一种微量福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的蛋白质组学分析方法

一种微量福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织的蛋白质组学分析方法
技术领域
1.本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种微量ffpe组织蛋白质组学前处理技术和质谱分析策略及其应用。


背景技术：

2.福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixation and paraffin-embedding,ffpe)组织是医院定期归档用于诊断目的的活检组织标本。ffpe组织可通过标准且常见方式来处理，稳定性良好，室温储存数年或数十年依旧能够保持病理分析的完整性。ffpe组织是一种十分经济的存档形式，因此在各医院及组织数据库中被普遍使用。ffpe样本为研究疾病的分子机制、疾病潜在生物标志物研究以及发现新的药物靶标提供了宝贵的样本资源库。ffpe标本病种繁多，数量巨大，到目前为止预计有上亿数量的各类疾病的ffpe组织样本被保存，其中蕴含了大量的临床数据，包括组织学报告、治疗结果和患者预后情况等。这些临床数据作为重要的回顾性诊断分析资源可用于疾病标志物的发现、表型的区分以及疾病的分子分型，如何将这些珍贵的样本转化为数字化资源是临床蛋白质组学近几年来研究的重点和热点。从2005年hood等人第一次利用ffpe组织样本进行蛋白质组学研究开始，陆续有应用ffpe组织样本进行蛋白质组学的研究报道，近几年应用ffpe组织样本开展临床蛋白质组学研究更是取得了突飞猛进的发展：2018年通过临床卵巢癌ffpe样本多维度蛋白组学研究发现并确定ct45是卵巢癌的化疗敏感性介质和免疫治疗靶点,2020年子宫内膜癌ffpe蛋白组学研究发现他莫昔芬暴露患者中stathmin(stmn1，又名oncoprotein 18)是子宫内膜癌的潜在标志物等，这些高水平的临床ffpe蛋白质组学研究为各类疾病的治疗靶标筛选、疾病诊断标志物的发现以及疾病分子分型等提供了重量级的科学依据。目前应用非标记定量蛋白质组学方法对ffpe组织样本进行高分辨质谱分析，单针质谱运行可提供2000-5000个蛋白质的定量信息，非常适合临床大队列ffpe组织样本分析。
3.ffpe样本制作过程中由于组织经过石蜡包埋，常规处理需要去除石蜡避免后续干扰质谱分析；另外由于甲醛的使用导致组织细胞中的蛋白质发生交联，固定时间越长蛋白质发生交联程度越大。这种交联反应使ffpe组织内蛋白质的检测和鉴定变得困难，因为交联限制了蛋白的提取效率，并可能导致质蛋白发生额外修饰并最终影响质谱鉴定，很长一段时间以来研究人员认为ffpe组织样本并不适合进入质谱分析。因此对微量ffpe组织开展科学研究存在着很大的技术壁垒，科学家们尝试改进各种实验条件进行蛋白提取，有研究用高温高压法进行蛋白提取，取得较好的实验结果。常规的蛋白质组学分析过程十分繁琐且需要不断更换实验容器，样品损失较大，微量样品很容易在处理过程中损失殆尽，无法进行后续研究；另外ffpe组织中蛋白的交联状态极大地影响蛋白的提取效率。目前常用的微量ffpe组织前处理方法包括：sp3方法(single-pot solid-phase-enhanced sample preparationprotocol,sp3)灵敏度高，非常适合微量样品的前处理，该方法对实验操作具有较高的要求，且成本高昂，适合实验室科研层面的操作，对于临床高通量的样本量而言并
不具备足够的成本优势；再如ist(in-stagetip)技术，ist微量样品处理试剂盒同样能够对1-100ug的微量样品进行处理，然而对单个肾小球或者更小的ffpe组织样品不一定适用，且试剂盒费用较高。


技术实现要素：

4.针对现有蛋白质组学分析技术存在的不足以及临床上对微量的ffpe样本进行研究与应用的迫切需求，本发明提供了微量ffpe样本的高效前处理方法及质谱分析策略，微量ffpe切片样品无需去除石蜡，不需要文献报道的高温高压条件，无需进行样品转移，一次性完成所有的蛋白质组学前处理步骤，再通过direct-dia(数据非依赖采集模式，data independent analysis，dia)质谱数据采集模式对其进行分析，实现对微量ffpe样本蛋白质组学的高效处理与深度、精确分析。
