.蘸取长双歧杆菌婴儿亚种菌液在mrs固体培养基上划线，37℃培养48h，得到单菌落；
58.挑取单菌落接入mrs液体培养基中，于37℃培养24h，得到活化液；将活化液按照1％(v/v)的接种量接入mrs液体培养基中，于37℃培养24h，得到一级种子液；
59.将一级种子液按照1％(v/v)的接种量接入mrs液体培养基中，于37℃培养24h，得到二级种子液；
60.将二级种子液按照1％(v/v)的接种量接入mrs液体培养基中，于37℃培养24h，得到菌液；将菌液6000g离心15min，收集沉淀；将沉淀用生理盐水缓冲液洗涤两次后，6000g再次离心10min，得到菌体；用生理盐水将乳酸菌菌体重悬至细胞浓度为1
×
109cfu/ml，得到长双歧杆菌婴儿亚种菌液。
61.实施例2：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269对雌雄幼鼠股骨长度的影响
62.取6周龄的雄性无病原体(spf)balb/c雌鼠36只，雄鼠18只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，按照雌雄2：1合笼，待雌鼠怀孕后，拿出雄鼠，妊娠期3周，幼鼠出生1周龄开始灌胃，分为control组(灌胃生理盐水)，ccfm1269及i5ti组(灌胃长双歧杆菌婴儿亚种种bifidobacteriumlongumsubsp.infantisi5ti，原始编号：fjswxi5tim1，已公开于论文《长双歧杆菌婴儿亚种的功能基因组及其对dss诱导的结肠炎的影响研究》中)。灌胃至3、4、5周龄。
63.动物适应性饲养1周后开始实验，实验共10周。具体处理如下：
64.对照组(control)：出生后1周开始灌胃10μl生理盐水；
65.长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269组：出生后1周开始灌胃10μl对应菌悬液，使灌胃总量为1
×
109cfu/只/天。
66.长双歧杆菌婴儿亚种i5ti组：出生后1周开始灌胃10μl对应菌悬液，使灌胃总量为1
×
109cfu/只/天。
67.随着小鼠周龄变化，灌胃体积根据体重增大，但保持灌胃总量为1
×
109cfu/只/天，灌胃至3、4、5周龄，实验结束后，取雌雄幼鼠全血，离心后取血清，用游标卡尺量取小鼠股骨长度，测定结果分别见图1。
68.由图1可知，雌鼠3周龄正常组股骨长度为9.30mm，雌鼠3周龄ccfm1269组为9.95mm，雌鼠3周龄i5ti组为9.65mm；雄鼠3周龄正常组股骨长度为10.18mm，雄鼠3周龄ccfm1269组为10.70mm；雄鼠3周龄i5ti组为10.56mm；雌鼠4周龄正常组股骨长度为10.24mm，雌鼠4周龄ccfm1269组为10.80mm，雌鼠4周龄i5ti组为10.64mm；雄鼠4周龄正常组股骨长度为10.76mm，雄鼠4周龄ccfm1269组为11.39mm；雄鼠4周龄i5ti组为11.21mm；雌鼠5周龄正常组股骨长度为11.28mm，雌鼠5周龄ccfm1269组为11.96mm，雌鼠5周龄i5ti组为11.77mm；雄鼠5周龄正常组股骨长度为11.84mm，雄鼠5周龄ccfm1269组为12.48mm；雄鼠5周龄i5ti组为12.30mm。
69.实施例3：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269对雌雄幼鼠血清生长激素水平的影响
70.取雌雄幼鼠血清，通过elisa试剂盒测定每组小鼠血清生长激素水平，测定结果分别见图2。
71.生长激素能够促进生长，促进骨、软骨、肌肉和其他组织细胞的分裂增殖和蛋白质的合成，从而加速骨骼和肌肉的生长发育。ccfm1269灌胃后3周龄和四周龄雌雄鼠血清生长激素水平显著高于正常组；3周龄雌鼠正常组血清生长激素浓度为12.48μg/l，3周龄雌鼠ccfm1269组为13.82μg/l；3周龄雌鼠i5ti组为13.00μg/l；3周龄雄鼠正常组血清生长激素浓度为13.68μg/l，3周龄雄鼠ccfm1269组为15.42μg/l；3周龄雄鼠i5ti组为15.42μg/l；4周龄雌鼠正常组血清生长激素浓度为15.49μg/l，4周龄雌鼠ccfm1269组为16.58μg/l；4周龄雌鼠i5ti组为16.35μg/l；4周龄雄鼠正常组血清生长激素浓度为16.09μg/l，4周龄雄鼠ccfm1269组为17.34μg/l；4周龄雄鼠i5ti组为17.27μg/l；五周龄差异不显著。
72.实施例4：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269对雌雄鼠血清类胰岛素1号生长因子水平的影响
73.小鼠的分组和造模同实施例3。实验结束后，取血并处死小鼠，通过elisa试剂盒测定每组小鼠血清中类胰岛素1号生长因子水平，检测结果见图3。
