一种规模化动静态在线细胞转染系统及应用

1.本发明涉及动物细胞的细胞转染技术领域，尤其是一种规模化动静态在线细胞转染系统及应用。


背景技术：

2.规模化细胞转染通常用于cho细胞瞬时转染低成本快速表达出足量的重组蛋白、hek293细胞转染生产腺相关病毒载体及慢病毒载体用于基因治疗与细胞治疗。其中磷酸钙法与阳离子聚合物法为规模化细胞转染常用方法，以磷酸钙或阳离子聚合物pei作为转染试剂与质粒dna混合形成磷酸钙-dna复合物或pei-dna复合物，再通过胞饮作用进入细胞，从而将质粒dna递送至细胞内，进行重组蛋白的生产或腺相关病毒载体与慢病毒载体的生产。以pei进行细胞转染为例，通常需要使用5％体积的培养基稀释质粒dna，使用5％体积的培养基稀释转染试剂，然后将两者混匀后静置孵育15分钟形成特定颗粒的转染复合物，随即立即加入至细胞培养液中，从而完成细胞转染过程。而在规模化细胞转染时，体积的增加导致难以在短时间内将转染试剂与质粒dna进行充分混匀，且孵育后的转染复合物加入至反应器中时耗费较长时间，通常引起过度孵育导致转染效率下降。通常细胞转染技术局限于50-200l规模以下，且手动操作导致孵育的转染复合物的批次间差异较大，极大程度上限制了该技术的规模化应用。
3.为此我们提出一种规模化动静态在线细胞转染系统及应用。


技术实现要素：

4.本技术人针对上述现有生产技术中的缺点，提供一种规模化动静态在线细胞转染系统及应用，从而转染复合物精准孵育与连续流加，使得转染复合物物理性质一致，简化规模化细胞转染工艺，提高转染效率，实现稳定的规模化细胞转染技术。
5.本发明所采用的技术方案如下：
6.一种规模化动静态在线细胞转染系统，包括质粒复合物容器、转染试剂复合物容器和反应器，还包括：
7.高效拟动态转染管路，其包括第一管路、第二管路、转染复合物动态混合管和转染复合物拟静态孵育管，转染复合物动态混合管一端与转染复合物拟静态孵育管连接，转染复合物动态混合管另一端通过三通与第一管路和第二管路连接，第一管路与质粒复合物容器连接，第二管路与转染试剂复合物容器，转染复合物拟静态孵育管与反应器连接；
8.双通道泵送系统，其设置在第一管路和第二管路上；
9.其中，转染复合物动态混合管内设置有混合填料模块，用于对质粒复合物与转染试剂复合物进行扰流混合形成转染复合物，转染复合物拟静态孵育管和转染复合物动态混合管之间具有夹角且向上倾斜，用于在转染复合物孵育特定时间后的流入反应器中与细胞进行结合并完成细胞转染。
10.其进一步特征在于：
11.还包括非侵入式流量计和控制器，非侵入式流量计设置在转染复合物拟静态孵育管上；质粒复合物容器放置在质粒复合物称重单元上，转染试剂复合物容器放置在转染试剂复合物称重单元上，控制器通过通讯线与双通道泵送系统、非侵入式流量计、质粒复合物称重单元和转染试剂复合物称重单元连接。
12.所述质粒复合物容器与转染试剂复合物容器内均放置有磁力搅拌转子，质粒复合物容器与转染试剂复合物容器底部均设置有磁力搅拌器。
13.所述第一管路和第二管路的内径相同，转染复合物动态混合管的内径大于等于第一管路和第二管路的内径，且小于转染复合物拟静态孵育管的内径。
14.所述高效拟动态转染管路通过辐照灭菌的形式进行预灭菌处理，使用无菌接管机或无菌快接头依次将第一管路与质粒复合物容器相连、第二管路与转染试剂复合物容器相连、转染复合物拟静态孵育管与反应器相连，形成闭合无菌管路。
15.所述转染复合物动态混合管还包括外壳，混合填料模块设置在外壳内。
16.所述转染复合物拟静态孵育管的流速可由公式计算得到：
[0017][0018]