5.为了实现上述发明目的，本发明技术方案如下：
6.第一方面，本发明提供一种微量福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织样本的高效前处理方法，所述方法具体包括以下步骤：
7.1)取临床微量穿刺ffpe组织切片样品，显微镜下观察并拍照，然后使用刮刀将样品刮至ep管内；
8.2)样品中加入高效蛋白裂解液(溶液成分：20mm tris hcl，4％sds,200mm dtt,20％glycerol,1％protease,ph 8.0)，恒温金属浴加热，充分提取蛋白并进行蛋白的解交联；
9.3)蛋白提取结束后加入碘乙酰胺(iaa)溶液进行烷基化反应，避光反应；
10.4)反应结束后加入预冷丙酮，放置在冰箱过夜，第二天进行丙酮清洗，然后将蛋白沉淀在通风柜内吹干；
11.5)加入测序级胰蛋白酶，放在恒温震荡仪上，400rpm，37℃过夜(12～18小时)；
12.6)酶解反应结束后将上清溶液全部蒸干，使用c18柱除盐，将除盐后的洗脱液全部蒸干，用质谱进样溶液复溶，离心，即可进入质谱分析。
13.进一步地，步骤1中所述的ffpe样品选自临床肾穿刺ffpe切片样本。
14.进一步地，步骤2中所述的高效蛋白裂解液的加入量为20～40ul，所述的恒温金属浴加热的时间为1-2小时，恒温金属浴加热的温度为80～100℃。
15.进一步地，步骤3中所述的避光反应的时间为30～45分钟。
16.进一步地，步骤4中所述的加入预冷丙酮的体积为3～5倍步骤3反应液的体积。
17.进一步地，步骤5中所述的胰蛋白酶加入量为0.5～1μg。
18.进一步地，步骤6中所述的离心过程为10000～12000
×
g离心10～15分钟。
19.进一步地，所述的前处理方法具体包括以下步骤：
20.1)取临床微量肾穿刺ffpe样品，使用显微镜观察微量切片上肾小球的数量，然后将样品刮至ep管内；
21.2)样品中加入20～40μl高效蛋白裂解液(溶液成分：20mm tris hcl，4％sds，200mm dtt，20％glycerol，1％protease，ph 8.0)，恒温金属浴100℃加热1～2小时，充分提取蛋白并进行蛋白的解交联；
22.3)蛋白提取结束后加入1m碘乙酰胺(iaa)溶液进行烷基化反应，iaa终浓度为
55mm，避光反应30～45分钟；
23.4)反应结束后加入3～5倍体积的预冷丙酮，放置在-20℃冰箱过夜，第二天进行丙酮清洗，然后将蛋白沉淀在通风柜内吹干；
24.5)加入测序级胰蛋白酶0.5～1μg，放在恒温震荡仪上，400rpm，37℃过夜(12～18小时)进行酶解反应；
25.6)酶解反应结束后将上清溶液全部蒸干，使用c18柱除盐，将除盐后的洗脱液全部蒸干，用质谱进样溶液复溶，10000～12000
×
g离心10～15分钟，即可上样进入质谱分析。
26.第二方面，本发明提供一种微量福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织的蛋白质组学的质谱分析方法，具体方法包括：
27.1)前处理得到的肽段溶液通过用纳升级液相色谱仪进行色谱分离：将前处理后的待测样品加载到分析柱上，c18填料，控制柱流速与柱温，流动相a为5％乙腈-0.1％甲酸水溶液，流动相b为80％乙腈的0.1％甲酸水溶液；以5％缓冲液b(80％acn，0.1％fa)起始进行110min的梯度分离；
28.2)分离完成通过orbitrap exploris 480进行质谱进样(该质谱配套easy-nano lc 1200液相系统及faims系统)：电喷雾电压2kv，diams2分辨率：120,000，agc target：3e6，maximum injection time：20ms；可变窗口的宽度为30m/z(质量范围m/z 350-408内开2个窗口)，10m/z(质量范围m/z 408-795有43个窗口)，20m/z(质量范围m/z 795-985有11个窗口)以及50m/z(质量范围m/z 985-1200有4个窗口)，一次全面扫描后，20个窗口的分辨率为30,000，agc target：1e6，碰撞能量分别为27、30和33，选择-45v和-65v的补偿电压(cv)应用于二级扫描和相应的测量扫描。