74.类胰岛素一号生长因子。也被称作“促生长因子”。在婴儿的生长和在成人体内持续进行合成代谢作用上具有重要意义，促进骨的合成代谢保持其正常结构功能。ccfm1269灌胃后4周龄和5周龄雌雄鼠血清类胰岛素1号生长因子水平显著高于正常组；3周龄差异不显著；4周龄雌鼠正常组血清类胰岛素1号生长因子浓度为18.64μg/l，4周龄雌鼠ccfm1269组为22.34μg/l；4周龄雌鼠i5ti组为20.89μg/l；4周龄雄鼠正常组血清类胰岛素1号生长因子浓度为19.77μg/l，4周龄雄鼠ccfm1269组为23.03μg/l；4周龄雄鼠i5ti组为21.33μg/l。5周龄雌鼠正常组血清类胰岛素1号生长因子浓度为25.41μg/l，5周龄雌鼠ccfm1269组为28.58μg/l；5周龄雌鼠i5ti组为28.39μg/l；5周龄雄鼠正常组血清类胰岛素1号生长因子浓度为26.93μg/l，5周龄雄鼠ccfm1269组为30.92μg/l；5周龄雄鼠i5ti组为29.26μg/l。
75.实施例5：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269对雌雄幼鼠血清骨保护素水平的影响
76.小鼠的分组和造模同实施例3。实验结束后，取血并处死小鼠，通过elisa试剂盒测定每组小鼠血清中骨保护素水平，检测结果见图4。
77.骨保护素可抑制破骨细胞发生，促进成熟破骨细胞凋亡。ccfm1269灌胃后3、4、5周龄雌雄鼠血清骨保护素水平显著高于正常组；3周龄雌鼠正常组血清骨保护素浓度为0.71μg/l，3周龄雌鼠ccfm1269组为0.93μg/l；3周龄雌鼠i5ti组为0.85μg/l；3周龄雄鼠正常组血清骨保护素浓度为0.95μg/l，3周龄雄鼠ccfm1269组为0.98μg/l；3周龄雄鼠i5ti组为0.95μg/l；4周龄雌鼠正常组血清骨保护素浓度为0.76μg/l，4周龄雌鼠ccfm1269组为0.94μg/l；4周龄雌鼠i5ti组为0.83μg/l；4周龄雄鼠正常组血清骨保护素浓度为0.88μg/l，4周龄雄鼠ccfm1269组为0.98μg/l；4周龄雄鼠i5ti组为0.91μg/l；5周龄雌鼠正常组血清骨保护素浓度为0.76μg/l，5周龄雌鼠ccfm1269组为0.98μg/l；5周龄雌鼠i5ti组为0.83μg/l；5周龄雄鼠正常组血清骨保护素浓度为0.96μg/l，5周龄雄鼠ccfm1269组为1.08μg/l；5周龄雄鼠i5ti组为1.02μg/l。
78.实施例6：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269对雌雄鼠血清骨钙素水平的影响
79.小鼠的分组和造模同实施例3。实验结束后，取血并处死小鼠，通过elisa试剂盒测定每组小鼠血清中骨钙素水平，检测结果见图5。
80.骨钙素为反映成骨细胞功能敏感标志。ccfm1269灌胃后3、4、5周龄雌雄鼠血清骨钙素水平显著高于正常组；3周龄雌鼠正常组血清骨钙素浓度为13.94μg/l，3周龄雌鼠ccfm1269组为18.57ng/l；3周龄雌鼠i5ti组为15.24ng/l；3周龄雄鼠正常组血清骨钙素浓度为18.21ng/l，3周龄雄鼠ccfm1269组为20.75ng/l；3周龄雄鼠i5ti组为18.92ng/l；4周龄雌鼠正常组血清骨钙素浓度为15.24ng/l，4周龄雌鼠ccfm1269组为18.65ng/l；4周龄雌鼠i5ti组为18.56ng/l；4周龄雄鼠正常组血清骨钙素浓度为18.75ng/l，4周龄雄鼠ccfm1269组为21.16ng/l；4周龄雄鼠i5ti组为19.95ng/l；5周龄雌鼠正常组血清骨钙素浓度为23.49ng/l，5周龄雌鼠ccfm1269组为26.82ng/l；5周龄雌鼠i5ti组为25.02ng/l；5周龄雄鼠正常组血清骨钙素浓度为24.68ng/l，5周龄雄鼠ccfm1269组为30.30ng/l；5周龄雄鼠i5ti组为28.75ng/l。
81.实施例7：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269对雌雄鼠血清i型胶原n端前肽水平影响
82.小鼠的分组和造模同实施例3。实验结束后，取血并处死小鼠，通过elisa试剂盒测定每组小鼠血清中i型胶原n端前肽水平，检测结果见图6。
83.血清中i型前胶原氨基末端肽为反映骨形成敏感性较高的标志物。ccfm1269灌胃后3、4、5周龄雌雄鼠血清i型前胶原氨基末端肽水平显著高于正常组；3周龄雌鼠正常组血清i型前胶原氨基末端肽浓度为6.51μg/l，3周龄雌鼠ccfm1269组为7.65μg/l；3周龄雌鼠i5ti组为7.16μg/l；3周龄雄鼠正常组血清i型前胶原氨基末端肽浓度为8.19μg/l，3周龄雄鼠ccfm1269组为8.86μg/l；3周龄雄鼠i5ti组为8.53μg/l；4周龄雌鼠正常组血清i型前胶原氨基末端肽浓度为8.95μg/l，4周龄雌鼠ccfm1269组为12.21μg/l；4周龄雌鼠i5ti组为9.92μg/l；4周龄雄鼠正常组血清i型前胶原氨基末端肽浓度为10.04μg/l，4周龄雄鼠ccfm1269组为12.90μg/l；4周龄雄鼠i5ti组为11.57μg/l；5周龄雌鼠正常组血清i型前胶原氨基末端肽浓度为9.07μg/l，5周龄雌鼠ccfm1269组为10.01μg/l；5周龄雌鼠i5ti组为9.75μg/l；5周龄雄鼠正常组血清i型前胶原氨基末端肽浓度为10.56μg/l，5周龄雄鼠ccfm1269组为11.47μg/l；5周龄雄鼠i5ti组为11.28μg/l。