其中：vf为转染复合物拟静态孵育管的流速，流速范围需控制在0.4-10厘米/分钟；lf为转染复合物拟静态孵育管的长度；tf为转染复合物孵育时间，也即转染复合物在转染复合物拟静态孵育管中的停留时间，转染复合物孵育时间通常设置为5-15分钟。
[0019]
所述转染复合物动态混合管的流速可由公式计算得到：
[0020][0021]
其中：vf为转染复合物拟静态孵育管的流速，sf为转染复合物拟静态孵育管的内截面积，vh为转染复合物动态混合管的流速，sh为转染复合物动态混合管的内截面积。
[0022]
所述双通道泵送系统的流量可由公式计算得到：
[0023][0024]
其中：q
p
为双通道泵送系统的流量，vf为转染复合物拟静态孵育管的流速，sf为转染复合物拟静态孵育管的内截面积。
[0025]
本发明还公开了一种规模化动静态在线细胞转染系统的应用，采用hek293无血清培养基培养悬浮hek293细胞，培养体积为100l，初始细胞密度为0.5
×
106cells/ml，待细胞密度生长至3-4
×
106cells/ml时，补加100l的hek293无血清培养基至培养体积为200l，采用上述转染系统进行细胞转染，转染后继续培养3天后进行收获。
[0026]
本发明的有益效果如下：
[0027]
本发明结构紧凑、合理，操作方便，质粒复合物与转染试剂复合物在双通道泵送系统的驱动下按照一定的流量比例进入转染复合物动态混合管，质粒复合物与转染试剂复合物在高流速与混合填料模块扰流的作用下进行充分混合形成转染复合物，随后进入转染复合物拟静态孵育管进行拟静态孵育，孵育一定时间后，转染复合物流动到转染复合物拟静态孵育管顶部并流入反应器中与细胞进行结合并完成细胞转染，转染复合物精准孵育与连续流加，使得转染复合物物理性质一致，简化规模化细胞转染工艺，提高转染效率，实现稳
定的规模化细胞转染技术。
[0028]
同时，本发明还具备如下优点：
[0029]
(1)高效拟动态转染管路通过辐照灭菌的形式进行预灭菌处理，使用无菌接管机或无菌快接头依次将第一管路与质粒复合物容器相连、第二管路与转染试剂复合物容器相连、转染复合物拟静态孵育管与反应器相连，形成闭合无菌管路，操作简单，便于保证转染的高效开展，有效避免外源物污染。
[0030]
(2)质粒复合物容器放置于质粒复合物称重单元上，质粒复合物称重单元将测量数据传输至控制器，控制器读取数据并计算累计质粒复合物添加量；转染试剂复合物容器放置于转染试剂复合物称重单元上，转染试剂复合物称重单元将测量数据传输至控制器，控制器读取数据并计算累计转染试剂复合物添加量，对转染过程的质粒复合物添加量与转染试剂复合物添加量实现审计追踪。
[0031]
(3)转染复合物拟静态孵育管和转染复合物动态混合管之间具有夹角且向上倾斜，夹角的范围为90-150
°
，确保混合后的转染复合物进入转染复合物拟静态孵育管后，可以在转染复合物拟静态孵育管停留特定时长进行孵育，确保精准控制转染复合物孵育时长。
[0032]
(4)控制器内的软件中已预置高效拟动态转染管路的参数，包括第一管路与第二管路的内径与长度、转染复合物动态混合管的内径与长度、转染复合物拟静态孵育管的内径与长度。通过输入所需的转染复合物孵育时间，控制器将自动设置并控制双通道泵送系统的流量，自动化程度高。
[0033]
(5)转染复合物动态混合管主要由外壳与混合填料模块组成，混合填料模块为球形、立方体、长条形、异形等形状，为实心或多孔结构，使得质粒复合物与转染试剂复合物在高流速与混合填料模块扰流的作用下进行充分混合形成转染复合物。
[0034]