29.进一步地，所述待测样品的加入量为1～5μl，优选为2μl。
30.进一步地，所述分析柱的柱长为25cm，柱内径为75μm，c18填料粒径为1.9μm，分析柱优选为dr.maisch gmbh,germany。
31.进一步地，所述的梯度分离的过程包括：在99分钟内缓冲液b比例逐步增加至20％；5分钟内缓冲液b比例增加至32％；1分钟内缓冲液b比例增加至80％并保持5分钟。
32.进一步地，所述的柱流速控制在250nl/min，柱温控制在55℃。
33.更近一步地，所述的微量福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织的蛋白质组学的分析方法包括：
34.1)前处理方法得到的肽段溶液，通过纳升级液相色谱仪进行色谱分离，将2μl样品加载到分析柱上，柱长为25cm，柱内径为75μm，c18填料粒径为1.9μm(dr.maisch gmbh,germany)；流动相a为5％乙腈-0.1％甲酸水溶液，流动相b为80％乙腈的0.1％甲酸水溶液；以6％缓冲液b(80％acn，0.1％fa)起始进行110min的梯度分离；在99分钟内缓冲液b比例逐步增加至20％；5分钟内缓冲液b比例增加至32％；1分钟内缓冲液b比例增加至80％并保持5分钟；柱流速250nl/min，柱温55℃；
35.2)通过orbitrap exploris 480进行质谱进样(该质谱配套easy-nano lc 1200液相系统及faims系统)：电喷雾电压2kv；diams2分辨率：120,000，agc target：3e6，maximum injection time：20ms。可变窗口的宽度为30m/z(质量范围m/z 350-408内开2个窗口)，10m/z(质量范围m/z 408-795有43个窗口)，20m/z(质量范围m/z 795-985有11个窗口)以及50m/z(质量范围m/z 985-1200有4个窗口)。一次全面扫描后，20个窗口的分辨率为30,000，
agc target：1e6，碰撞能量分别为27,30和33。选择-45v和-65v的补偿电压(cv)应用于二级扫描和相应的测量扫描。
36.与现有技术相比，本发明具有如下效果：
37.首先，本发明提供了一种微量ffpe组织样本的高效前处理方法，所述处理方法中ffpe样本无需去石蜡，在一个实验容器中即可完成所有的前处理步骤不需要转移样品，也不需要高温高压方式，实验室常规的恒温金属浴即可完成；
38.其次，本发明提供一种微量福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织的蛋白质组学的分析方法(microap-ddia)，所述分析方法操作简便、准确率高、重现性好；
39.最后，ffpe组织脱蜡步骤及高温高压法对于常规ffpe组织样本能够提升蛋白提取效率，但操作较为繁琐耗时，且对于微量样品而言微量组织样品操作容易损失，而本技术方案中对于微量的ffpe样本的不脱蜡处理并未影响最终的蛋白鉴定数量的准确性，相对于现有的sp3法及ist法操作繁琐、耗时、成本较高的弊端，本发明处理方法成本低且操作简便。micro ap方法更简单、易操作，且ffpe样本经过甲醛固定产生的非特异性修饰比率，与现有技术效果相当，因此本发明使用microap-ddia方法进行微量ffpe样本的分析具有较高的临床应用价值。另外数据非依赖采集模式(data independent analysis，dia)技术最早在2000年提出，2012年dia-swath(sequential window acquisition of all theoretical spectra)新技术的出现又进一步拓展了dia蛋白定量的深度。dia技术具有通量高、重现性好、定量精准等优点已成为当下定量蛋白质组学最热门的技术之一。而direct dia技术用于定量蛋白组学的分析，该方法既保持了dia方法的定量优势又提高了鉴定效率。对于临床大队列样本检测而言，ddia质谱方法更具有优势。
附图说明
40.图1.临床肾穿刺ffpe组织及单个肾小球ffpe组织图片，a：临床肾穿刺组织he染色后在显微镜下放大100倍后肾小球形态及个数；b：经过lmd显微切割后的单个肾小球(未染色)及其在显微镜放大100倍后的形态。