84.实施例8：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269对雌雄幼鼠i型胶原c末端肽水平影响
85.小鼠的分组和造模同实施例3。实验结束后，取血并处死小鼠，通过elisa试剂盒测定每组小鼠血清中i型胶原c末端肽水平，检测结果见图7。
86.i型胶原交联c-末端肽是反应骨吸收状况最敏感、最特异的指标。ccfm1269灌胃后，3和4周龄雌雄血清i型胶原c末端肽与对照组相比无显著差异，5周龄雌雄鼠血清i型胶原c末端肽水平显著低于正常组，证明ccfm1269可以有效降低骨吸收程度，有利于小鼠骨骼发育；5周龄雌鼠正常组血清i型胶原c末端肽浓度为6.78μg/l，5周龄雌鼠ccfm1269组为5.23μg/l；5周龄雌鼠i5ti组为6.11μg/l；雄鼠正常组血清i型胶原c末端肽浓度为6.38μg/l，5周龄雄鼠ccfm1269组为4.79μg/l；5周龄雄鼠i5ti组为5.91μg/l。
87.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.长双歧杆菌婴儿亚种(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ccfm1269在制备增强骨骼发育的产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述增强骨骼发育是提高生命早期股骨长度及骨骼稳态，包括如下至少一种作用：(1)提高生命早期哺乳动物股骨长度；(2)提高生命早期哺乳动物血清生长激素水平；(3)提高生命早期哺乳动物血清中类胰岛素1号生长因子水平；(4)提高生命早期哺乳动物血清中骨保护素水平；(5)提高生命早期哺乳动物血清中骨钙素水平；(6)提高生命早期哺乳动物血清中i型胶原n端前肽水平；(7)降低生命早期哺乳动物血清中i型胶原c端肽水平。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括食品、药品或保健品。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食品包括但不限于膳食补充剂。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药品包括促进骨骼发育的药品或改善骨骼代谢的药品。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述保健品用于辅助改善骨密度。7.根据权利要求1～6任一所述的应用，其特征在于，所述产品中长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269的活菌数不低于1
×
109cfu/g。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269的形态包括菌液、冻干粉或发酵组合物。9.一种用于增强骨骼发育的食品或药品，其特征在于，含有长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269，所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269的活菌数不低于1
×
109cfu/g。10.一种用于改善骨骼发育不良的保健品，其特征在于，含有长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269，所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm1269的活菌数不低于1
×
109cfu/g。

技术总结
本发明公开了可调节骨骼发育的长双歧杆菌婴儿亚种及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供的长双歧杆菌婴儿亚种可调节小鼠股骨长度及骨骼稳态，具体体现在：(1)提高生命早期哺乳动物股骨长度；(2)提高生命早期哺乳动物血清生长激素水平；(3)提高生命早期哺乳动物血清中类胰岛素1号生长因子水平；(4)提高生命早期哺乳动物血清中骨保护素水平；(5)提高生命早期哺乳动物血清中骨钙素水平；(6)提高生命早期哺乳动物血清中I型胶原N端前肽水平；(7)降低生命早期哺乳动物血清中I型胶原C端肽水平。水平。水平。


技术研发人员：杨波 丁梦帆 李博文 陈海琴 陈卫 赵建新 张灏
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.07.27
技术公布日：2023/9/7