(6)质粒复合物容器与转染复合物容器内可放置磁力搅拌转子，底部设置磁力搅拌器，在系统运行过程中保持质粒复合物容器与转染复合物容器内液体被搅拌混合均匀。
附图说明
[0035]
图1为本发明的转染系统示意图。
[0036]
图2为本发明的高效拟动态转染管路示意图。
[0037]
图3为本发明的转染复合物动态混合管的示意图。
[0038]
图4为本发明的软件操作流程示意图。
[0039]
图5为本发明用于悬浮hek293细胞转染生产腺相关病毒载体产量对比图。
[0040]
其中：1、高效拟动态转染管路；2、双通道泵送系统；3、非侵入式流量计；4、质粒复合物容器；5、质粒复合物称重单元；6、转染试剂复合物容器；7、转染试剂复合物称重单元；8、控制器；9、反应器；10、通讯线；11、第一管路；12、第二管路；13、转染复合物动态混合管；14、转染复合物拟静态孵育管；15、外壳；16、混合填料模块。
具体实施方式
[0041]
下面结合附图，说明本发明的具体实施方式。
[0042]
如图1所示，一种规模化动静态在线细胞转染系统，包括高效拟动态转染管路1、双
通道泵送系统2、非侵入式流量计3、质粒复合物容器4、质粒复合物称重单元5、转染试剂复合物容器6、转染试剂复合物称重单元7、控制器8和反应器9。
[0043]
双通道泵送系统2、非侵入式流量计3、质粒复合物称重单元5、转染试剂复合物称重单元7均通过通讯线10与控制器8相连，控制器8进行数据采集与反馈控制。
[0044]
质粒复合物容器4与转染复合物容器6内可放置磁力搅拌转子，底部设置磁力搅拌器，在系统运行过程中保持质粒复合物容器4与转染复合物容器6内液体被搅拌混合均匀。
[0045]
如图2所示，高效拟动态转染管路1包括第一管路11、第二管路12、转染复合物动态混合管13和转染复合物拟静态孵育管14。第一管路11与质粒复合物容器4连接，第二管路12与转染试剂复合物容器连接，第一管路11和第二管路12通过三通与转染复合物动态混合管13连接。转染复合物动态混合管13和转染复合物拟静态孵育管14连接，且转染复合物拟静态孵育管14和转染复合物动态混合管13之间具有夹角且向上倾斜，夹角的范围为90-150
°
。确保混合后的转染复合物进入转染复合物拟静态孵育管14后，可以在转染复合物拟静态孵育管14停留特定时长进行孵育，然后通过转染复合物拟静态孵育管14的顶部流入至反应器9中。
[0046]
转染复合物动态混合管13的内径等于或者略大于第一管路11和第二管路12的内径，且小于转染复合物拟静态孵育管14的内径。转染复合物动态混合管13的长度为5-20厘米，转染复合物拟静态孵育管14的内径是转染复合物动态混合管13内径的3-10倍，转染复合物拟静态孵育管14的长度为20-50厘米。
[0047]
高效拟动态转染管路1通过辐照灭菌的形式进行预灭菌处理。使用无菌接管机或无菌快接头依次将第一管路11与质粒复合物容器4相连、第二管路12与转染试剂复合物容器6相连、转染复合物拟静态孵育管14与反应器9相连，形成闭合无菌管路，操作简单，便于保证转染的高效开展，有效避免外源物污染。
[0048]
在生物安全柜内将所需培养基(略大于培养体积的5％，例如6％)与质粒dna加入至质粒复合物容器4中，轻轻摇晃均匀；将所需培养基(略大于培养体积的5％，例如6％)与转染试剂pei加入至转染试剂复合物容器6中，轻轻摇晃均匀；将质粒复合物容器4放置于质粒复合物称重单元5上、将转染试剂复合物容器6放置于转染试剂复合物称重单元7上；质粒复合物称重单元5将测量数据传输至控制器8，控制器8读取数据并计算累计质粒复合物添加量；转染试剂复合物称重单元7将测量数据传输至控制器8，控制器8读取数据并计算累计转染试剂复合物添加量，对转染过程的质粒复合物添加量与转染试剂复合物添加量实现审计追踪；将第一管路11与第二管路12分别安装于双通道泵送系统2上；将非侵入式流量计3安装于转染复合物拟静态孵育管14上；将转染复合物拟静态孵育管保持向上倾斜。