41.图2.分别使用三种方法(micro-ap法、sp3法及ist法)对微量穿刺ffpe样本进行分析，三种方法的结果评价(de：脱蜡，node：不脱蜡，ac：丙酮沉淀法，hthp:high temperature highpressure,高温高压法)，a：ddia采集模式获得的蛋白鉴定数量；b：ddia采集模式获得的肽段鉴定数量；c：ddia采集模式获得的前体离子鉴定数量；d：3种方法ffpe样品由于甲醛固定引起的特异性修饰比率对比，特异性修饰包括formylation,k,n-term；hydroxylation,dknpry；formylation,proteinn-term；hydroxymethyl,n。
42.图3.单个肾小球蛋白组学分析结果，a、b：单独一个肾小球ffpe组织通过本发明方法进行分析后获得的蛋白及肽段鉴定数量；c：肾小球内特异性表达的两个蛋白nphs1和nphs2，在单个肾小球ffpe组织蛋白组学结果中的分布。
具体实施方式
43.下面将以具体实施例的方式对本技术作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本技术的技术内容，以下的实施例的目的是便于本领域技术人员更好地理解本技术，但并不用来限制本技术的范围。
44.实施例1单个肾小球的蛋白质组学样品前处理及质谱分析方法
45.前处理：
46.1)临床组织病理切片，先进行he染色，然后在显微镜下拍摄组织形态图片(结果见图a)；临床微量ffpe样品的精准取样以单个肾小球蛋白组学为例，使用激光显微切割技术(laser capture microdissection,lcm)对肾组织切片进行单个肾小球样品分离，显微镜下观察形态，将单个肾小球放入1.5ml ep管内(结果见图b)；
47.2)微量ffpe组织蛋白提取，加入20μl高效蛋白裂解液(溶液成分20mm tris hcl，4％sds,200mm dtt,20％glycerol,1％protease,ph 8.0)，恒温金属浴100℃加热1小时，充分提取蛋白并进行蛋白的解交联；
48.3)蛋白提取结束后加入1m碘乙酰胺(iaa)溶液进行烷基化反应，iaa终浓度为55mm，避光反应30分钟；
49.4)反应结束后加入5倍体积的预冷丙酮，放置在-20℃冰箱过夜，第二天进行丙酮清洗，然后将蛋白沉淀在通风柜内吹干；
50.5)加入测序级胰蛋白酶1μg，放在恒温震荡仪上，400rpm，37℃过夜(12～18小时)进行酶解反应；
51.6)酶解反应结束后将上清溶液全部蒸干，使用c18柱除盐，将除盐后的洗脱液全部蒸干，用质谱进样溶液复溶，12000*g离心15分钟，进入质谱分析。
52.质谱分析：
53.前处理得到的肽段溶液通过纳升级液相色谱仪进行色谱分离，orbitrap exploris 480进行质谱进样。该质谱配套easy-nano lc 1200液相系统及faims系统。将2μl样品加载到分析柱上，柱长为25cm，柱内径为75μm，c18填料粒径为1.9μm(dr.maisch gmbh,germany)。流动相a为5％乙腈-0.1％甲酸水溶液，流动相b为80％乙腈的0.1％甲酸水溶液。以6％缓冲液b(80％acn，0.1％fa)起始进行110min的梯度分离。在99分钟内缓冲液b比例逐步增加至20％；5分钟内缓冲液b比例增加至32％；1分钟内缓冲液b比例增加至80％并保持5分钟。柱流速250nl/min，柱温55℃。电喷雾电压2kv。diams2分辨率：120,000，agc target：3e6，maximum injection time：20ms。可变窗口的宽度为30m/z(质量范围m/z 350～408内开2个窗口)，10m/z(质量范围m/z408～795有43个窗口)，20m/z(质量范围m/z 795～985有11个窗口)以及50m/z(质量范围m/z 985～1200有4个窗口)。一次全面扫描后，20个窗口的分辨率为30,000，agc target：1e6，碰撞能量分别为27、30和33。选择-45v和-65v的补偿电压(cv)应用于二级扫描和相应的测量扫描。
54.数据搜库分析方法：