[0049]
如图3所示，转染复合物动态混合管13主要由外壳15与混合填料模块16组成。混合填料模块16为球形、立方体、长条形、异形等形状，为实心或多孔结构。
[0050]
高效拟动态转染管路1具有多种规格，需选择合适的型号的转染复合物动态混合管13和转染复合物拟静态孵育管14及流速，实现对转染复合物孵育时间进行精准控制。
[0051]
转染复合物拟静态孵育管14的流速可由公式计算得到：
[0052][0053]
其中：vf为转染复合物拟静态孵育管14的流速，流速范围需控制在0.4-10厘米/分
钟；lf为转染复合物拟静态孵育管14的长度；tf为转染复合物孵育时间，也即转染复合物在转染复合物拟静态孵育管14中的停留时间，转染复合物孵育时间通常设置为5-15分钟。
[0054]
转染复合物动态混合管13的流速可由公式计算得到：
[0055][0056]
其中：vf为转染复合物拟静态孵育管14的流速，sf为转染复合物拟静态孵育管14的内截面积，vh为转染复合物动态混合管13的流速，sh为转染复合物动态混合管13的内截面积。
[0057]
双通道泵送系统2的流量可由公式计算得到：
[0058][0059]
其中：q
p
为双通道泵送系统2的流量，vf为转染复合物拟静态孵育管14的流速，sf为转染复合物拟静态孵育管14的内截面积。
[0060]
控制器8内的软件中已预置高效拟动态转染管路1的参数，包括第一管路11与第二管路12的内径与长度、转染复合物动态混合管13的内径与长度、转染复合物拟静态孵育管14的内径与长度。通过输入所需的转染复合物孵育时间，控制器8将自动设置并控制双通道泵送系统2的流量。
[0061]
质粒复合物容器4放置于质粒复合物称重单元5上，质粒复合物称重单元5将测量数据传输至控制器8，控制器读8取数据并计算累计质粒复合物添加量；转染试剂复合物容器6放置于转染试剂复合物称重单元7上，转染试剂复合物称重单元7将测量数据传输至控制器8，控制器8读取数据并计算累计转染试剂复合物添加量。
[0062]
质粒复合物称重单元5和转染试剂复合物称重单元7不限于传统意义的天平，可以是具有称重功能的压力传感器等。
[0063]
双通道泵送系统2的核心驱动单元可以为蠕动泵、注射泵、离心泵等。
[0064]
如图4所示，在控制器8的控制软件内，依次选择内嵌的高效拟动态转染管路1型号，输入孵育时间(10分钟)及所需转染复合物总量(50l)，输入转染复合物拟静态孵育管14流速，软件自动计算所需双通道泵送系统2的流量计及工作时长，点击“运行”按键后系统将自动执行细胞转染程序。
[0065]
质粒复合物与转染试剂复合物在双通道泵送系统2的驱动下按照1:1的流量比例进入转染复合物动态混合管13，质粒复合物与转染试剂复合物在高流速与混合填料模块16扰流的作用下进行充分混合形成转染复合物，随后进入转染复合物拟静态孵育管14进行拟静态孵育。孵育10分钟后，转染复合物流动到转染复合物拟静态孵育管14顶部并流入反应器9中与细胞进行结合并完成细胞转染。
[0066]
待系统运行所需工作时长后系统自动停止，即完成细胞转染。
[0067]
规模化动静态在线细胞转染系统的应用，基于恒定转染复合物孵育时间、转染复合物拟静态孵育管14的流速，转染复合物动态混合管13的流速的原则进行规模放大。该系统可应用于多种形式反应器，包括搅拌式反应器(str)、波浪式反应器(wave)、一次性反应器等；可用于实验室规模、中试规模及生产规模的细胞转染工艺。
[0068]
转染试剂可以为磷酸钙、阳离子聚合物聚乙烯亚胺(pei)、脂质体
(lipofectamine3000、lipofiter)等。
[0069]
细胞转染包括悬浮cho细胞单质粒转染与双质粒转染，悬浮hek293细胞双质粒转染、三质粒转染、四质粒转染等。
[0070]
该系统可用于cho细胞转染生产重组蛋白，hek293细胞转染生产腺相关病毒载体及慢病毒载体。
[0071]
转染系统自动化程度高，可实现转染复合物的连续化孵育及流加至反应器9中，有效解决传统工艺将质粒复合物与转染试剂复合物在容器中混匀并静置孵育特定时间后通过管路加入至反应器中而无法规模化实施，转染复合物孵育时间波动大，工艺不稳定的问题。确保细胞转染工艺稳定可靠，易于实施及规模放大，可被用于规模化(1000l及以上规模)细胞转染。
[0072]
利用本发明的转染系统进行悬浮hek293细胞细胞转染生产腺相关病毒载体：
[0073]
采用hek293无血清培养基培养悬浮hek293细胞，培养体积为100l，初始细胞密度为0.5
×
106cells/ml。待细胞密度生长至3-4
×
106cells/ml时，补加100l的hek293无血清培养基至培养体积为200l。采用本发明的转染系统进行细胞转染，转染后继续培养3天后进行收获。通过检测，如图5所示，收获液中腺相关病毒产量可达到1
×
10
11
vg/ml，与常规方法实验室规模反应器工艺条件下产量一致，高于常规方法200l转染工艺产量。
[0074]
以上描述是对本发明的解释，不是对发明的限定，本发明所限定的范围参见权利要求，在本发明的保护范围之内，可以作任何形式的修改。

技术特征：
1.一种规模化动静态在线细胞转染系统，包括质粒复合物容器(4)、转染试剂复合物容器(6)和反应器(9)，其特征在于，还包括：高效拟动态转染管路(1)，其包括第一管路(11)、第二管路(12)、转染复合物动态混合管(13)和转染复合物拟静态孵育管(14)，转染复合物动态混合管(13)一端与转染复合物拟静态孵育管(14)连接，转染复合物动态混合管(13)另一端通过三通与第一管路(11)和第二管路(12)连接，第一管路(11)与质粒复合物容器(4)连接，第二管路(12)与转染试剂复合物容器(6)，转染复合物拟静态孵育管(14)与反应器(9)连接；双通道泵送系统(2)，其设置在第一管路(11)和第二管路(12)上；其中，转染复合物动态混合管(13)内设置有混合填料模块(16)，用于对质粒复合物与转染试剂复合物进行扰流混合形成转染复合物，转染复合物拟静态孵育管(14)和转染复合物动态混合管(13)之间具有夹角且向上倾斜，用于在转染复合物孵育特定时间后的流入反应器(9)中与细胞进行结合并完成细胞转染。2.如权利要求1所述的一种规模化动静态在线细胞转染系统，其特征在于：还包括非侵入式流量计(3)和控制器(8)，非侵入式流量计(3)设置在转染复合物拟静态孵育管(14)上；质粒复合物容器(4)放置在质粒复合物称重单元(5)上，转染试剂复合物容器(6)放置在转染试剂复合物称重单元(7)上，控制器(8)通过通讯线(10)与双通道泵送系统(2)、非侵入式流量计(3)、质粒复合物称重单元(5)和转染试剂复合物称重单元(7)连接。3.