55.质谱谱图分别使用spectronaut 14软件(biognosysag,switzerland)进行处理和分析(结果见图2和图3)。在默认参数内，通过人的uniprot fasta数据库(2023年3月5日下载)进行搜索。具体参数设置：允许胰蛋白酶具有2个特异性漏切位点，将半胱氨酸的氨甲酰甲基化指定为固定修饰，甲硫氨酸的氧化作为可变修饰。保留时间预测类型设置为动态irt。数据提取由spectronaut软件根据质量校准确定。spectronaut软件将根据irt校准和梯度稳定性动态确定理想的提取窗口。前体离子和蛋白质水平的p值(fdr)设置为1％，标准化策略设置为全局标准化。使用超过1％p值的前3个过滤肽平均值来计算主要组数量。单因素方差分析后，当p值《0.05，绝对倍数变化》1.5时，定义为差异表达蛋白。
56.实施例2微量ffpe样本丙酮沉淀(microap)脱蜡前处理
57.1、样品分为脱蜡和不脱蜡组，每组3重复，需要脱蜡的样品中加入500ml正庚烷，剧烈涡旋10s室温放置1小时，加入50μl甲醇，9000*g离心2分钟，去上清，组织沉淀在通风柜内吹干。视组织脱蜡程度决定是否需要二次脱蜡；
58.2、加入20μl高效蛋白裂解液(溶液成分：20mm tris hcl，4％sds,200mm dtt,20％glycerol,1％protease,ph 8.0)，恒温金属浴100℃加热1小时或者高温高压(high temperature highpressure,hthp)5分钟，进行蛋白的解交联，并充分提取蛋白；
59.3、蛋白提取结束后，加入1m碘乙酰胺(iaa)溶液进行烷基化反应，iaa终浓度为55mm，避光反应30分钟；
60.4、反应结束后加入5倍体积的预冷丙酮，放置在-20℃冰箱过夜，第二天进行丙酮清洗，蛋白沉淀在通风柜内吹干；
61.5、加入测序级胰蛋白酶1μg，放在恒温震荡仪上，400rpm，37℃过夜(12～18小时)；
62.6、酶解反应结束后将上清溶液全部蒸干，使用c18柱除盐，将除盐后的洗脱液全部蒸干，用质谱进样溶液复溶，12000*g离心15分钟后上样进入质谱分析。
63.实施例3微量ffpe样本sp3法前处理
64.1、样品分为脱蜡和不脱蜡组，每组3重复，需要脱蜡的样品中加入500ml正庚烷，剧烈涡旋10s后室温放置1小时，加入50μl甲醇，9000*g离心2分钟，去上清，组织沉淀在通风柜内吹干。视组织脱蜡程度决定是否需要二次脱蜡；
65.2、加入20μl高效蛋白裂解液(溶液成分20mm tris hcl，4％sds,200mm dtt,20％glycerol,1％protease,ph 8.0)，恒温金属浴100℃加热1小时或者高温高压(hthp)5分钟，充分提取蛋白并进行蛋白的解交联；
66.3、加入1m碘乙酰胺(iaa)溶液进行烷基化反应，iaa终浓度为55mm，避光反应40分钟；
67.4、反应结束后向溶液中加入sp3 beads(hydrophilic andhydrophobic seramag carboxylate-modified beads,ge life sciences,marlborough,ma)混悬液2μl(sp3beads浓度为50mg/ml,使用前用500μl超纯水清洗3次)，加入100％乙腈50μl,室温，恒温震荡仪300rpm孵育10分钟；
68.5、孵育结束后将样品管放置在磁力架上，弃上清；
69.6、使用70％乙醇溶液清洗2次，弃上清；100％乙腈清洗一次，弃上清。最后将beads在空气中干燥；
70.7、向干燥的beads中加入50mm碳酸氢铵溶液20μl，加入胰蛋白酶trypsin1μg，水浴超声，将管壁上的beads超下，恒温震荡仪，37
°
，800rpm酶解12～18h；
71.8、酶解结束后，向样品中加入100％乙腈，使乙腈浓度为95％，恒温震荡仪，室温，300rpm孵育10分钟；
72.9、孵育结束后将样品管放置在磁力架上2分钟，弃上清；
73.10、100％乙腈清洗两次，弃上清；
74.11、使用10μl的5％dmso水溶液洗脱肽段，12000*g离心15分钟，吸取上清，进入质谱分析。
75.实施例4微量ffpe样本ist法前处理
76.1、样品分为脱蜡和不脱蜡组，每组3重复，需要脱蜡的样品中加入500ml正庚烷，剧烈涡旋10s室温放置1小时，加入50μl甲醇，9000
×
g离心2分钟，去上清，组织沉淀在通风柜内吹干。视组织脱蜡程度决定是否需要二次脱蜡；
77.2、按说明向ffpe样品中加入裂解液，95℃加热10min或者高温高压(hthp)5分钟，完成裂解及还原烷基化；