如权利要求1所述的一种规模化动静态在线细胞转染系统，其特征在于：所述质粒复合物容器(4)与转染试剂复合物容器(6)内均放置有磁力搅拌转子，质粒复合物容器(4)与转染试剂复合物容器(6)底部均设置有磁力搅拌器。4.如权利要求2所述的一种规模化动静态在线细胞转染系统，其特征在于：所述第一管路(11)和第二管路(12)的内径相同，转染复合物动态混合管(13)的内径大于等于第一管路(11)和第二管路(12)的内径，且小于转染复合物拟静态孵育管(14)的内径。5.如权利要求2所述的一种规模化动静态在线细胞转染系统，其特征在于：所述高效拟动态转染管路(1)通过辐照灭菌的形式进行预灭菌处理，使用无菌接管机或无菌快接头依次将第一管路(11)与质粒复合物容器(4)相连、第二管路(12)与转染试剂复合物容器(6)相连、转染复合物拟静态孵育管(14)与反应器(9)相连，形成闭合无菌管路。6.如权利要求1所述的一种规模化动静态在线细胞转染系统，其特征在于：所述转染复合物动态混合管(13)还包括外壳(15)，混合填料模块(16)设置在外壳(15)内。7.如权利要求4所述的一种规模化动静态在线细胞转染系统，其特征在于：所述转染复合物拟静态孵育管(14)的流速可由公式计算得到：其中：v
f
为转染复合物拟静态孵育管(14)的流速，流速范围需控制在0.4-10厘米/分钟；l
f
为转染复合物拟静态孵育管(14)的长度；t
f
为转染复合物孵育时间，也即转染复合物在转染复合物拟静态孵育管(14)中的停留时间，转染复合物孵育时间通常设置为5-15分钟。8.如权利要求7所述的一种规模化动静态在线细胞转染系统，其特征在于：所述转染复合物动态混合管(13)的流速可由公式计算得到：
其中：v
f
为转染复合物拟静态孵育管(14)的流速，s
f
为转染复合物拟静态孵育管(14)的内截面积，v
h
为转染复合物动态混合管(13)的流速，s
h
为转染复合物动态混合管(13)的内截面积。9.如权利要求8所述的一种规模化动静态在线细胞转染系统，其特征在于：所述双通道泵送系统(2)的流量可由公式计算得到：其中：q
p
为双通道泵送系统(2)的流量，v
f
为转染复合物拟静态孵育管(14)的流速，s
f
为转染复合物拟静态孵育管(14)的内截面积。10.如权利要求1-9任一项所述的一种规模化动静态在线细胞转染系统的应用，其特征在于：采用hek293无血清培养基培养悬浮hek293细胞，培养体积为100l，初始细胞密度为0.5
×
106cells/ml，待细胞密度生长至3-4
×
106cells/ml时，补加100l的hek293无血清培养基至培养体积为200l，采用上述转染系统进行细胞转染，转染后继续培养3天后进行收获。

技术总结
本发明涉及一种规模化动静态在线细胞转染系统及应用，包括质粒复合物容器、转染试剂复合物容器和反应器，还包括：高效拟动态转染管路；双通道泵送系统，其设置在第一管路和第二管路上；其中，转染复合物动态混合管内设置有混合填料模块，用于对质粒复合物与转染试剂复合物进行扰流混合形成转染复合物，转染复合物拟静态孵育管和转染复合物动态混合管之间具有夹角且向上倾斜，用于在转染复合物孵育特定时间后的流入反应器中与细胞进行结合并完成细胞转染。本发明转染复合物精准孵育与连续流加，使得转染复合物物理性质一致，简化规模化细胞转染工艺，提高转染效率，实现稳定的规模化细胞转染技术。模化细胞转染技术。模化细胞转染技术。


技术研发人员：聂简琪 孙杨 白仲虎 张燕 陈敬华
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.07.12
技术公布日：2023/9/7