78.3、冷却后加入酶解液，37℃反应60min；
79.4、酶解反应结束后，使用配套的纯化柱，对样品进行除盐纯化；
80.5、将纯化好的肽段溶液12000*g离心15分钟，进入质谱分析。
81.实施例2-4的质谱分析方法及数据搜库分析方法
82.实施例2-4中三种前处理方法得到的肽段溶液，通过纳升级液相色谱仪进行色谱分离，orbitrap exploris 480进行质谱进样。该质谱配套easy-nano lc 1200液相系统及faims系统。将2μl样品加载到分析柱上，柱长为25cm，柱内径为75μm，c18填料粒径为1.9μm(dr.maisch gmbh,germany)。流动相a为5％乙腈-0.1％甲酸水溶液，流动相b为80％乙腈的0.1％甲酸水溶液。以6％缓冲液b(80％acn，0.1％fa)起始进行110min的梯度分离。在99分钟内缓冲液b比例逐步增加至20％；5分钟内缓冲液b比例增加至32％；1分钟内缓冲液b比例增加至80％并保持5分钟。柱流速250nl/min，柱温55℃。电喷雾电压2kv。diams2分辨率：120,000，agc target：3e6，maximum injection time：20ms。可变窗口的宽度为30m/z(质量范围m/z 350-408内开2个窗口)，10m/z(质量范围m/z 408-795有43个窗口)，20m/z(质量范围m/z 795-985有11个窗口)以及50m/z(质量范围m/z 985-1200有4个窗口)。一次全面扫描后，20个窗口的分辨率为30,000，agc target：1e6，碰撞能量分别为27,30和33。选择-45v和-65v的补偿电压(cv)应用于二级扫描和相应的测量扫描。
83.质谱谱图分别使用spectronaut 14软件(biognosysag,switzerland)进行处理和分析(结果见图2和图3)。在默认参数内，通过人的uniprot fasta数据库(2023年3月5日下载)进行搜索。具体参数设置：允许胰蛋白酶具有2个特异性漏切位点，将半胱氨酸的氨甲酰甲基化指定为固定修饰，甲硫氨酸的氧化作为可变修饰。保留时间预测类型设置为动态irt。数据提取由spectronaut软件根据质量校准确定。spectronaut软件将根据irt校准和梯度稳定性动态确定理想的提取窗口。前体离子和蛋白质水平的p值(fdr)设置为1％，标准化策略设置为全局标准化。使用超过1％p值的前3个过滤肽平均值来计算主要组数量。单因素方差分析后，当p值《0.05，绝对倍数变化》1.5时，定义为差异表达蛋白。
84.从3种不同的前处理方法来看，1、ffpe组织脱蜡步骤较为繁琐耗时，且易于损失微量组织样品，对于微量的ffpe样本，不脱蜡并不影响最终的蛋白鉴定数量(图2a，de和node的结果进行比较)，同时高温高压法在微量ffpe样本中作用有限，不必使用；2、sp3法操作最为繁琐、耗时，另外sp3和ist法成本较高，本发明方法成本低且操作简便；3、实验结果如图2所示，三种方法鉴定到的蛋白数量差异并不大(图2a)，而肽段和前体离子数量上，ist法明显不如另外两种方法(图2b、c)，因此从定量角度来说，microap方法更简单、易操作；4、ffpe样本经过甲醛固定产生的非特异性修饰比率，在三种方法中的差异并不大(图2d)，因此本发明适用microap-ddia方法进行微量ffpe样本的分析。

技术特征：
1.一种微量ffpe组织样本的高效前处理方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：1)取临床微量ffpe组织切片样品，显微镜下观察并拍照，然后使用刮刀将样品刮至ep管内；2)样品中加入高效蛋白裂解液(溶液成分：20mmtrishcl，4％sds,200mm dtt,20％glycerol,1％protease,ph8.0)，恒温金属浴加热，充分提取蛋白并进行蛋白的解交联；3)蛋白提取结束后加入碘乙酰胺(iaa)溶液进行烷基化反应，避光反应；4)反应结束后加入预冷丙酮，放置在冰箱过夜，第二天进行丙酮清洗，然后将蛋白沉淀在通风柜内吹干；5)加入测序级胰蛋白酶，放在恒温震荡仪上，400rpm，37℃过夜(12～18小时)；6)酶解反应结束后将上清溶液全部蒸干，使用c18柱除盐，将除盐后的洗脱液全部蒸干，用质谱进样溶液复溶，离心，即可上样进入质谱分析。2.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤2中所述的高效蛋白裂解液的加入量为20～40ul，所述的恒温金属浴加热的时间为1～2小时，恒温金属浴加热的温度为80～100℃。3.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤3中所述的避光反应的时间为30～45分钟；步骤4中所述的加入预冷丙酮的体积为步骤3反应液的体积的3～5倍。4.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤5中所述的胰蛋白酶加入量为0.5～1μg。5.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤6中所述的离心过程为10000～12000
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g离心10～15分钟。6.一种微量福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织的蛋白质组学microap-ddia分析方法，其特征在于，具体方法包括：1)前处理得到的肽段溶液通过用纳升级液相色谱仪进行色谱分离：将前处理后的待测样品加载到分析柱上，c18填料，控制柱流速与柱温，流动相a为5％乙腈-0.1％甲酸水溶液，流动相b为80％乙腈的0.1％甲酸水溶液；以5％缓冲液b(80％acn，0.1％fa)起始进行110min的梯度分离；2)分离完成通过orbitrapexploris480进行质谱进样(该质谱配套easy-nano lc1200液相系统及faims系统)：电喷雾电压2kv，diams2分辨率：120,000，agctarget：3e6，maximuminjectiontime：20ms；可变窗口的宽度为30m/z(质量范围m/z350-408内开2个窗口)，10m/z(质量范围m/z408-795有43个窗口)，20m/z(质量范围m/z795-985有11个窗口)以及50m/z(质量范围m/z985-1200有4个窗口)，一次全面扫描后，20个窗口的分辨率为30,000，agctarget：1e6，碰撞能量分别为27、30和33，选择-45v和-65v的补偿电压(cv)应用于二级扫描和相应的测量扫描。7.如权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述待测样品的加入量为1～5μl。8.如权利要求6所述的分析方法，其特征在于，步骤1中所述分析柱的柱长为25cm，柱内径为75μm，c18填料粒径为1.9μm。9.如权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述的梯度分离的梯度设置包括：在99分钟内缓冲液b比例逐步增加至20％；5分钟内缓冲液b比例增加至32％；1分钟内缓冲液b比
例增加至80％并保持5分钟。10.如权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述的柱流速控制在250nl/min，柱温控制在55℃。

技术总结
本发明提供了一种微量FFPE组织蛋白质组学前处理技术及质谱分析策略，该技术采用微量FFPE样品丙酮沉淀(MicroAP)前处理方法：本方法无需脱石蜡，在同一容器中依次进行蛋白去交联及提取、蛋白的还原烷基化反应、酶解、除盐等一系列前处理过程，最后将肽段注入质谱通过DirectDIA的质谱数据采集模式进行分析。本发明能够为微量的FFPE组织(如单个肾小球)进行蛋白质组学研究提供可行的技术支撑，应用本发明的前处理方法和结合DirectDIA质谱分析策略，从单个肾小球FFPE组织中可成功鉴定到约3000个蛋白，有效提高临床各类微量FFPE组织样本的利用率，保障临床蛋白质组学研究的顺利开展，本发明方法优于现有的检测技术，且实验成本低、操作更简便。操作更简便。操作更简便。


技术研发人员：孟丽媛 潘晓霞 夏雯雯 周立 夏立 孟爽
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/9/7